楊廣惠 潘慧敏 查麗芬 顧 俊

1.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南通 226001；2.南通大學(xué)附屬丹陽市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇丹陽 212300

肺癌是全球發(fā)病排名第二、死亡排名第一的惡性腫瘤，2020 年新發(fā)病例220.7 萬例，死亡179.6 萬例，我國新發(fā)和死亡病例分別為81.6 萬例、71.5 萬例[1]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌最常見的類型，晚期患者5 年生存率不足20%[2-3]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA，可作為癌基因或抑癌基因參與多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[4]。研究報(bào)道，lncRNA膜相關(guān)鳥苷酸激酶包含WW 和PDZ 結(jié)構(gòu)域2-反義RNA 3（membrane associated guanylate kinase，WW，and PDZ domain containing two-antisense RNA three，MAGI2-AS3）在乳腺癌、膀胱癌中低表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展密切相關(guān)[5-6]。已有研究報(bào)道，lncRNA MAGI2-AS3在NSCLC 中表達(dá)下調(diào)[7-8]。基于此，本研究分析lncRNA MAGI2-AS3 與NSCLC 患者病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年8 月至2018 年8 月于南通大學(xué)附屬丹陽市人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治的103 例NSCLC 患者，年齡42～82 歲，平均（58.74±10.26）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理確診為NSCLC；②初診且未接受放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①造血免疫系統(tǒng)損害；②嚴(yán)重心肝腎等臟器疾??；③病理資料和隨訪資料有缺失；④年齡＜18 歲；⑤合并其他惡性腫瘤。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（18-11024）。

1.2 研究方法

術(shù)中切除的部分癌組織和距離癌組織＞5 cm 的癌旁組織，立即經(jīng)液氮冷凍保存，取出保存的組織標(biāo)本50 mg，研碎，TRIzol 試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司，批號(hào)：20160025）提取組織中總RNA，Narodrop 驗(yàn)證DNA 濃度及純度，使光密度（optical density，OD）260/OD280為1.8～2.0；TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20169769S）轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增。lncRNA MAGI2-AS3 正向引物：5’-CACCTTGCTTGACAACTTGA-3’；反向引物：5’-CATTACAGCTCGGCTACTGC-3’，長度121 bp；內(nèi)參GAPDH 正向引物：5’-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3’；反向引物：5’-GCGCCCAATACGACCAAATC-3’，長度168 bp。反應(yīng)體系共20 μl：2 μl cDNA，0.6 μl 正向引物，0.6 μl 反向引物，10 μl SYBR?Premix Ex TaqTMⅡMix，6.8 μl 雙蒸水。反應(yīng)條件：1 次95℃10 min，40 次95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s。采用2－ΔΔCt法計(jì)算lncRNA MAGI2-AS3 相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.3 隨訪

根據(jù)lncRNA MAGI2-AS3 表達(dá)均值將患者分為高lncRNA MAGI2-AS3 表達(dá)組（≥lncRNA MAGI2-AS3表達(dá)均值）和低lncRNA MAGI2-AS3 表達(dá)組（＜lncRNA MAGI2-AS3 表達(dá)均值）。兩組出院后通過門診或電話方式隨訪3 年，隨訪至2021 年8 月，統(tǒng)計(jì)兩組生存情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)；Kaplan-Meier法繪制NSCLC 患者生存曲線，組間生存率采用logrank 檢驗(yàn)；多因素Cox 回歸分析NSCLC 患者預(yù)后影響因素。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 組織與癌旁組織中l(wèi)ncRNA MAGI2-AS3表達(dá)比較

NSCLC 組織中l(wèi)ncRNA MAGI2-AS3 表達(dá)（0.434±0.079）低于癌旁組織（0.969±0.245），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.075，P ＜0.001）。

2.2 lncRNA MAGI2-AS3 表達(dá)與NSCLC 患者病理參數(shù)的關(guān)系

不同TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者lncRNA MAGI2-AS3 表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 lncRNA MAGI2-AS3 表達(dá)與NSCLC 患者病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 lncRNA MAGI2-AS3 表達(dá)與NSCLC 患者生存時(shí)間的關(guān)系

隨訪3～36 個(gè)月，中位生存時(shí)間為28.095 個(gè)月。高lncRNA MAGI2-AS3 表達(dá)組（≥0.434，51 例）中位生存時(shí)間為30.991 個(gè)月，低lncRNA MAGI2-AS3 表達(dá)組中位生存時(shí)間為25.309 個(gè)月。兩組生存曲線比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（log-rank χ2=5.127，P=0.024）。見圖1。

圖1 兩組生存曲線

2.4 NSCLC 患者預(yù)后影響因素的多因素Cox 回歸分析

以隨訪時(shí)間為時(shí)間變量，以年齡（≥60 歲=1，＜60 歲=0）、分化程度（低未分化=1，中高分化=0）、TNM 分期（Ⅲ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（是=1，否=）、lncRNA MAGI2-AS3（≥0.434=1，＜0.434=0）、預(yù)后（死亡=1，存活=0）為因變量。多因素Cox 回歸分析顯示，腫瘤分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、lncRNA MAGI2-AS3 表達(dá)水平是NSCLC 患者預(yù)后不良的影響因素（P ＜0.05）。見表2。

表2 NSCLC 患者預(yù)后影響因素的多因素Cox 回歸分析

3 討論

NSCLC 是一種侵襲性、生長迅速的惡性腫瘤，早期表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、疼痛、體重減輕，但大多患者早期無明顯癥狀常于晚期確診，總體生存率較低。近年來隨著腫瘤分子生物學(xué)的進(jìn)展，出現(xiàn)了靶向和免疫療法，極大地延長了NSCLC 患者生存期，但僅部分患者臨床獲益，同時(shí)隨著治療時(shí)間的延長，獲得性耐藥越來越多[9-11]。近期一項(xiàng)關(guān)于晚期（Ⅲb～Ⅳ期）NSCLC患者真實(shí)世界研究報(bào)道，接受免疫患者1、2、3 年生存率分別為61.1%、16.5%、12.7%，相比未接受免疫治療患者，接受免疫患者1、2、3 年死亡風(fēng)險(xiǎn)比分別為2.15、1.23、1.00[12]。提示隨著治療時(shí)間延長，免疫療效降低，亟須尋找更多治療靶點(diǎn)。

表觀遺傳改變是惡性腫瘤最大特征之一，其異常改變與腫瘤發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[13-14]。lncRNA 是一類長度超過200 個(gè)核苷酸的新興表觀遺傳調(diào)控分子，不僅能通過類似機(jī)制調(diào)控表觀遺傳通路本身的基因，還能通過競爭性結(jié)合特定蛋白或微RNA（micro RNA，miRNA），形成分子海綿效應(yīng)，調(diào)控癌細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程[15-17]。如lncRNA 長基因間非蛋白編碼RNA 240 能通過海綿miR-7-5p 上調(diào)表皮生長因子受體表達(dá)促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞侵襲和遷移[18]。lncRNA DNA 損傷激活的非編碼RNA 能通過海綿miR-363-3p 上調(diào)富集偽足的非典型激酶1 表達(dá)促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲[19]。lncRNA MAGI2-AS3 定位于人染色體7q21.11，近年多項(xiàng)研究均報(bào)道了其與腫瘤的關(guān)系，如Li 等[20]研究報(bào)道，lncRNA MAGI2-AS3 在胃癌中高表達(dá)，能通過海綿miR-141 和miR-200a 上調(diào)溴結(jié)構(gòu)域蛋白4 促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。Liu 等[21]研究報(bào)道，lncRNA MAGI2-AS3 在肝癌中低表達(dá)，能靶向miR-23a-3p 調(diào)控第10 號(hào)染色體缺失磷酸酶及張力蛋白同源基因抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。本研究結(jié)果顯示，NSCLC 組織中l(wèi)ncRNA MAGI2-AS3 表達(dá)明顯降低，與既往研究報(bào)道一致[7]。進(jìn)一步分析顯示，lncRNA MAGI2-AS3 表達(dá)與NSCLC 患者TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示lncRNA MAGI2-AS3 在NSCLC 中發(fā)揮抑癌基因作用，lncRNA MAGI2-AS3 低表達(dá)導(dǎo)致NSCLC 惡性進(jìn)展，其機(jī)制可能與lncRNA MAGI2-AS3 能調(diào)節(jié)張力蛋白同源基因表達(dá)有關(guān)。張力蛋白同源基因是一種具備雙重特性磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，其脂質(zhì)磷酸酶能通過催化磷酯酰肌醇3，4，5-三磷酸去磷酸化為磷酯酰肌醇4，5-二磷酸，阻斷磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，阻止細(xì)胞快速生長和分裂，抑制NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲行為和促進(jìn)凋亡[22-23]。Hao 等[24]研究報(bào)道，lncRNA MAGI2-AS3 能通過海綿miR-23a-3p 上調(diào)張力蛋白同源基因表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞活力和侵襲。本研究還發(fā)現(xiàn)，與lncRNA MAGI2-AS3 低表達(dá)組比較，lncRNA MAGI2-AS3 高表達(dá)組中位生存時(shí)間延長，lncRNA MAGI2-AS3 高表達(dá)是NSCLC 患者預(yù)后不良的影響因素，顯示lncRNA MAGI2-AS3 可作為NSCLC患者預(yù)后評(píng)估指標(biāo)，可能成為一種新型的靶點(diǎn)。

綜上所述，NSCLC 組織中l(wèi)ncRNA MAGI2-AS3 低表達(dá)，與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良有關(guān)，可作為NSCLC 患者預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。但這還需前瞻性多中心研究證實(shí)，并進(jìn)一步從分子方向研究lncRNA MAGI2-AS3 對(duì)NSCLC 患者預(yù)后的影響，了解其具體調(diào)控關(guān)系。