張鈴 劉菲 曾建偉 趙春雨 熊曉滿 林珊 黃彬 ，2 陳達鑫 林育鵬 蔡巧燕 #

（1 福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院 福州 350122；2 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室 福州 350122；3 福建中醫(yī)藥大學陳可冀學術(shù)思想傳承工作室 福州 350122；4 福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院 福州 350122）

據(jù)統(tǒng)計，全球有超過15 億人患有高血壓，且呈年輕化趨勢[1]。高血壓是一種低級別炎癥的慢性疾病，其發(fā)生發(fā)展伴隨著炎癥細胞的持續(xù)激活，是心臟病、腦卒中、慢性腎病、外周動脈疾病等最主要的危險因素之一。研究表明，有效抑制炎癥反應(yīng)可以阻滯高血壓的進展[2]。目前許多中藥在抗炎方面發(fā)揮了良好的療效，如丹參[3]、苦參[4]、肉桂[5]、黃芩[6]等。其中，黃芩是一種傳統(tǒng)中藥，其味苦、性寒，歸肺、心、肝、膽、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火、解毒、止血等功效，在臨床上用于高脂血癥、動脈粥樣硬化、高血壓等疾病的治療[7]。而黃芩素是從黃芩干燥根中提取出的一種黃酮類化合物，其能通過多靶點、多通路起到抗炎、抗氧化、保肝、利尿、抗癌等功效[8]。在高血壓的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩素通過促進內(nèi)皮細胞中的內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）重組蛋白表達與一氧化氮（NO）釋放，可增強乙酰膽堿對血管的舒張作用[9]，但其對高血壓所致炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用未見報道。本研究以AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠作為研究對象，明確了黃芩素降低血壓及調(diào)控血清中炎癥相關(guān)因子表達的藥效作用，并進一步通過網(wǎng)絡(luò)藥理學探討其治療高血壓的潛在機制?，F(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 動物 雄性 C57BL/6 小鼠，SPF 級別，7 周齡，購自于上海斯萊克公司，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF 級動物房觀察室。實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2019-0007。

1.2 藥物配制 黃芩素購買于上海源葉生物科技有限公司，用0.9%氯化鈉溶液超聲助解，現(xiàn)配現(xiàn)用。1.3 主要儀器與試劑 Coda 血壓測量儀購自于美國Kent Scientific 公司；Bio-Plex 懸液芯片系統(tǒng)購自于美國Bio-Rad 公司；Alzet Osmotic Pump（型號：2004）購自于美國Alzet 公司；AngⅡ粉末購自于美國Abcam 公司；Bio-Plex Pro assays 試劑盒購自于美國Bio-Rad 公司。

1.4 AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠模型的構(gòu)建 采用皮下植入AngⅡ1 000 ng（/kg·min）緩釋微型注射泵的方式構(gòu)建高血壓小鼠模型。具體操作如下：在小鼠的右側(cè)背部后的兩側(cè)肩胛骨中間做一長約1.0～2.0 cm 的縱行皮膚切口，沿皮下組織游離，游離至左側(cè)頸部皮下，將預(yù)裝好的微量泵埋入到切口對側(cè)皮下，用針、線縫合皮膚切口，并用碘伏進行消毒處理。把做完手術(shù)的小鼠放在電熱毯上保溫，防止死亡，直到小鼠麻醉清醒，再放回籠子里。

1.5 動物分組和給藥 隨機將小鼠分成對照組、AngⅡ組和AngⅡ+黃芩素組，每組各8 只。黃芩素的給藥劑量為：5 mg（/kg·d）。于術(shù)后第1 天開始給藥，1 次/d，每次灌胃0.3 ml，連續(xù)灌胃28 d。對照組和AngⅡ組同步給予等體積的生理鹽水灌胃。

1.6 鼠尾無創(chuàng)血壓儀測量血壓 手術(shù)前測量基礎(chǔ)血壓，在黃芩素干預(yù)后第7、14、21、28 天測量血壓。血壓檢測步驟如下：將Coda 血壓測量系統(tǒng)安裝好，包括加熱板、壓差傳感器裝置、裝有Coda 軟件的電腦等，打開電源和開關(guān)。誘使小鼠鉆進固鼠器，固定完畢后放于加熱板上加熱，固定器和小鼠尾部均在加熱板上，讓小鼠穩(wěn)定約3 min。將大小合適的尾袖套在小鼠尾巴根部，設(shè)置好電腦上的Coda 軟件后開始測定，每只小鼠預(yù)測定10 次，正式測定15 次，每次30 s，記錄合格小鼠的收縮壓、舒張壓數(shù)據(jù)，并計算其平均動脈壓，平均動脈壓=（收縮壓+2×舒張壓）/3。

1.7 Bio-Plex Pro assays 試劑盒檢測血清中炎癥相關(guān)因子的表達 往96 孔板中加入50 μl 1×與抗體偶聯(lián)的微球，用wash buffer 洗板2 次。分別將50 μl的標準品、樣本、Blank 加入到對應(yīng)的孔中，900 rpm室溫避光孵育30 min。用wash buffer 洗板2 次，再加入25 μl 1×檢測抗體，900 rpm 室溫避光孵育30 min。用 wash buffer 洗板 3 次，加入 50 μl 鏈霉親和素 -PE，900 rpm 室溫避光孵育 10 min。用 wash buffer 洗板 3 次，加入 125 μl 的 assay buffer，900 rpm 室溫避光振蕩30 s，于Bio-Plex 200 分析儀上機檢測，使用Bio-Plex Manager 軟件分析每個炎癥相關(guān)因子相對的熒光強度，通過標準曲線計算對應(yīng)的濃度。

1.8 黃芩素作用靶點基因與高血壓疾病相關(guān)靶點基因的提取與交集 通過ETCM、TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索黃芩素的潛在作用靶點基因；以“hypertension”為關(guān)鍵詞，在Disgenet、OMIM 等數(shù)據(jù)庫中進行檢索，以獲得高血壓疾病相關(guān)靶點基因；采用Draw Venny Diagram 在線程序?qū)ⅫS芩素和高血壓靶基因取交集，獲得兩者共有的靶點，此集合為黃芩素治療高血壓疾病的可能潛在作用靶點。

1.9 KEGG 分析 將黃芩素和高血壓靶基因取交集后取得的潛在作用靶點導(dǎo)入到David 數(shù)據(jù)庫中，分析獲得KEGG 通路富集的氣泡圖及關(guān)鍵信號通路（只展示前20 條具有統(tǒng)計學意義的顯著性結(jié)果）。1.10 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計分析 所有實驗結(jié)果均采用SPSS15.0 軟件進行統(tǒng)計學處理，實驗結(jié)果用（）表示。多組數(shù)據(jù)間比較，符合正態(tài)分布且方差齊的，采用單因素方差（ANOVA）分析。若不符合正態(tài)性分布，則使用非參數(shù)檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩素對AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠血壓的影響 與對照組比較，AngⅡ組小鼠在第1～4 周的收縮壓、舒張壓及平均動脈壓均顯著升高（P＜0.05），表明高血壓小鼠模型構(gòu)建成功，且持續(xù)穩(wěn)定；在給藥2 周后，與AngⅡ組比較，AngⅡ+黃芩素組小鼠的收縮壓、舒張壓及平均動脈壓均顯著降低（P＜0.05），表明黃芩素能顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠血壓的升高。見圖1。

圖1 黃芩素對AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠血壓的影響

2.2 黃芩素對AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠血清中炎癥相關(guān)因子表達的影響 與對照組比較，AngⅡ組小鼠血清中的白介素-6（IL-6）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）、白介素 -1α（IL-1α）、單核細胞趨化蛋白 -1α（MIP-1α）、T 細胞激活分泌調(diào)節(jié)因子（RANTES）的表達均顯著升高（P＜0.05），IL-10 的表達則顯著降低（P＜0.05）；而黃芩素干預(yù)后，能顯著降低AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠血清中IL-6 和MCP-1 的表達（P＜0.05），升高IL-10 的 表 達 （P ＜0.05）， 但 對 TNF-α、IL-1α、MIP-1α、RANTES 的表達沒有顯著影響（P＞0.05）。見圖2。

圖2 黃芩素對AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠血清中炎癥相關(guān)因子表達的影響

2.3 黃芩素作用靶點、 高血壓疾病作用靶點的Venn 分析 從ETCM、TCMSP 數(shù)據(jù)庫搜集到的黃芩素潛在作用靶點基因共有72 個，從Disgenet、OMIM 等數(shù)據(jù)庫搜集到的高血壓疾病靶點基因共有9 032 個。對兩者的靶點基因進行Venn 分析，獲得的交集靶點基因共有58 個。見圖3。

圖3 黃芩素與高血壓交集靶點的韋恩圖

2.4 黃芩素治療高血壓的KEGG 通路富集分析黃芩素治療高血壓的潛在靶點涉及到的信號通路包括代謝途徑、氮代謝、JAK-STAT 信號通路、PI3K-AKT 信號通路、趨化因子信號通路等。見圖4。

圖4 黃芩素治療高血壓的KEGG 通路富集分析

3 討論

高血壓是一種復(fù)雜的慢性疾病，是心腦血管疾病、慢性腎病和全因死亡的危險因素，其發(fā)病機制與腎 素 - 血 管 緊 張 素 - 醛 固 酮 系 統(tǒng)（Renin-Angiotensin-Aldosterone System, RAAS）密切相關(guān)[10]。AngⅡ是RAAS 系統(tǒng)中的重要效應(yīng)因子，它能刺激醛固酮的分泌，從而增強腎小管對鈉和水的再吸收，引起水鈉潴留，導(dǎo)致血管內(nèi)積液量增加，血壓升高[11]。本研究利用AngⅡ皮下埋泵灌注的方式建立了高血壓小鼠模型，結(jié)果表明在造模的28 d內(nèi)，AngⅡ組小鼠的收縮壓、舒張壓及平均動脈壓均持續(xù)、穩(wěn)定升高。而經(jīng)黃芩素干預(yù)2 周后，AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠的收縮壓、舒張壓及平均動脈壓均顯著降低，表明黃芩素具有良好的降壓療效。苗杰[12]研究表明黃芩素干預(yù)4 d 后就能顯著降低AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠收縮壓，但對舒張壓及平均動脈壓的影響尚未闡明。該研究實驗結(jié)果與我們的研究結(jié)果一致，但黃芩素起效時間有所差別。該研究造模采用的AngⅡ劑量為1 200 ng/（kg·min），而本研究采用的AngⅡ劑量為1 000 ng/（kg·min）；并且黃芩素給藥方式及劑量也存在差別，該研究采用每天腹腔注射25 mg/kg 的黃芩素，而本研究采用每天灌胃5 mg/kg 的黃芩素。因此，本研究黃芩素發(fā)揮藥效的作用時間有所延遲。

近年來，越來越多的證據(jù)表明高血壓在發(fā)生發(fā)展的過程中會造成全身低級別的炎癥反應(yīng)，同時，炎癥反應(yīng)也會加劇高血壓的進展[13～14]。目前許多炎癥因子和趨化因子已經(jīng)被證實與高血壓密切有關(guān)，其中包括 IL-6、MCP-1、TNF-α 和 IL-10 等[15]。如有報道顯示：IL-6 可能是健康人群高血壓的高度獨立危險因素，并發(fā)現(xiàn)這些細胞因子的高表達與高血壓靶器官損傷呈正相關(guān)[16]；MCP-1 的缺失或阻斷能有效降低血壓，減輕血管和腎臟炎癥反應(yīng)[17]；IL-10 在AngⅡ誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓和腎損傷中發(fā)揮著保護作用[18]。本研究表明，在AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠血清中，其促炎因子及趨化因子 IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1α、MIP-1α、RANTES 的表達均顯著高于對照組，但血清中抑炎因子IL-10 的含量顯著低于對照組。而黃芩素干預(yù)顯著降低AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠血清中IL-6、MCP-1 的表達，升高IL-10 的表達，證明了黃芩素具有顯著抗炎的功效，但其具體的調(diào)控機制尚不清楚，因此我們通過網(wǎng)絡(luò)藥理學初步探索了其可能的潛在作用機制。

通過數(shù)據(jù)庫分別搜集到黃芩素及高血壓疾病的潛在作用靶點，并對兩者取交集，發(fā)現(xiàn)了58 個共有靶點，并對這些共有靶點進行KEGG 分析，發(fā)現(xiàn)這些靶點涉及到代謝途徑、氮代謝、JAK-STAT 信號通路、PI3K-AKT 信號通路、趨化因子信號通路等多條通路。其中PI3K-AKT 信號通路能激活下游NF-κB信號通路依賴性的轉(zhuǎn)錄，進而促進炎癥相關(guān)因子表達的升高[19]；JAK-STAT 信號通路作為應(yīng)激的炎癥信號通路，可以激活炎癥因子相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，引起炎癥因子級聯(lián)反應(yīng)，加速疾病的進程[20]。趨化因子是一類能誘導(dǎo)白細胞歸巢的細胞因子。如MCP-1 通過結(jié)合其受體CCR2，從而誘導(dǎo)單核-巨噬細胞、T 淋巴細胞遷移到炎癥部位，是炎癥反應(yīng)的始動因子，且參與了高血壓的發(fā)生發(fā)展及靶器官（血管、心臟、腦）的損傷[21]。因此，本研究證實了黃芩素除了能調(diào)控血壓升高外，還具有顯著降低炎癥反應(yīng)的功效，但其是否與調(diào)控JAK-STAT、PI3K-AKT 和趨化因子信號通路等有關(guān)，還有待進一步的實驗驗證。