王 鵬，李 雨，閆 珺，張俐佳，孫 姮，于佳琪，劉松江*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地項(xiàng)目辦公室，哈爾濱 150040）

惡性胸腔積液（malignant pleural effusion,MPE）是原發(fā)性胸膜癌、胸膜間皮瘤、肺轉(zhuǎn)移癌等惡性疾病患者中常見(jiàn)的并發(fā)癥[1]，被認(rèn)為是惡性疾病的第一個(gè)侵襲性致命征兆，對(duì)患者健康構(gòu)成致命威脅[2]。基于炎癥反應(yīng)及腸道菌群的最新研究發(fā)現(xiàn)，他們可作為預(yù)測(cè)腫瘤治療療效評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志，腸道菌群參與抗腫瘤免疫應(yīng)答及預(yù)后已成為研究熱點(diǎn)之一[3]。生活在腸道的細(xì)菌、真菌和其他微生物的復(fù)合體，稱為腸道微生物群落，其多樣性參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后[3]。本研究采用真武湯加地龍聯(lián)合長(zhǎng)春瑞濱和順鉑治療惡性胸腔積液，觀察其對(duì)血清IL-18、TNF-α 和腸道菌群的影響，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年6 月－2020 年6 月收治的60 例肺癌并惡性胸腔積液患者臨床資料進(jìn)行整理及分析，將與《常見(jiàn)惡性腫瘤診治規(guī)范》[4]對(duì)肺惡性腫瘤診斷相符者以及經(jīng)臨床表現(xiàn)、病理學(xué)結(jié)果、影像學(xué)診斷結(jié)果等檢查確診為惡性胸腔積液者納入，將血液系統(tǒng)疾病者、非肺惡性腫瘤引發(fā)惡性胸腔積液者排除。對(duì)照組30 例，男女比例20:10，年齡46～75 歲，平均（59.32±2.14）歲；病理類型：腺癌19 例，鱗癌10例，其他1 例。研究組30 例，男女比例19:11，年齡45～76 歲，平均（60.99±2.38）歲；病理類型：腺癌17 例，鱗癌9 例，其他4 例。2 組基線資料比較P＞0.05。

1.2 治療方法 對(duì)照組予以抗癌與對(duì)癥治療，靜滴長(zhǎng)春瑞濱（齊魯制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 H20093078，10 mg）25 mg/m2加 0.9%氯化鈉溶液 100 mL，順鉑（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20040813，20 mg）25 mg/m2加 0.9%氯化鈉溶液 500 mL。研究組在對(duì)照組基礎(chǔ)之上服用真武湯加地龍，方藥及劑量：茯苓、芍藥、生姜（切）、附子（炮，去皮，破八片）各15 g，白術(shù)25 g，地龍15 g，諸藥清水煎汁200 mL，之后再次煎煮取汁200 mL，2次藥液混合，每日2 次空腹溫服，日1 劑。2 組均堅(jiān)持治療6 周。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)WHO 標(biāo)準(zhǔn)判定[5]：胸腔積液幾乎消失或大于95%且持續(xù)4 周以上，視作完全緩解（CR）；胸腔積液量減少在60%以上，并持續(xù) 4 周以上，視作部分緩解（PR）；積液量減少60%以下，且無(wú)增減趨勢(shì)，視作穩(wěn)定（SD）；積液量變化不明顯增加，視作進(jìn)展（PD）。

比較2 組中醫(yī)證候積分，依據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[6]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，分成咳嗽、呼吸困難、胸痛等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，分值愈高則癥狀愈嚴(yán)重。記錄不良反應(yīng)，包括發(fā)熱、腎功能異常、消化道癥狀等。利用QOL-C30 量表評(píng)分[7-8]從認(rèn)知、角色、軀體、情緒等角度評(píng)價(jià)生存質(zhì)量情況。

1.4 血清IL-18 和TNF-α 水平測(cè)定 IL-18（人白介素18）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，產(chǎn)品貨號(hào)E157-58），TNF-α（腫瘤壞死因子）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，產(chǎn)品貨號(hào)：E158-65），采用雙抗體夾心ELISA 法，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)OD 值，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中IL-18 和TNF-α 的濃度。

1.5 16S rRAN 測(cè)序檢測(cè)腸道菌群多樣性 治療后采集患者糞便樣本，使用DNA 提取試劑盒（QIAamp DNA Stool Mini Kit；貨號(hào)51504）從樣品中提取腸道微生物基因組DNA。細(xì)菌16SrDNA 的引物如下：上游引物為5’-GTGCCAGCMGCCGCTTTAA-3’，下游引物為5’-GGAGGCHVGGGTWTCTAAT-3’。細(xì) 菌16S rDNA 的V4 區(qū)，文庫(kù)是使用New England Biolabs NEB Next?UltraTM DNA Library Prep Kit 構(gòu) 建Illumina 文 庫(kù)構(gòu)建的。在Illumina MiSeq 高通量測(cè)序平臺(tái)上使用雙端（PE）方法完成測(cè)序。生物信息學(xué)分析及質(zhì)量控制由QIIME2 軟件包執(zhí)行，以挑選符合要求的高質(zhì)量讀數(shù)，操作命令選取相似度大于97%的序列，并將其聚類為操作分類單元（OTU）。核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目（RDP）軟件包用于同源比對(duì)，以及OTUs 最長(zhǎng)16S rDNA 序列片段的種屬分類鑒定。該數(shù)據(jù)庫(kù)在http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi 上引用了Greenbank。所得UniFrac 距離矩陣用于執(zhí)行主坐標(biāo)分析以確定樣本組/時(shí)間點(diǎn)之間的相似性，從種、屬水平結(jié)果以PCA 圖、柱狀圖、箱線圖等展示其差異性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0 所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，若符合正態(tài)分布用t檢驗(yàn)，否則用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 2 組臨床療效結(jié)果比較 見(jiàn)表1。

表1 2 組臨床療效結(jié)果比較（n =30） 例

2.2 2 組間中醫(yī)證候積分比較 見(jiàn)表 2。

表2 -1 2 組中醫(yī)證候積分分級(jí)比較

綜上，經(jīng)秩和檢驗(yàn)，2 組治療前后比較，咳嗽、呼吸困難、胸痛中醫(yī)證候評(píng)分具有顯著性差異（P＜0.05）；治療后組間比較結(jié)果表明，研究組優(yōu)于對(duì)照組；研究組咳嗽、呼吸困難、胸痛中醫(yī)證候評(píng)分前后對(duì)比下降明顯，自身前后對(duì)照有顯著差異（P＜0.05），詳見(jiàn)表2-2。

表2 -2 研究組中醫(yī)證候積分治療前后比較（，n =30）

表2 -2 研究組中醫(yī)證候積分治療前后比較（，n =30）

2.3 2 組生存質(zhì)量比較 2 組認(rèn)知功能、角色功能、軀體功能及情緒功能評(píng)分均高于治療前，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；研究組認(rèn)知功能、角色功能、軀體功能及情緒功能評(píng)分提升幅度明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 2 組生存質(zhì)量比較（，n =30）

表3 2 組生存質(zhì)量比較（，n =30）

注：與治療前比較，# P ＜0.05；與對(duì)照組比較，△P ＜0.05

2.4 2 組血清IL-18 和TNF-α 水平比較 2 組治療后血清IL-18 和TNF-α 水平均低于治療前（P＜0.05），研究組血清IL-18和TNF-α水平下降幅度更大（P＜0.01），見(jiàn)表4。

表4 2 組血清IL-18 和TNF-α 水平比較（，n =30）

表4 2 組血清IL-18 和TNF-α 水平比較（，n =30）

注：與治療前比較，## P ＜0.01；與對(duì)照組比較，△△P ＜0.01

2.5 2 組不良反應(yīng)比較 研究組發(fā)熱5 例，腎功異常3 例，消化癥狀4 例，對(duì)照組發(fā)熱5 例，腎功異常3 例，消化癥狀3 例。2 組不良反應(yīng)總發(fā)生率無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.6 腸道菌群多樣性比較分析 Alpha 多樣性分析，治療后對(duì)照組腸道Shannon 指數(shù)低于研究組（2.244±0.61 與2.774±0.60），t=12.901，P＜0.001），提示對(duì)照組腸道微生態(tài)多樣性小于研究組（見(jiàn)圖1）。Beta 多樣性分析，PCA 分析提示對(duì)照組的腸道菌群結(jié)構(gòu)與研究組存在差異（R2=0.17，P＜0.001），PC1貢獻(xiàn)率為22.00%，PC2 貢獻(xiàn)率為14.00%（見(jiàn)圖2）。腸道菌群構(gòu)成優(yōu)勢(shì)菌群為，厚壁菌門(mén)（firmicutes）、擬桿菌門(mén)（bacteroidetes）、變形菌門(mén)（proteobacteria），其中研究組厚壁菌門(mén)構(gòu)成比較對(duì)照組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.516，P＜0.001），見(jiàn)圖 3。在屬水平上，研究組的鏈球菌（streptococcus）構(gòu)成比較對(duì)照組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖 4。通過(guò)LefSe 差異性分析共分析出6 種不同分類水平的細(xì)菌，其中研究組以厚壁菌門(mén)（firmicutes），梭菌綱clostridia，梭菌目（clostridiales）為優(yōu)勢(shì)菌群，對(duì)照組以γ-變形桿菌綱（gammaproteobacteria），腸桿菌科（enterobacteriaceae），腸桿菌目（enterobacteriales）為優(yōu)勢(shì)菌群（見(jiàn)圖5）。

圖1 Alpha 多樣性（）

圖2 Beta 多樣性PCA 分析

圖3 2 組微生物分布柱狀圖（門(mén)水平）

圖4 2 組微生物分布柱狀圖（屬水平）

圖5 LDA 評(píng)分（log10）

3 討論

惡性胸腔積液常為晚期肺癌較為嚴(yán)重的并發(fā)癥。在美國(guó)，惡性胸腔積液的年發(fā)病率約15萬(wàn)～17.5萬(wàn)人，在我國(guó)約為24 萬(wàn)人[9]。惡性胸腔積液加重了咳嗽、呼吸困難、胸痛等癥狀嚴(yán)重影響生活[10-13]。肺癌并發(fā)惡性胸腔積液患者多因免疫低下伴隨全身多發(fā)轉(zhuǎn)移而無(wú)法手術(shù)切除治療，臨床多采取放化療、胸腔內(nèi)閉式引流注入藥物等對(duì)癥治療，可一定程度緩解癥狀，但預(yù)后欠佳[4,14-19]。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，惡性胸腔積液屬于“支飲”“懸飲”等范疇，病因多是由于痰、瘀、毒之邪氣結(jié)聚于經(jīng)絡(luò)臟腑，久則正氣損傷，虛實(shí)夾雜，導(dǎo)致臟腑功能出現(xiàn)失調(diào)，從而引起氣血津液樞機(jī)不利，造成三焦阻滯、水飲積結(jié)。本研究采用真武湯加地龍聯(lián)合順鉑注射液治療惡性胸腔積液，觀察其對(duì)血清IL-18、TNF-α 和腸道菌群的影響。據(jù)報(bào)道中醫(yī)藥對(duì)防治惡性胸腔積液有積極作用并取得了不錯(cuò)的臨床療效，值得進(jìn)一步挖掘加以提高[20-25]。

白介素18（IL-18，也稱為干擾素-γ 誘導(dǎo)因子）是一種分泌蛋白，是促炎細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)T 細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，還可以促進(jìn)其他細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-8、GM-CSF 及一氧化氮等的生成[26-28]。TNF-α是一種可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子，對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性的細(xì)胞因子，由多種細(xì)胞分泌，包括脂肪細(xì)胞、B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、活化的單核細(xì)胞，主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，引起腫瘤細(xì)胞壞死（細(xì)胞腫脹、細(xì)胞器破壞、細(xì)胞裂解）和細(xì)胞凋亡（細(xì)胞收縮、凝聚體形成、DNA 斷裂）[29-30]。2 組治療后血清IL-18 和TNF-α 水平均低于治療前，組間比較結(jié)果表明，研究組血清IL-18 和TNF-α 水平下降幅度更大。中藥治療后腸道微生態(tài)多樣顯著增加，其中以厚壁菌門(mén)（firmicutes)，梭菌綱clostridia，梭菌目（clostridiales）為優(yōu)勢(shì)菌群，抑制了γ-變形桿菌綱（gammaproteobacteria），腸桿菌科（enterobacteriaceae），腸桿菌目（enterobacteriales）的豐度（見(jiàn)圖5）。結(jié)果表明真武湯加地龍聯(lián)合長(zhǎng)春瑞濱和順鉑能夠有效改善肺癌并發(fā)惡性胸腔積液患者臨床癥狀，提升臨床治療效果，并且藥物不良反應(yīng)較輕，改善腸道菌群多樣性，治療后患者生存質(zhì)量顯著改善。長(zhǎng)春瑞濱和順鉑為臨床常用一種治療惡性胸腔積液的藥物，其作用機(jī)制主要為結(jié)合腫瘤細(xì)胞中DNA 并破壞其功能。