慧 芳，孫天霞，薛東明，姜英男，趙 雨

（長春中醫(yī)藥大學(xué)人參科學(xué)研究院，長春 130117）

梅花鹿茸系鹿科動物梅花鹿（Cervus nipponTemminck）雄性未骨化帶有密生茸毛的幼角，也是獨特的哺乳動物的附屬肢體[1]。鹿茸的生長速度非常快，是唯一一個每年都會脫落后能完全再生的哺乳動物器官[2]。

鹿茸再生的組織基礎(chǔ)為生茸區(qū)骨膜（antlerogenic periosteum，AP），AP衍生出角柄骨膜（pedicle periosteum，PP），而鹿茸的生長中心則是由角柄骨膜細(xì)胞發(fā)育而來的[3-4]。鹿茸在脫盤后開始生長，生長速度逐漸加快。在60 d 后，由于生茸區(qū)的骨膜中的間充質(zhì)干細(xì)胞的周期性被激活，鹿茸進(jìn)入了快速生長期[4-5]，90 d 后，鹿茸進(jìn)入了快速骨化期，經(jīng)歷了軟骨內(nèi)骨化過程[6]。

研究表明，有很多因素如激素、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子都參與到鹿茸生長發(fā)育過程的調(diào)控。其中主要調(diào)控快速生長及骨化的激素為雄激素，除了雄激素外，甲狀腺激素[7]、甲狀旁腺素[8]、卵泡刺激素、黃體生成素、腎上腺皮質(zhì)激素、催乳素、雌二醇、孕激素、視黃酸[9]、絨毛膜促性腺激素[10]、褪黑激素[11]等也在鹿茸生長發(fā)育過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。

除激素調(diào)控外，多種細(xì)胞因子也參與鹿茸生長發(fā)育過程，如胰島素樣生長因子（IGF-1）、表皮生長因子（EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）通過促進(jìn)鹿茸細(xì)胞的增殖分裂，調(diào)控鹿茸的生長速度[12-16]。一些轉(zhuǎn)錄因子也參與到了鹿茸軟骨內(nèi)骨化過程，如cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白、Sox 家族、活化蛋白-1、Runx2 轉(zhuǎn)錄因子、C-myc 轉(zhuǎn)錄因子[17-20]。鹿茸生長發(fā)育過程中還伴隨著神經(jīng)和血管的快速生長，神經(jīng)生長因子參與了鹿茸神經(jīng)的生長，具有促進(jìn)鹿茸的神經(jīng)元生長、發(fā)育、再生的作用[21-22]。成纖維生長因子和血管生成素通過激發(fā)鹿茸血管生成參與到鹿茸快速生長期和骨化期的調(diào)控。

由此可看出，鹿茸具有獨特生物學(xué)特性，且調(diào)控機(jī)制復(fù)雜。雖然對鹿茸生長發(fā)育的組織學(xué)研究已有較好的基礎(chǔ)，但其具體分子機(jī)制還未闡明，生長發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵蛋白和信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也不清晰。隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者可獲得大量的數(shù)據(jù)，通過對組學(xué)數(shù)據(jù)的挖掘，進(jìn)行更深入的機(jī)制研究。特別是利用各個組學(xué)數(shù)據(jù)之間的互補(bǔ)性和相似性，綜合分析多組學(xué)數(shù)據(jù)，可以進(jìn)行更加全面、系統(tǒng)的闡明鹿茸生長發(fā)育的機(jī)制。

本研究采用 Illumina HiSeq 測序技術(shù)和iTRAQ 技術(shù)，對處于初生期、快速生長期和骨化期鹿茸頂端組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白組測序并進(jìn)行聯(lián)合分析，以期為鹿茸生長發(fā)育機(jī)制的研究提供依據(jù)。

1 材料

本研究選取4 歲齡健康的東北梅花鹿茸頂端組織為研究對象，鹿茸樣品采集于吉林省雙陽市鹿鄉(xiāng)鎮(zhèn)。分別采集初生期、快速生長期和骨化期鹿茸的頂端組織，每個時期隨機(jī)選取3 只進(jìn)行取樣。

2 方法

2.1 RNA 提取及轉(zhuǎn)錄組測序 提取鹿茸組織的RNA。通過NanoDrop 2000 和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的質(zhì)量后，用DNase I 消化DNA 后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA；將mRNA打斷成短片段，以打斷后的mRNA 為模板，合成一鏈cDNA，然后配制二鏈合成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA，并使用試劑盒純化回收、粘性末端修復(fù)、cDNA 的3’末端加上堿基“A”并連接接頭，然后進(jìn)行片段分選，最后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；構(gòu)建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer 和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System 質(zhì)檢合格后，上機(jī)測序。

2.2 基因表達(dá)及差異基因分析 采用RPKM 法[23]（Fragment Per Kilo bases per Million reads）計算基因的表達(dá)量。按照Audic S[24]等方法進(jìn)行差異基因的篩選，進(jìn)行多重假設(shè)檢驗校正，控制整體的錯誤發(fā)生率。

2.3 蛋白質(zhì)定量及鑒別 用Mascot2.3.02 對蛋白進(jìn)行鑒定和定量，不同樣本之間對差異蛋白的定義為：當(dāng)差異倍數(shù)達(dá)到1.2倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計檢驗其P值小于0.05時，視為差異蛋白。

2.4 差異基因和差異蛋白的KEGG 富集 應(yīng)用超幾何檢驗，找出與所有基因組和蛋白質(zhì)背景相比，在差異基因和差異蛋白中顯著性富集的Pathway。根據(jù)公式計算出差異基因和蛋白的P 值，以P-value ≤0.05 為閾值，滿足此條件的定義為在差異蛋白質(zhì)中顯著富集的Pathway。

2.5 相關(guān)性分析 采用 SPSS 22.0 軟件對轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的差異基因和差異蛋白進(jìn)行相關(guān)性分析。

3 結(jié)果

3.1 差異基因和差異蛋白鑒定 本研究中的差異表達(dá)基因定義為FDR ≤0.001 且倍數(shù)差異在2 倍以上的基因。PSvsRG 組共得到11 294 個顯著差異基因（DEGs），其中7 954 個基因顯著上調(diào)，3 340 個基因顯著下調(diào)；PSvsOS 組共有4 924 個DEGs，其中2 402 個基因顯著上調(diào)，2 522 個基因顯著下調(diào)。結(jié)果顯示鹿茸不同生長時期有大量差異基因表達(dá)，且在快速生長期差異基因較多（圖1）。

PSvsRG 組共得到236 個差異蛋白（DAPs）；其中138 個上調(diào)蛋白，98 個下調(diào)蛋白。PSvsOS 組共獲得211 個DAPs，其中，有121 個上調(diào)蛋白，90 個下調(diào)蛋白（圖1)。這些結(jié)果表明，許多蛋白質(zhì)在鹿茸快速生長期和骨化期表現(xiàn)出不同的豐度（圖1）。

圖1 鹿茸中表達(dá)有差異表達(dá)的基因和蛋白質(zhì)

3.2 蛋白豐度和基因表達(dá)水平相關(guān)性分析 經(jīng)過進(jìn)一步篩選后，發(fā)現(xiàn)在PSvsRG 和PSvsOS 組中，分別有54、51 個DEGs 編碼了其相應(yīng)的DAPs（圖2）。所以為了分析鹿茸生長過程中轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組變化之間的一致性，本研究使用篩選出的54 和51 個DGEs 及其相應(yīng)的DAPs 的數(shù)據(jù)進(jìn)行了相關(guān)性分析（圖3，圖4）。Pearson 相關(guān)性檢驗表明，在PSvsRG 中，DEGs與相應(yīng)DAPs 的Log2fold change 呈正相關(guān)，皮爾森系數(shù)為0.070（圖3）；在PSvsOS 中，DEGs 及其相應(yīng)的DAPs 的Log2fold change 呈負(fù)相關(guān)，皮爾森系數(shù)為-0.229（圖4）。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄組和蛋白組相關(guān)性較差，呈弱相關(guān)。這可能是由于轉(zhuǎn)錄水平的波動比蛋白質(zhì)的翻譯和修飾過程的波動更快。

圖2 差異蛋白和差異基因的維恩圖

圖3 PSvsRG 組中DEGs 和DAPs 轉(zhuǎn)錄水平與蛋白豐度的相關(guān)性

圖4 PSvsOS 組中DEGs 和DAPs 轉(zhuǎn)錄水平與蛋白豐度的相關(guān)性

3.3 鹿茸生長發(fā)育相關(guān)候選基因/蛋白鑒定 去掉快速生長期在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平調(diào)節(jié)方向相反的基因和蛋白后，獲得了35 個DEGs 及其相應(yīng)的DAPs，其中，上調(diào)基因/蛋白有27 個；下調(diào)基因/蛋白有8 個。去掉骨化期在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平調(diào)節(jié)方向相反的基因和蛋白后，獲得20 個基因和蛋白。其中，發(fā)現(xiàn)上調(diào)的基因/蛋白6 個，下調(diào)基因/蛋白14 個。

在鹿茸快速生長期和骨化期有3 個基因/蛋白一直處于上調(diào)狀態(tài)，它們包括：Ⅰ型角蛋白（KRT1）、IX 型膠原（COL9A）、凝血酶敏感蛋白2（THBS2S）。還有4 個基因/蛋白呈下調(diào)趨勢，它們包括：組蛋白H4（H4）、組蛋白H2A（H2A）、鈣調(diào)結(jié)合蛋白（CALD1）。除了在2 個時期共同富集到基因的外，本研究還關(guān)注了只在快速生長期或骨化期表達(dá)的基因，其中，在快速生長期上調(diào)基因包括：I 型膠原蛋白α 鏈（COL1A）、軟骨可聚蛋白多糖（AGC1）、基底膜特異性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白（HSPG2）等。顯著下調(diào)基因為果糖-二磷酸醛縮酶（ALDO）。在骨化期顯著上調(diào)基因包括為信號調(diào)節(jié)蛋白（SIRPA），顯著下調(diào)基因包括：富含半胱氨酸和甘氨酸的蛋白質(zhì)（CSRP）、肌球蛋白重鏈9（MYH9）、肽酰脯氨基順反異構(gòu)酶B（PPIB）、組蛋白H1/5（H1-5）。

3.4 鹿茸生長發(fā)育相關(guān)候選通路篩選 對快速生長期和骨化期候選基因/蛋白進(jìn)行KEGG 富集分析，結(jié)果顯示，在快速生長期候選基因/蛋白中有共有7 個基因/蛋白注釋到了10 個信號通路。骨化期候選基因/蛋白有7 個基因/蛋白富集到12 個通路。其中，2 個時期共同富集到6 個信號通路，包括：粘著斑、ECM-受體相互作用、TGF-β 信號通路、p53 信號通路、血管平滑肌收縮、蛋白質(zhì)消化吸收通路。而共同富集到以上6 個信號通路的基因/蛋白為CALD1、THBS2S、COL9A。

除了共同富集到的信號通路和基因/蛋白外，在快速生長期還富集到了戊糖磷酸途徑、糖酵解/糖異生、果糖和甘露糖代謝、代謝途徑等通路。其中，有3 個基因/蛋白只在快速生長期表達(dá)，它們是ALDO（下調(diào)）、COL1A（上調(diào)）、HSPG2（上調(diào)）。

在骨化期富集還到了破骨細(xì)胞分化、肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、緊密連接、RNA 轉(zhuǎn)運(yùn)、mRNA 監(jiān)測途徑信號通路。其中有4 個基因/蛋白只在骨化期表達(dá)，包括：SIRPA（上調(diào)），顯著下調(diào)基因包括：CSRP（下調(diào)）、MYH9（下調(diào)）、H1-5（下調(diào)）。

4 討論

與低級脊椎動物和無脊椎動物相比，哺乳動物的再生能力非常有限，而鹿茸是一種可以周期性完全再生的器官，而鹿茸再生的調(diào)控機(jī)制不甚清晰，如果可以闡明鹿茸再生過程的分子調(diào)節(jié)機(jī)制，對于肢體再生、器官移植及骨病治療有著重要意義。

本研究結(jié)果顯示，粘著斑、ECM-受體相互作用、TGF-β 信號通路、p53 信號通路、血管平滑肌收縮、蛋白質(zhì)消化吸收通路共同參與到了鹿茸快速生長和骨化期的調(diào)控。

在鹿茸快速生長期，產(chǎn)生了高強(qiáng)度的機(jī)械張力使鹿茸血管、皮膚和神經(jīng)快速生長，骨化期涉及到軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨過程。而本研究中共同富集兩個時期的基因/蛋白（THBS2S、CALD1、COL9A）參與了鹿茸組織細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞、細(xì)胞增殖、成骨分化和血管生成等過程。

除了共同富集到的信號通路和基因/蛋白外。本研究還發(fā)現(xiàn)了只在快速生長期和骨化期表達(dá)的基因/蛋白。

在快速生長期富集到了與糖代謝（ALDO）和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的相關(guān)蛋白（HSPG2）。研究顯示，在軟骨發(fā)育過程中，信號分子嚴(yán)格調(diào)控葡萄糖的吸收和利用。糖代謝的紊亂會影響軟骨細(xì)胞的成熟過程[25]。ECM 由結(jié)構(gòu)性和功能性大分子化合物組成，包括膠原蛋白、彈性蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖、非膠原糖蛋白[26]。在骨骼中，ECM 介導(dǎo)細(xì)胞粘附，機(jī)械傳導(dǎo)，礦化成核等過程。在本研究中發(fā)現(xiàn)，有膠原蛋白、蛋白聚糖的表達(dá)。我們認(rèn)為在鹿茸生長發(fā)育中糖代謝及ECM 通路具有重要作用，可能通過激活胞內(nèi)信號傳遞的連鎖反應(yīng)從而調(diào)控著多種與鹿茸生長發(fā)育有關(guān)的信號通路。

在骨化期富集到的基因/蛋白主要與破骨細(xì)胞分化和細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)（SIRPA、CSRP、MYH9、H1-5）有關(guān)，這些蛋白可能通過調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞活性或激活成骨分化相關(guān)通路參與了鹿茸的成骨過程。

在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)上，鹿茸不僅是再生模型，還是一種被人們認(rèn)可的滋補(bǔ)中藥，隨著生命科學(xué)研究進(jìn)入組學(xué)時代，組學(xué)技術(shù)飛快發(fā)展，加速了對鹿茸生長發(fā)育的研究。綜合分析多組學(xué)的研究數(shù)據(jù)可以根據(jù)組學(xué)數(shù)據(jù)之間的相似性和互補(bǔ)性更深層次的從多角度、多層次、系統(tǒng)地闡明鹿茸再生和快速生長發(fā)育機(jī)制。本研究以不同生長時期鹿茸為樣品，對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白組測序，篩選出與鹿茸生長發(fā)育相關(guān)的基因及蛋白質(zhì)，以期為鹿茸生長發(fā)育機(jī)制的研究提供依據(jù)。