袁華根， 安 東， 徐亞亞， 高 峰

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇南京 210095)

-酮戊二酸(AKG)是谷氨酸和谷氨酰胺的前體物質(zhì)。大量研究表明，AKG在機體與組織的蛋白質(zhì)合成中起著重要作用，具有促進動物生長、維持腸道屏障完整及增強機體抗氧化能力與免疫能力等功能，其機理是谷氨酸可作為編碼氨基酸調(diào)控蛋白質(zhì)合成，促進動物體組織器官的生長發(fā)育。同時，-谷氨酸又可作為谷氨酰胺的前體物質(zhì)。谷氨酰胺既能作為構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸，又能參與核酸和糖蛋白的合成，同時具有維持體內(nèi)酸堿平衡、保持小腸黏膜正常的結(jié)構(gòu)和功能、增強免疫機能等功能。目前，大多數(shù)有關(guān)AKG的研究均采用化學(xué)合成法生產(chǎn)的AKG作為添加劑，而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)出的AKG相比于化學(xué)合成的AKG具有生產(chǎn)成本低、合成過程安全、環(huán)保等優(yōu)點。本試驗以AA白羽肉雞為試驗對象，研究日糧添加生物發(fā)酵法生產(chǎn)的AKG制劑對肉雞生長性能及對肉雞養(yǎng)分表觀消化率、組織器官發(fā)育、胰腺消化酶活性及血液指標的影響，為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的AKG在生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年在江蘇省南京市康欣禽業(yè)有限公司青龍山雞場進行；試驗動物為愛拔益加(Arbor Acres，AA)1日齡雛雞，由南京康欣禽業(yè)有限公司提供；α-酮戊二酸制劑(AKG，有效含量293 g/kg)，由江蘇省宜興協(xié)聯(lián)生物化學(xué)有限公司研發(fā)中心提供。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗采取單因素試驗設(shè)計，選取192羽體質(zhì)量無顯著差異的健康1日齡AA肉仔雞，隨機分為4個處理，其中，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，處理組是在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上分別添加0.2%、0.4%、0.8%的AKG制劑，基礎(chǔ)日糧參照NRC(1994)進行配制。每個處理6個重復(fù)，每重復(fù)8羽雞。試驗期為42 d。肉仔雞的飼養(yǎng)按《AA肉雞飼養(yǎng)管理手冊》進行，雙層籠養(yǎng)，自由采食和飲水，自然光照加白熾燈補光，光照度為30 lx，1～7 d每天光照24 h，8 d后每天光—暗周期為23 h—1 h。第1周室溫控制在32～34 ℃，然后每周降低2～3 ℃，21 d時室溫約為 22 ℃。按常規(guī)的肉仔雞免疫程序進行免疫。

1.3 樣品采集

在飼養(yǎng)試驗21 d和42 d，每個重復(fù)中隨機挑選2羽體質(zhì)量接近于該重復(fù)平均體質(zhì)量的肉雞，進行屠宰采樣。頸靜動脈放血于2支干凈10 mL離心管中(1支加入抗凝劑1支不加)，4 ℃，3 000 r/min 離心10 min，取上清液分裝于-20 ℃冰箱中保存待測。然后將上述處死的肉雞完整剝離肌胃、腺胃、胸腺、脾臟、肝臟、胰腺、法氏囊，并剔除筋膜和毗鄰脂肪組織，再用濾紙吸干血水后稱質(zhì)量并記錄；在碎冰上分離收集十二指腸(U形彎曲段)、空腸和回腸(至回盲連結(jié)處)等消化器官，然后剔除筋膜和毗鄰脂肪組織并清除內(nèi)容物，再用濾紙吸干血水后分別稱質(zhì)量并記錄。

1.4 指標測定與方法

1.4.1 生長性能測定 按重復(fù)分別在21、42 d早晨飼喂前空腹稱質(zhì)量、結(jié)料，并計算平均日增質(zhì)量(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料質(zhì)量比(F/G)。

1.4.2 養(yǎng)分表觀代謝率的測定 18日齡和39日齡時連續(xù)收集3 d糞便，糞樣收集后裝入塑料袋中，封口儲存于-20 ℃冰箱內(nèi)。同一重復(fù)的糞樣解凍后立即混勻，于65 ℃干燥箱內(nèi)干燥24 h，放置室溫回潮24 h，粉碎后制成風(fēng)干樣品，用于養(yǎng)分測定。養(yǎng)分表觀代謝率測定采用內(nèi)源指示劑法(酸不溶灰分法，AIA)。測定飼料及糞樣的粗脂肪、粗蛋白、粗灰分、干物質(zhì)的含量。采用乙醚浸提法測定粗脂肪含量，凱氏定氮法測定粗蛋白的含量。計算粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、干物質(zhì)的表觀代謝率。

1.4.3 器官的相對質(zhì)量和相對長度 各個器官的相對質(zhì)量的計算方法為器官絕對質(zhì)量(g)與體質(zhì)量(kg)的比值；腸道各段的相對長度的計算方法為腸道絕對長度(cm)與體質(zhì)量(kg)的比值。

1.4.4 胰腺消化酶活性測定 采用M124A型電子分析天平準確稱取胰腺樣品0.3 g置于10 mL離心管中，向離心管中加入2.7 mL預(yù)冷的0.75%生理鹽水，在冰浴的情況下采用PRO 200勻漿機 2 500 r/min 進行勻漿。然后采用高速冷凍離心機 3 000 r/min 離心10 min，取上清液得到10%組織勻漿液，分裝于-20 ℃冰箱待測。采用南京建成生物工程研究所的試劑盒分別測定胰腺中淀粉酶活力、脂肪酶活力和胰蛋白酶活力，測定方法嚴格按照試劑盒使用說明書進行。樣品蛋白含量使用南京建成生物工程研究所的考馬斯亮藍試劑盒進行測定。

1.4.5 血清生化指標以及血漿激素水平的測定 血清中的葡萄糖(GLU)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白、白蛋白、尿酸(UA)、堿性磷酸酶(AKP)采用試劑盒測定，測定步驟按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行。

血漿中胰島素(INS)、胰高血糖素(GC)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)采用酶聯(lián)免疫法測定，試劑盒均購自南京晚晴化玻儀器公司。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧添加AKG制劑對肉雞生長性能的影響

由表1可知，1～21 d中，0.2% AKG、0.4% AKG、0.8%AKG組平均日增質(zhì)量均顯著高于對照組(<0.05)。21～42 d中，對照組F/G顯著高于0.8% AKG組(<0.05)。1～42 d，對照組F/G顯著高于0.8% AKG組(<0.05)。1～21 d中，ADFI、F/G結(jié)果差異均不顯著。21～42 d和1～42 d，ADG、ADFI結(jié)果差異均不顯著。

表1 AKG制劑對肉雞生長性能的影響

2.2 日糧添加AKG制劑對肉雞表觀代謝率的影響

由表2可知，18～20 d中，0.2% AKG、0.4% AKG、0.8% AKG組粗蛋白CP、粗灰分ASH、干物質(zhì)DM表觀代謝率均顯著高于對照組(<0.05)。39～41 d中，0.8% AKG組粗脂肪EE表觀代謝率顯著高于對照組(<0.05)；0.4% AKG組粗灰分ASH、干物質(zhì)DM表觀代謝率顯著高于對照組(<0.05)。18～20 d中，粗脂肪EE表觀代謝率結(jié)果差異不顯著，39～41 d，粗蛋白CP表觀代謝率結(jié)果差異不顯著。

表2 AKG制劑對肉雞養(yǎng)分表觀代謝率的影響

2.3 日糧添加AKG制劑對肉雞器官發(fā)育的影響

2.3.1 日糧添加AKG制劑對肉雞腸道相對長度的影響 由表3可知，21 d 0.8% AKG組空腸相對長度顯著高于0.2% AKG和對照組(<0.05)。21 d十二指腸、回腸相對長度結(jié)果差異均不顯著，42 d十二指腸、空腸、回腸相對長度結(jié)果差異均不顯著。

表3 AKG制劑對肉雞腸道相對長度的影響

2.3.2 日糧添加AKG對肉雞器官相對質(zhì)量的影響 由表4可知，21 d時，日糧添加AKG制劑對于肉雞器官相對質(zhì)量均無顯著影響。42 d時，0.2% AKG、0.4% AKG、0.8%AKG組肌胃相對質(zhì)量均顯著高于對照組(<0.05)；0.2% AKG與0.8% AKG組空腸相對質(zhì)量顯著高于對照組(<0.05)；0.4%、0.8% AKG組回腸相對質(zhì)量顯著高于對照組和0.2% AKG組(<0.05)，其他結(jié)果差異均不顯著。

表4 AKG制劑對肉雞器官相對質(zhì)量的影響

2.4 日糧添加AKG制劑對肉雞胰腺消化酶活性的影響

由表5可知，42 d時，0.2%、0.4%、0.8% AKG組胰蛋白酶活性顯著高于對照組(<0.05)；其他結(jié)果差異均不顯著。

表5 AKG制劑對肉雞胰淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活力的影響

2.5 日糧添加AKG制劑對肉雞血清生化指標以及血液激素水平的影響

由表6可知，21 d時，0.8% AKG組血清中血糖含量顯著高于對照組(<0.05)。42 d時，0.2% AKG、0.8% AKG組血清中血糖含量顯著高于對照組(<0.05)；0.4%、0.8% AKG組血清堿性磷酸酶活性顯著低于對照組(<0.05)；其他結(jié)果差異均不顯著。

表6 AKG制劑對肉雞血清生化指標的影響

由表7可知，與對照組相比，21 d和42 d的0.2%、0.4%、0.8% AKG組的胰島素、胰高血糖素、T3和T4等血液激素指標無顯著差異。

表7 AKG制劑對肉雞血液激素指標的影響

3 討論

3.1 日糧添加AKG制劑對肉雞生長性能的影響

已有研究表明，日糧添加AKG可提高畜禽的生長性能，余親平等研究表明，0.7% AKG日糧可顯著提高肉雞1～2周齡的平均日增質(zhì)量，并且0.7% AKG添加量促生長效果比添加同等劑量的谷氨酰胺效果更好，但對后期生長性能無明顯作用；胡泉舟等研究表明，在日糧添加1% AKG能夠提高仔豬日增質(zhì)量等生長性能。本試驗中，在1～21 d，日糧添加0.2% AKG、0.4% AKG、0.8% AKG可顯著提高肉雞的平均日增質(zhì)量，結(jié)果與余親平等的研究一致。在21～42 d，日糧添加0.8% AKG可顯著降低料質(zhì)量比，提高飼料利用率。在1～42 d中，日糧添加0.8% AKG可顯著降低料質(zhì)量比，提高飼料利用率。研究表明，AKG可參與機體內(nèi)的三羧酸循環(huán)為機體提供能量，也可合成谷氨酸、脯氨酸及谷氨酰胺等，其中，谷氨酰胺可作為生物體內(nèi)所有細胞的能量來源，尤其是在胃腸道細胞中谷氨酰胺更是重要的能量來源。AKG還可通過谷氨酸增加脯氨酸殘基池促進膠原蛋白合成，約25%外源AKG在腸上皮細胞中轉(zhuǎn)化為脯氨酸，而脯氨酸是膠原蛋白的主要合成底物，在膠原蛋白代謝中起核心作用。此外，有研究報道，AKG可顯著增加血液中胰島素(Insulin)、生長激素(GH)和胰島素樣生長因子(IGF-1)等激素的水平。因此，日糧添加AKG提升動物生長性能的主要原因可能是由于在小腸前段被迅速吸收為腸道細胞供能，合成谷氨酸、脯氨酸等必需氨基酸促進機體蛋白合成及早期骨骼生長，提升血液生長激素水平促進肉雞生長。

3.2 日糧添加AKG制劑對肉雞表觀代謝率的影響

養(yǎng)分表觀代謝率是衡量畜禽對于飼料的消化吸收能力的主要指標，畜禽對于養(yǎng)分的消化代謝吸收能力越強就越有利于畜禽的生長。黃冠慶等研究表明，通過飲水方式每天每羽供給2 g AKG可提高黃羽肉雞飼料凈蛋白利用率，并提高飼料表觀代謝能。劉少娟等也報道，對斷奶仔豬添加1% AKG和0.5% 大蒜素能顯著提高粗蛋白的表觀消化率。本試驗中，在18～20 d中， 日糧添加AKG制劑可以顯著提高粗蛋白、粗灰分、干物質(zhì)、粗纖維的表觀代謝率。在39～41 d中，日糧添加0.8% AKG制劑可顯著提升粗脂肪的表觀代謝率；添加0.4% AKG制劑可顯著提升粗灰分、干物質(zhì)的表觀代謝率，原因可能是AKG可為腸道黏膜細胞供能促進黏膜生長，增加營養(yǎng)物質(zhì)與腸道的接觸面積，進而增強腸道對于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收功能，從而促進營養(yǎng)物質(zhì)的代謝吸收。此外有研究表明，AKG的主要產(chǎn)物谷氨酰胺可作為胰腺的能量底物，可提高小腸蛋白酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶及胰脂肪酶的活性，進一步提高對養(yǎng)分的消化能力。

3.3 日糧添加AKG制劑對肉雞器官發(fā)育的影響

組織器官的長度指數(shù)與質(zhì)量指數(shù)可反映組織器官各部位的宏觀發(fā)育情況，組織器官是動物體生命活動的基礎(chǔ)，組織器官的發(fā)育狀況直接影響了肉雞的生長速度及健康情況，而組織器官的的長度與質(zhì)量指數(shù)可在一定程度上反映動物的營養(yǎng)狀況及生理功能狀態(tài)。本試驗中，21 d時，日糧添加0.8% AKG制劑可顯著提高空腸相對長度。但對于十二指腸相對長度并無顯著影響，這結(jié)果與余親平等的結(jié)果并不一致，原因可能是AKG添加量不足或AKG對于小腸的促發(fā)育效果更多體現(xiàn)在肉雞2周齡以前。在42 d時，日糧添加AKG制劑可顯著提高肌胃相對質(zhì)量；日糧添加0.2% AKG與0.8% AKG制劑可顯著提高空腸相對質(zhì)量。原因可能由于AKG的產(chǎn)物谷氨酰胺可調(diào)節(jié)機體蛋白質(zhì)沉積，谷氨酰胺在血液中運輸氨至內(nèi)臟器官中，為嘌呤、嘧啶等提供前體物質(zhì)，是蛋白質(zhì)含量增加的物質(zhì)基礎(chǔ)，從而促進機體器官的發(fā)育。

3.4 日糧添加AKG制劑對肉雞胰腺消化酶活性的影響

肉雞腸道內(nèi)的消化酶以胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶為主。胰蛋白酶是腸道內(nèi)的主要蛋白水解酶。而胰腺則是動物體內(nèi)消化酶的主要合成和分泌部位，胰腺中各消化酶的活性可一定程度上反映腸道對于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力。本試驗中，日糧添加AKG制劑可顯著提升胰蛋白酶活性。

3.5 日糧添加AKG制劑對肉雞血清生化指標及血液激素水平的影響

血清生化指標能夠在一定程度上反映機體新陳代謝、免疫力及組織細胞通透性等狀況變化，是機體組織器官應(yīng)激和病變的信號，可間接反映動物機體的健康狀況。白蛋白由肝臟合成，是機體蛋白質(zhì)的來源之一，可用于修補組織和提供能量；球蛋白則是由B細胞轉(zhuǎn)化為漿細胞后分泌而成，可反映機體的免疫力，而總蛋白則是白蛋白與球蛋白之和。這3個指標的變化可反映動物體是否發(fā)生應(yīng)激或病變。本試驗中，血清中白蛋白、球蛋白與總蛋白含量各組間差異不顯著。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及堿性磷酸酶是機體代謝過程中的關(guān)鍵酶，正常情況下由于細胞膜的屏障作用不易逸出到血液。當細胞因急性應(yīng)激或其他因素破損時，細胞膜的通透性會急速升高導(dǎo)致這些酶被釋放入血液導(dǎo)致血液酶活性升高。血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性升高可反映肝臟和心臟的損傷程度；血液中堿性磷酸酶的活性是診斷膽道系統(tǒng)疾病時常用的指標。本試驗中，血清中，谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性各組間差異不顯著；在42 d時，日糧添加0.4% AKG、0.8% AKG制劑顯著降低了血清中堿性磷酸酶的活性。原因可能是由于AKG與其產(chǎn)物谷氨酰胺可在機體應(yīng)激時為組織器官細胞緊急補充能源，緩解應(yīng)激或病變等異常狀況帶來的代謝異常與器官損傷。

有資料表明，雞的正常血糖水平在10.0～16.9 mmol/L 之間。本試驗中，日糧添加0.8% AKG制劑可顯著升高肉雞血清中血糖的含量，最大值15.03 mmol/L屬于正常血糖水平范圍內(nèi)。但本試驗中胰島素與胰高血糖素各組間并無顯著差異，提示并未啟動因血糖升高導(dǎo)致的負反饋調(diào)節(jié)機制。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，日糧添加AKG制劑，可提高1～21 d 肉雞體增質(zhì)量，降低21～42 d和1～42 d料質(zhì)量比，改善生長性能；同時可提高肉雞的表觀代謝率，促進組織器官發(fā)育；提高肉雞血液中血糖的含量，降低42 d肉雞血清堿性磷酸酶的活性。在本試驗條件下，AKG制劑以0.8%添加劑量效果為最佳。