韓瑞亭 潘洪春

（1.黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟職業(yè)學院，黑龍江牡丹江 157041；2.吉林海資生物工程技術(shù)有限公司，吉林敦化 133700）

植酸（Phytic acid），又稱為肌醇六磷酸，廣泛存在植物體內(nèi)，在多種植物組織（特別是米糠與種子）中作為磷的主要儲存形式，常以鈣、鎂的復(fù)鹽形式存在[1-2]。其結(jié)構(gòu)是肌醇的6 個羥基均被磷酸酯化生成的肌醇衍生物，具有6 個磷酸結(jié)構(gòu)，具有較強酸性，能與金屬螯合成金屬鹽，存放時間稍長與空氣接觸變成褐色。植酸在食品工業(yè)用于蛋糕、餅干、飲料、罐頭及果蔬干制品等的保鮮護色，也為重要中間體，常用于制造菲?。〈剂姿崤c鈣、鎂等離子形成的復(fù)鹽），水解制備肌醇[3-7]。

在植酸的企業(yè)生產(chǎn)工藝中，玉米浸泡水用離子交換樹脂吸附，鹽酸洗脫，除雜得到植酸[8-9]。玉米中含鐵量較高，植酸與鐵螯合后影響產(chǎn)品色澤，貯存久又易沉淀析出[10-11]。由于鐵的存在，在植酸制造菲汀及水解制食品級磷酸氫鈣中，鐵又轉(zhuǎn)移到磷酸氫鈣中，影響產(chǎn)品質(zhì)量，因此在植酸生產(chǎn)過程中要嚴格控制植酸中的鐵含量[12-14]。食品安全國家標準GB 1886.237-2016《食品添加劑 植酸》中未規(guī)定鐵含量標準[15]。目前通用的鐵含量的檢測方法主要有1,10-菲啰啉分光光度法、磺基水楊酸分光光度法、EDTA 絡(luò)合滴定法、原子吸收分光光度法等[16-21]。本文參照國家標準GB/T 3049-2006《工業(yè)用化工產(chǎn)品 鐵含量測定的通用方法 1,10-菲啰啉分光光度法》，通過單因素實驗及響應(yīng)面實驗，對植酸中的鐵含量測定方法進行研究，以期建立植酸中鐵含量檢測方法，為植酸生產(chǎn)及使用提供參考[22-26]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植酸（吉林海資生物工程有限公司，批號：2019058806）；抗壞血酸（分析純，南京化學試劑股份有限公司）；1,10-菲啰啉鹽酸一水合物（分析純，美國Amresco 進口分裝）；十二水硫酸鐵銨（分析純，南京化學試劑股份有限公司）；所有分析用有機溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T6 紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；HH-S1 數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市城東萬順實驗儀器廠）；PHS-3E 酸度計（上海雷磁儀器廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 顯色原理

在酸性條件下，植酸鐵絡(luò)合物可解離出Fe3+（Fe2+），同時，抗壞血酸把Fe3+還原為Fe2+，鄰菲啰啉與Fe2+發(fā)生顯色反應(yīng)，該反應(yīng)的選擇性很高，而且生成的橙紅色絡(luò)合物非常穩(wěn)定，lgK穩(wěn)=21.3（20℃），其溶液在510 nm 處有最大吸收峰，此顯色反應(yīng)可用分光光度法測定微量鐵。

1.3.2 鐵含量的測定

取植酸粉末2.00 g，加純化水溶解并定容至100 mL，即為待測樣品溶液。取10.0 mL 待測樣品溶液加入抗壞血酸溶液和鄰菲啰啉溶液，以純化水定容至50 mL，搖勻，水浴加熱一定時間后于510 nm 處測吸光度。

1.3.3 單因素實驗

參考GB/T 3049-2006標準，考察了反應(yīng)時間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）、反應(yīng)溫度（20 ℃、30 ℃、40℃、50℃、60℃、70℃）、10% 抗壞血酸溶液用量（0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL）及0.1%鄰菲啰啉溶液的用量（0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL）對植酸中鐵含量測定的影響。

1.3.4 響應(yīng)面實驗

為進一步優(yōu)化檢測條件，在單因素實驗基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken 設(shè)計原理，選取反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、10%抗壞血酸溶液用量、0.1%鄰菲啰啉溶液用量作為考察因子，以吸光度為響應(yīng)值，求二次線性回歸方程，找出最佳測定條件。響應(yīng)面實驗設(shè)計因素水平如表1 所示。

表1 響應(yīng)面實驗因素和水平

1.3.5 方法學驗證

為保證分析測定結(jié)果的準確性和可靠性，經(jīng)正交實驗優(yōu)化植酸中鐵含量檢測的實驗條件后，需進一步對該測定方法進行方法學驗證，主要考察線性關(guān)系、重復(fù)性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、回收率等因素。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

如圖1 a）所示，隨著反應(yīng)時間的增加，鄰菲啰啉不斷與溶液中的Fe2+進行絡(luò)合，整個反應(yīng)平衡向右移動（式（1）、式（2）、式（3）），吸光度在反應(yīng)時間1.5 h 達到最大值，隨反應(yīng)時間繼續(xù)增加，溶液酸性不斷增強（式（2）），在一定程度上會抑制抗壞血酸進一步對Fe3+的還原，鄰菲啰啉與Fe3+絡(luò)合，使吸光度值略有減小。由于植酸鐵絡(luò)合物解離出Fe3+（Fe2+）需要時間，與GB/T 3049-2006 標準的15 min 相比，反應(yīng)時間1.5 h 為最佳時間。

如圖1 b）所示，隨著反應(yīng)溫度的增加，由于分子熱運動加快，有助于反應(yīng)進行，吸光度值不斷升高，溫度40℃為最高值，再升高溫度對測定影響不大。

圖1 反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、10%抗壞血酸用量、0.1%鄰菲啰啉用量對植酸中鐵含量測定的影響

如圖1 c）所示，10%抗壞血酸用量為1 mL 時吸光度達到最大值，可認為溶液中的Fe3+全部被還原為Fe2+并與鄰菲啰啉生成絡(luò)合物，隨著抗壞血酸用量的增加，溶液的酸性增加，反而不利于測定。

如圖1 d）所示，0.1%鄰菲啰啉用量達到1.5 mL 時吸光度達到最大值，再增加用量對測定影響不大。

2.2 響應(yīng)面實驗

2.2.1 模型建立

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，用Design-Expert 軟件，根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計原理，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面分析實驗，結(jié)果如表2 所示。

表2 Box-Behnken 實驗設(shè)計與結(jié)果

用Design-Expert 軟件對實驗結(jié)果進行回歸擬合，得回歸方程如下：

2.2.2 模型方差分析

利用統(tǒng)計軟件進行二次多元回歸擬合，得到回歸方程的方差分析結(jié)果，如表3 所示。

由表3 可知，實驗中反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、10%抗壞血酸溶液用量、0.1%鄰菲啰啉溶液用量對實驗的影響極顯著（P值均小于0.01）。A2、B2、C2、D2的值均較?。≒ ＜0.01），反應(yīng)出其對實驗的影響極顯著。由回歸模型的方差可知，差異極顯著（P ＜0.01），說明該模型對本實驗的分析和預(yù)測較精準。模型的失擬項值為0.088 1（＞0.05），說明該模型不存在失擬因素，因此可用該回歸方程模擬實驗?；貧w方程相關(guān)系數(shù)R2=0.985 1，校正系數(shù)R2adj=0.970 1，說明實驗的實際值與預(yù)測值擬合度較好，該模型可用于響應(yīng)值預(yù)測。

表3 響應(yīng)面實驗的方差分析

由方差分析可知，四個因素兩兩之間的交互作用均不顯著（P ＞0.05）。根據(jù)響應(yīng)面分析，結(jié)合回歸方程可得，反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度對測定結(jié)果的影響是先升高，再降低；抗壞血酸用量和鄰菲啰啉溶液用量達到最大值后，再增加用量對測定結(jié)果影響不大。

通過Design-Expert 軟件進行優(yōu)化，得出測定植酸鐵含量的最佳條件為：反應(yīng)時間2.5 h、反應(yīng)溫度44℃、10%抗壞血酸溶液用量1.05 mL、0.1%鄰菲啰啉溶液用量1.52 mL，預(yù)測吸光度為0.446 A。取植酸樣品6 份，在優(yōu)化后的條件進行驗證實驗，測定吸光度。結(jié)果吸光度平均值為0.442 A，RSD為7.62%，與預(yù)測值相較接近，說明優(yōu)化后的實驗條件比較穩(wěn)定。

2.3 方法學驗證

2.3.1 標準曲線繪制

配制含鐵離子濃度（1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L、4.0 mg/L、5.0 mg/L、6.0 mg/L、7.0 mg/L、8.0 mg/L）的植酸溶液，按最佳條件測定吸光度。以吸光度為縱坐標，植酸溶液中鐵離子濃度為橫坐標，得出標準曲線的回歸方程為 Y=0.199 2X -0.003 3（R2=0.998 7），說明測定方法在鐵離子濃度1.0 μg/mL～8.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 重復(fù)性實驗

配制含鐵離子濃度為1.00 μg/mL 及8.00 μg/mL 植酸溶液的樣品兩份，按最優(yōu)測定條件，由同一操作人員平行測定6組數(shù)據(jù)，分別計算相對標準偏差。兩份樣品吸光度值的相對標準偏差分別是0.42%和0.80%，重復(fù)性良好。

2.3.3 重現(xiàn)性實驗

配制含鐵離子濃度為1.00 μg/mL 及8.00 μg/mL 植酸溶液的樣品兩份，按最優(yōu)測定條件，由兩位操作人員平行測定6組數(shù)據(jù)，分別計算相對標準偏差。兩份樣品吸光度值的相對標準偏差分別是0.78%和1.00%，重現(xiàn)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性實驗

配制含鐵離子濃度為1.00 μg/mL 及8.00 μg/mL 植酸溶液的樣品兩份，按最優(yōu)測定條件，同一操作人員每隔10 分鐘取樣測吸光度，連續(xù)測6 次，計算相對標準偏差。結(jié)果兩份樣品的吸光度值的相對標準偏差分別是0.62%和0.89%，穩(wěn)定性良好。

2.3.5 回收率實驗

取同一批次植酸樣品6 份，每份1 mL，加入標準鐵溶液10 mL，按最優(yōu)測定條件測定，計算回收率。經(jīng)分析，方法的回收率為98.10%，相對標準偏差為2.24%。

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面實驗優(yōu)化植酸中鐵含量測定條件。結(jié)果表明，最佳檢測條件為：反應(yīng)時間2.5 h、反應(yīng)溫度44℃、10%抗壞血酸溶液用量1.05 mL、0.1%鄰菲啰啉溶液用量1.52 mL。此方法的重復(fù)性、重現(xiàn)性良好，在植酸含鐵量1.00 μg/mL 至8.00 μg/mL 范圍內(nèi)測定數(shù)據(jù)穩(wěn)定，回收率達98.10%。此方法操作簡單，靈敏度高，結(jié)果可靠，可應(yīng)用于植酸中鐵含量的測定。