王維 沈艷 范亞楠 周迎春 劉華 王軍 王倩 苗文萍 何長(zhǎng)生

（安徽省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心 230091)

布魯氏菌?。˙rucellosis，簡(jiǎn)稱“布病”）是由布魯氏菌引起的一種人畜共患傳染病，感染后會(huì)引起懷孕母畜流產(chǎn)、不孕、乳腺炎；公畜睪丸炎、不育等臨床癥狀[1-2]。該病呈全球性流行，羊、牛和豬等家畜均為易感動(dòng)物。我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B 類流行病[3]。

我國(guó)根據(jù)各地布病流行情況，結(jié)合人間病例的發(fā)病情況，將全國(guó)分為三類區(qū)域。安徽省作為布病二類地區(qū)，在布病防控中采取監(jiān)測(cè)凈化與申報(bào)免疫相結(jié)合的防控措施[4-5]。

由于布病病原學(xué)檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全水平要求高，并存在一定的感染風(fēng)險(xiǎn)，而血清學(xué)檢測(cè)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，感染風(fēng)險(xiǎn)低，適用性廣，在基層布病監(jiān)測(cè)工作中被廣泛應(yīng)用[6]。目前，在日常防控工作中，主要采用虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（iELISA）與競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（cELISA）等血清學(xué)檢測(cè)方法。本研究通過采用不同的血清學(xué)檢測(cè)方法，對(duì)已知感染情況的87 份羊血清進(jìn)行布魯氏菌抗體檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)各種方法進(jìn)行評(píng)估，嘗試提出一種合理的血清學(xué)檢測(cè)方法組合方案，以期在布病申報(bào)免疫及檢測(cè)凈化工作中提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測(cè)試劑

虎紅平板凝集抗原、試管凝集抗原、布魯氏菌病標(biāo)準(zhǔn)陽性與陰性血清，購自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司；布魯氏菌競(jìng)爭(zhēng)ELISA 檢測(cè)試劑盒，購自青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心；布魯氏菌抗體快速檢測(cè)試劑卡，購自北京世紀(jì)元亨公司。以上試劑均按要求存放，并處于效期內(nèi)。

1.1.2 血清樣本

血清樣本為本中心保存的已知感染情況的羊血清樣本87 份。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

96 孔酶標(biāo)儀，Bio-Rad 公司產(chǎn)品；37℃恒溫生化培養(yǎng)箱，哈爾濱市東明醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；單道微量移液器和多道微量移液器，Transferpette 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)方法

1.2.1.1 虎紅平板凝集試驗(yàn)

對(duì)全部樣品進(jìn)行RBT 檢測(cè)，操作與結(jié)果判定按照《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T18646-2018）進(jìn)行。

1.2.1.2 試管凝集試驗(yàn)

對(duì)全部樣品進(jìn)行RBT 檢測(cè)，采用常量法與微量法兩種不同的檢測(cè)方法，操作與結(jié)果判定按照《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T18646-2018）進(jìn)行。

1.2.1.3 競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

對(duì)全部樣品用cELISA 方法檢測(cè)，具體步驟按說明書進(jìn)行。

1.2.1.4 布魯氏菌抗體定量檢測(cè)試紙條檢測(cè)

對(duì)全部樣品采用GICA 檢測(cè)，根據(jù)其各自說明書進(jìn)行操作和結(jié)果判定。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析與處理

檢測(cè)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用假陽性率、假陰性率、一致率和Kappa 值4 種分析指標(biāo)。

假陽性率：即確證陰性中檢測(cè)結(jié)果為陽性的占比。

假陰性率：即確診陽性中檢測(cè)結(jié)果為陰性的占比。

一致率：試驗(yàn)判定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)診斷結(jié)果相同數(shù)占總檢測(cè)數(shù)的比例。

符合程度依據(jù)一致性檢驗(yàn)結(jié)果（Kappa 值）判定。相關(guān)參考文獻(xiàn)顯示：若0.81≤Kappa 值≤1.0，說明兩種方法的診斷結(jié)果一致程度為極高；若0.61≤Kappa 值＜0.81，說明兩種方法的診斷結(jié)果一致程度為高；若0.41≤Kappa 值＜0.61，說明兩種方法的診斷結(jié)果一致性一般；若0.21≤Kappa 值＜0.41，說明兩種方法的診斷結(jié)果一致性較差；若Kappa 值＜0.21，說明兩種方法的診斷結(jié)果不一致[7]。

2 結(jié)果

2.1 RBT、SAT、cELISA 與GICA 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用RBT、SAT、cELISA 與GICA 分別對(duì)87 份已知感染情況的羊血清樣品（53 份陽性、34 份陰性）進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果（表1）顯示，經(jīng)RBT 檢測(cè)，陽性樣本數(shù)量為54 份，陰性樣本數(shù)量為33 份；經(jīng)SAT（常量法）檢測(cè)，陽性樣本數(shù)量為50 份，陰性樣本數(shù)量為37 份；經(jīng)SAT（微量法）檢測(cè)，陽性樣本數(shù)量為51 份，陰性樣本數(shù)量為36 份；經(jīng)cELISA 檢測(cè)，陽性樣本數(shù)量為50 份，陰性樣本數(shù)量為37 份；經(jīng)GICA 檢測(cè)，陽性樣本數(shù)量為55 份，陰性樣本數(shù)量為32 份。

表1 RBT、SAT、cELISA 與GICA 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.2 RBT、SAT、cELISA 與GICA 的敏感性、特異性與一致性的比較

由表2 可知，RBT 的敏感性、特異性分別為90.57%、82.35%；SAT（常量法）的敏感性、特異性分別為92.45%、97.06%；SAT（微量法）的敏感性、特異性分別為96.23%、100%；cELISA 的敏感性、特異性分別為94.34%、100%；GICA的敏感性、特異性分別為94.34%、95.29%。其中RBT 的敏感性與特異性都比較差，SAT 與cELISA 的敏感性、特異性相對(duì)更優(yōu)，同樣作為初篩方法的GICA 敏感性與特異性都比RBT更加優(yōu)良。

表2 RBT、SAT、cELISA 與GICA 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較

假陽性與假陰性方面，RBT 的假陰性率與假陽性率都相對(duì)較高，分別為17.65%、9.43%；GICA 的假陽性率偏高；相較而言，SAT（常量法）、SAT（微量法）與cELISA 的準(zhǔn)確性與一致性更好。

經(jīng)Kappa 檢驗(yàn)可以看出，RBT 與GICA 的Kappa 值均小于0.81，與真實(shí)結(jié)果一致程度為高；而SAT 與cELISA 的Kappa值均大于0.81，與真實(shí)結(jié)果一致程度為極高。

3 結(jié)論與討論

從上述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，RBT 的敏感性與特異性都相對(duì)較低，相關(guān)研究也表明，RBT 會(huì)因?yàn)橐呙缑庖呋蚪徊娣磻?yīng)等因素而產(chǎn)生假陽性結(jié)果，同時(shí)亦會(huì)因前帶現(xiàn)象而產(chǎn)生假陰性[8]，但由于其操作簡(jiǎn)便，所需實(shí)驗(yàn)設(shè)備較少而被廣泛應(yīng)用于布病的初篩檢測(cè)中[9]。需要注意的是，應(yīng)用RBT 對(duì)臨床樣本檢測(cè)時(shí)，由于各廠家生產(chǎn)的平板凝集抗原滴度不同，針對(duì)某些弱陽性樣本，可能會(huì)產(chǎn)生不同的檢測(cè)結(jié)果。為消除RBT 檢測(cè)方法的缺陷，在實(shí)際工作中推薦選用SAT 與ELISA 方法中的一種或多種進(jìn)行復(fù)核檢測(cè)，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

免疫膠體金檢測(cè)技術(shù)是基于抗原抗體檢測(cè)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)，在生物醫(yī)學(xué)的各領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[10]。通過本研究可以看出，與RBT 相比，GICA 的敏感性更好，但特異性較為一般。在實(shí)驗(yàn)操作與檢測(cè)結(jié)果判定過程中，受主觀因素與外界環(huán)境因素的影響更少，具有檢測(cè)敏感性更高，所需血清量更少，檢測(cè)樣本類型更多樣等優(yōu)點(diǎn)[11]。因此，GICA 比RBT 更適合未來布病初篩實(shí)驗(yàn)。

《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T18646-2018）新增加了SAT（微量法）作為布病血清學(xué)檢測(cè)確診方法，從試驗(yàn)結(jié)果中可以看出，SAT 的敏感性較低，但特異性較高，適合在陽性樣本復(fù)核及布病凈化監(jiān)測(cè)等情況下選用。同時(shí)，在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，微量法所需試劑耗材較少，可以在96 孔稀釋板上進(jìn)行操作，與常量法相比，更加適合大量的臨床樣本確認(rèn)工作。在結(jié)果判定時(shí)，微量法將孔底凝集情況作為判定標(biāo)準(zhǔn)，比常量法更加易于實(shí)驗(yàn)員觀察判定。

cELISA 于2018 年被納入我國(guó)布病法定檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法的敏感性、特異性及與正確結(jié)果一致性都比較優(yōu)良，具有操作簡(jiǎn)便、判定標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)確、重復(fù)性好、單次試驗(yàn)可完成大量樣本等優(yōu)點(diǎn)[12]。在臨床樣本檢測(cè)過程中，cELISA 的檢測(cè)結(jié)果更加穩(wěn)定可靠[13]。但因各廠家檢測(cè)試劑的試驗(yàn)靈敏度與閾值線的設(shè)定各不相同，不同品牌檢測(cè)試劑的檢測(cè)結(jié)果無法直接進(jìn)行參考比較，因此，在臨床診斷中，需結(jié)合動(dòng)物臨床癥狀進(jìn)行科學(xué)判定為宜。

在布魯氏菌病防控工作中，實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果可作為臨床診斷與疫病凈化消除的參考依據(jù)。檢測(cè)方法的敏感性越高，對(duì)識(shí)別陽性動(dòng)物越有利，特異性越高，可有效減少我們對(duì)疫病的誤診，從而進(jìn)一步降低凈化與撲殺過程中的成本。而當(dāng)檢測(cè)方法的檢測(cè)性能較差時(shí)往往會(huì)導(dǎo)致疫病誤診與漏診，對(duì)研判疫情存在狀況與維護(hù)公共衛(wèi)生安全等工作產(chǎn)生各種不利影響。從上述檢測(cè)結(jié)果中不難發(fā)現(xiàn)，若僅選用某種血清學(xué)檢測(cè)方法，很容易導(dǎo)致誤診或漏診。因此，在布病臨床診斷與疫病凈化過程中，要合理選擇聯(lián)用不同的檢測(cè)方法，根據(jù)當(dāng)?shù)匾卟×餍星闆r，采用垂直試驗(yàn)或平行試驗(yàn)進(jìn)一步提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

近年來，安徽省人布病病例數(shù)與動(dòng)物布病抗體檢測(cè)陽性數(shù)日益增加，《國(guó)家動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫指導(dǎo)意見（2022-2025年）》（農(nóng)牧發(fā)〔2022〕 1 號(hào)）中要求各地根據(jù)評(píng)估情況以縣為單位確定本省份的布病免疫區(qū)，各場(chǎng)戶可根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行備案，采取布病疫苗免疫。種種跡象表明，未來布病診斷工作面臨著更加復(fù)雜多變的形勢(shì)與挑戰(zhàn)。血清學(xué)檢測(cè)方法存在的一個(gè)共性問題是無法有效鑒別感染抗體與免疫抗體。因此，在布病控制與凈化工作中，既要科學(xué)選用血清學(xué)檢測(cè)方法，也應(yīng)結(jié)合動(dòng)物臨床癥狀及免疫情況，考慮使用病原學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行進(jìn)一步的判定。