高巖松 朱道仙施潔 徐小琴

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 225300)

近年來(lái)，我國(guó)寵物犬慢性腎衰病例越來(lái)越多，該病治療成本高、周期長(zhǎng)、并發(fā)癥多，對(duì)寵物診療提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[1]。因此，如何延緩CRF 進(jìn)程，提高患犬的生活質(zhì)量成為寵物臨床上的一個(gè)難題。研究表明，腸道菌群紊亂可促進(jìn)慢性腎臟疾病的發(fā)展[2]，慢性腎病患者服用產(chǎn)短鏈脂肪酸（SCFAs）的益生菌或攝入SCFAs 能降低尿毒素和氧化應(yīng)激水平、保護(hù)殘腎功能和提高生活質(zhì)量[3,4]。陸江等發(fā)現(xiàn)，慢性腎衰犬腸道菌群發(fā)生改變，且會(huì)促進(jìn)慢性腎衰發(fā)生發(fā)展，提示腸道菌群可能成為犬慢性腎衰治療的潛在新靶點(diǎn)[5]。大黃素是中藥大黃的主要成分，臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，中藥大黃灌腸能減少尿毒癥毒素并改善腎臟功能。但其作用機(jī)制仍不清楚。因此，本試驗(yàn)從腸道菌群及其代謝物角度研究大黃素對(duì)犬慢性腎衰的治療效果及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選擇16 條5 歲左右體重（5kg±1）kg 的犬，試驗(yàn)前飼喂基礎(chǔ)日糧7d 后，各犬按照20mg/kg 體重肌肉注射慶大霉素，連續(xù)10d，若血清肌酐（Cr）及臨床癥狀無(wú)明顯變化，則按40mg/kg 體重間隔12h 重復(fù)給藥，直至血清Cr＞270μmol/L，尿素氮（UN）升高，停止用藥。隨機(jī)等分為2 組：慢性腎衰對(duì)照組和試驗(yàn)組。試驗(yàn)期間所有犬環(huán)境條件、基礎(chǔ)日糧、飼養(yǎng)管理相同，試驗(yàn)組在飼喂基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上，按30mg/kg 體重口服給予大黃素，試驗(yàn)期30d。

1.2 生產(chǎn)性能觀察

每天記錄采食量、體溫、心率、腹瀉情況、體重等生理活動(dòng)變化。

1.3 菌群結(jié)構(gòu)及代謝產(chǎn)物檢測(cè)

分別在試驗(yàn)第10、20、30d 經(jīng)直腸采集無(wú)菌糞便，通過(guò)RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)各組犬腸道菌群中細(xì)菌種類及數(shù)量。采用糞樣細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取糞樣細(xì)菌總DNA，吸取2μL 作為擴(kuò)增樣本，分別加入各目標(biāo)細(xì)菌引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，回收各細(xì)菌電泳條帶作為陽(yáng)性模板，采用RT-PCR 法檢測(cè)各目標(biāo)腸道細(xì)菌的拷貝數(shù)，使用Log (copies) 表示，引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。同時(shí)采用氣相色譜法檢測(cè)短鏈脂肪酸。

表1 不同細(xì)菌RT-PCR 引物序列

1.4 血液中肌酐（Cr) 和尿素氮（UN) 含量測(cè)定

分別在試驗(yàn)的10、20、30d，經(jīng)頭靜脈采血，分離血清，用試劑盒法檢測(cè)Cr 與UN 含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA 程序t 檢驗(yàn)分析進(jìn)行比較。p＜0.05 表示差異顯著，p＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 大黃素對(duì)慢性腎衰犬臨床癥狀的影響

由圖1 可知，慢性腎衰對(duì)照組犬采食量及體重顯著低于試驗(yàn)組（p＜0.05），嘔吐及腹瀉發(fā)生率高于試驗(yàn)組（p＜0.05）。試驗(yàn)期間，慢性腎衰對(duì)照組有3 只動(dòng)物死亡，試驗(yàn)組無(wú)動(dòng)物死亡。

圖1 各組犬的臨床表現(xiàn)（*,p＜0.05）

2.2 大黃素對(duì)慢性腎衰犬腸道菌群的影響

由圖2 可知，隨著飼喂時(shí)間推移，慢性腎衰對(duì)照組犬腸道中雙歧桿菌及乳酸桿菌的數(shù)量逐步降低，而大腸桿菌的數(shù)量逐漸升高。給予大黃素后可回調(diào)這些細(xì)菌的變化。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)組雙歧桿菌數(shù)和乳酸桿菌數(shù)顯著高于慢性腎衰慢性腎衰對(duì)照組（p＜0.01），大腸桿菌數(shù)顯著低于慢性腎衰對(duì)照組（p＜0.01）。

圖2 大黃素對(duì)慢性腎衰犬腸道菌群的影響（**，p＜0.01）

2.3 大黃素對(duì)慢性腎衰犬腸道菌群代謝產(chǎn)物的影響

由表2 可知，與慢性腎衰對(duì)照組相比，試驗(yàn)組糞中乙酸水平無(wú)變化（p＞0.05）；試驗(yàn)組丙酸水平在第20 和30 天時(shí)分別顯著升高（p＜0.05）；試驗(yàn)組丁酸水平在第20 和30 天時(shí)分別顯著升高（p＜0.05）。

表2 大黃素對(duì)慢性腎衰犬腸道菌群代謝產(chǎn)物的影響 單位：μmol/g

2.4 大黃素對(duì)慢性腎衰犬腎功能的影響

由圖3 可知，隨著慢性腎衰的發(fā)展，血清肌酐和尿素氮含量逐漸升高。給予大黃素可以降低慢性腎衰犬血清中肌酐和尿素氮含量。

圖3 大黃素對(duì)慢性腎衰犬腎功能的影響（**，p＜0.01）

3 結(jié)論與討論

肌酐和尿素氮是機(jī)體代謝的產(chǎn)物，并經(jīng)過(guò)腎臟排出體外，當(dāng)腎臟衰竭時(shí)血液中的肌酐和尿素氮排出受阻，導(dǎo)致在血中積聚，因此它們是反映腎功能的重要指標(biāo)。在本試驗(yàn)第10 天，對(duì)照組與試驗(yàn)組的血清肌酐和尿素氮均高于犬的正常參考范圍，表明慢性腎衰造模成功。隨著腎衰的發(fā)展，肌酐和尿素氮有升高趨勢(shì)，而給予大黃素干預(yù)后，二者含量有降低趨勢(shì)，說(shuō)明大黃素可改善慢性腎衰患犬的腎功能。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群紊亂可導(dǎo)致腸道細(xì)菌極其有害代謝物進(jìn)入血液循環(huán)，通過(guò)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、腎臟纖維化及血管損傷等途徑參與了慢性腎衰的進(jìn)展[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性腎衰患犬腸道中雙歧桿菌及乳酸桿菌等有益菌減少，大腸桿菌等有害菌增多，糞中丙酸丁酸含量降低；大黃素可提高慢性腎衰犬腸道中雙歧桿菌及乳酸桿菌等有益菌數(shù)量，減少大腸桿菌數(shù)量，提高糞中短鏈脂肪酸水平，提示腸道菌群紊亂在犬慢性腎衰過(guò)程可能也發(fā)揮重要作用，大黃素改善犬慢性腎衰的作用可能與調(diào)節(jié)腸道菌群及其代謝物有關(guān)。