孫雨晴 汪晶晶 盧進昌 吳超民 杜春玲 周磊

肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，是男性人群中因惡性腫瘤致死的第一位疾病，而在女性人群中則位列第二[1]。盡管一些西方國家的肺癌發(fā)病率呈下降趨勢，但中國肺癌的發(fā)病率仍在上升，成為一個重大的公共衛(wèi)生問題，給社會和經(jīng)濟發(fā)展帶來沉重負擔(dān)[2]。小細胞肺癌(SCLC)雖僅占所有肺癌的15%，但危害極大[3]。如未接受積極治療，SCLC患者的5年生存率低于5%，平均總生存期僅為2～4個月[4]。由于缺乏特定的癥狀且腫瘤生長快速，確診時大部分患者已有遠處轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)治療的機會。目前免疫、靶向治療等方法在SCLC中取得了較大進展，但化療仍是SCLC一線和二線治療的標(biāo)準方案[5-7]。SCLC對化療的敏感性總體較高，多數(shù)患者在初始治療后可獲得不同程度的緩解，但復(fù)發(fā)耐藥率極高，一旦復(fù)發(fā)耐藥，患者預(yù)后極差。因此，闡明SCLC化療耐藥機制，提高SCLC化療敏感性是目前亟待解決的重要問題。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1(FOXM1)是Fox轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，在多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展和耐藥的產(chǎn)生過程中具有重要作用。研究顯示，F(xiàn)OXM1在DNA損傷后修復(fù)(DDR)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。FOXM1參與DNA堿基切除修復(fù)、同源重組、DNA連接等多種DDR過程，從而介導(dǎo)惡性腫瘤細胞對化療藥物耐藥[8]。既往有研究報道FOXM1在SCLC中有過量表達，并在SCLC對染料木黃酮耐藥的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。我們推測FOXM1也有可能是SCLC化療耐藥過程中的關(guān)鍵因子，因此，開展本研究驗證這一假設(shè)。

材料與方法

1.材料：人SCLC細胞株H446(中國科學(xué)院上海細胞所)；噻唑藍溴化四唑(MTT)試劑(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司)；引物合成(美國Invitrogen公司)；放射免疫沉淀測定(RIPA)細胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；FOXM1一抗(美國Abcam公司)；GAPDH一抗(武漢三鷹公司)。

2.方法

(1)細胞培養(yǎng)：人SCLC細胞株H446培養(yǎng)條件：37 ℃、5%CO2、10%胎牛血清及RPMI1640培養(yǎng)基。采用順鉑(DDP)濃度梯度法建立對順鉑耐藥的H446細胞株(H446/DDP)。

(2)構(gòu)建FOXM1基因真核過表達載體和細胞轉(zhuǎn)染：收集對數(shù)期H446/DDP細胞，加入1 ml Trizol振蕩混勻，裂解細胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在Genbank中查到FOXM1基因的mRNA序列，采用Primer Premier5.0軟件在其閱讀框內(nèi)設(shè)計引物。所用引物序列(由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成)：FOXM1-F：5’-AAAGAATTCATGAAAACTAGCCCCCGTC-3’；FOXM1-R：5’-AAAGGATCCCTACTGTAGCTCAGGAATAAACT-3’。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，回收純化目的基因條帶，并與pMD19-T Vector(購自Takara公司)連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，擴增后提取質(zhì)粒，EcoRI、BamHI雙酶切正確的質(zhì)粒送測序以驗證目的基因的準確性。將測序正確的質(zhì)粒和pCDH表達質(zhì)粒載體經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切處理，分別形成線性載體和目的片段，瓊脂糖凝膠電泳后分別切膠回收、純化；然后進行連接反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，提取質(zhì)粒。再次進行EcoRI和BamHI雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒進行測序以確認目的基因的完整性和準確性?？瞻纵d體未插入DNA片段。FOXM1基因過表達載體和空白載體質(zhì)粒采用Lipofectamin 2000(ThermoFisher)轉(zhuǎn)染細胞。細胞轉(zhuǎn)染前24 h按照每孔約5×105個細胞的密度接種至6孔板中，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，待細胞長至90%～95%匯合，分別將4.0 μg質(zhì)粒DNA和10 μl Lipofectamin 2000與250 μl不加血清的opti-MEM培養(yǎng)液輕柔混勻，室溫孵育20 min后滴加到含有2 ml無抗生素RPMI1640培養(yǎng)基的6孔板細胞中，混勻后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h。然后更換為含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h后進行檢測。

(3)RNA干擾和細胞轉(zhuǎn)染：設(shè)計合成靶向FOXM1的小干擾RNA(siRNA，由上海生工公司合成)和陰性對照RNA，序列分別為FOXM1 siRNA(5’-GCCGGAACAUGACCAUCAATT-3’；終濃度為100 nM)和陰性對照RNA(5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；終濃度為100 nM)；siRNA采用Interferin轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染過程按照說明書進行，簡述如下：在12孔培養(yǎng)皿中接種適量H446細胞和H446/DDP細胞，培養(yǎng)12 h后匯合率達30%～50%；在不同1.5 ml無菌Ep管中分別加入100 μl無血清培養(yǎng)基，再分別加入5 μl Interferin和FOXM1 siRNA(H446-siFOXM1組、H446/DDP-siFOXM1組)或陰性對照RNA(H446-NC組、H446/DDP-NC組)并振蕩混勻，室溫放置15～20 min；將RNA-脂質(zhì)體復(fù)合物滴加至細胞孔板中，置于5%CO2、37 ℃孵育箱培養(yǎng)6～8 h；然后更換為新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h；收集細胞。

(4)MTT比色法測定細胞存活率:分別收獲對數(shù)生長中期、生長狀態(tài)良好的H446和H446/DDP細胞，用細胞培養(yǎng)液制成單細胞懸液，整細胞液濃度為5×104個/ml。每孔接種5×103個細胞/100 μl，每組設(shè)5個平行孔；每孔加入100 μl DDP(用無血清培養(yǎng)基溶解)使其終濃度為0、2、4、8、16 μM；藥物處理48 h后，向每孔加入新鮮配制的MTT液(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μl，振蕩10 min，結(jié)晶物充分溶解后在酶聯(lián)免疫檢測儀上用490 nm波長檢測光密度值。

(5)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測FOXM1及FOXM1下游基因CDC25B、survivin和cyclin B1 mRNA的表達水平:將細胞用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗后加入1 ml Trizol試劑，搖勻后裂解提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成互補DNA(cDNA)，進行qRT-PCR檢測。人GAPDH上游5’-ACAACTTTGGTATCGTGGA-3’，下游3’-GCCATCACGCCACAGTTTC-5’；人FOXM1上游5’-AAGAACTCCATCCGCCACA-3’，下游3’-GCTTAAACACCTGGTCCAA-5’；人CDC25B上游5’-TCAAATATCAGTTACCCAC-3’，下游3’-TCCATCCGCAACAAGACA-5’；人survivin上游5’-AACCAGACCCTCATGGCTG-3’，下游3’-TTCCCAGACTCCACTCCAA-5’;人cyclin B1上游5’-GTTGGTTTCTGCTGGGTG-3’，下游3’-ATGTTGATCTTCGCCTT-5’。所有引物均由美國invitrogin公司合成。PCR反應(yīng)平臺采用美國羅氏公司LightCycler?480Ⅱ，參數(shù)：95 ℃ 30 s×1個循環(huán)，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s×40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認qRT-PCR的擴增曲線和溶解曲線，并進行數(shù)據(jù)分析。

(6)蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測FOXM1蛋白的表達水平:細胞離心漂洗后，加入RIPA細胞蛋白裂解液，離心取上清，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒計算各組標(biāo)本的蛋白質(zhì)濃度。以12% SDS-PAGE凝膠先恒壓60 V使蛋白質(zhì)跑至同一條起跑線上，待跑至分離膠上時，改為90 V，使溴酚藍全部跑出時停止。電泳結(jié)束后，開始轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜的條件為恒流220 mA、2 h，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜；次日一抗回收并清洗后，使用HRP標(biāo)記二抗孵育1 h。經(jīng)發(fā)光劑顯影成像，進行圖片掃描。

結(jié) 果

1.H446和H446/DDP細胞存活率及FOXM1基因mRNA、蛋白表達水平比較：DDP濃度越高，H446和H446/DDP細胞存活率越低。當(dāng)DDP濃度為4、8、16 μM時，H446/DDP細胞存活率高于H446細胞(P<0.05或P<0.01)；當(dāng)DDP濃度達到8 μM時，H446/DDP細胞存活率仍高于50%[(53.82±3.39)%]，而H446細胞存活率僅為(25.17±5.04)%，見圖1。H446/DDP細胞FOXM1基因mRNA、蛋白表達水平均高于H446細胞(2.34±0.11比1.10±0.03，P<0.01；1.49±0.06比1.02±0.09，P<0.01)。

注：與H446細胞比較，aP<0.05，bP<0.01

2.轉(zhuǎn)染不同載體H446細胞FOXM1基因mRNA和蛋白表達水平比較及轉(zhuǎn)染不同載體H446/DDP細胞存活率比較：FOXM1過表達載體轉(zhuǎn)染H446細胞FOXM1基因mRNA和蛋白表達水平均高于轉(zhuǎn)染空白載體H446細胞(5.84±1.06比1.00±0.10，P<0.01；2.98±0.46比1.00±0.11，P<0.01)。FOXM1過表達載體轉(zhuǎn)染H446/DDP細胞存活率低于轉(zhuǎn)染空白載體H446/DDP細胞[(48.58±6.47)%比(75.95±4.62)%，P<0.01]。

3.不同組別細胞FOXM1基因mRNA和蛋白表達水平、存活率及FOXM1下游基因CDC25B、survivin和cyclin B1 mRNA表達水平比較：H446-siFOXM1組FOXM1基因mRNA和蛋白表達水平低于H446-NC組，細胞存活率高于H446-NC組(P<0.01)；H446/DDP-siFOXM1組FOXM1基因mRNA和蛋白表達水平低于H446/DDP-NC組，細胞存活率高于H446/DDP-NC組(P<0.01)。H446/DDP-NC組CDC25B、survivin和cyclin B1 mRNA表達水平均高于H446-NC組(P<0.01)；H446/DDP-siFOXM1組CDC25B、survivin和cyclin B1 mRNA表達水平均高于H446-siFOXM1組(P<0.01)。見表1。

表1 不同組別細胞FOXM1基因mRNA和蛋白表達水平、存活率及FOXM1下游基因CDC25B、survivin和cyclin B1 mRNA表達水平比較

討 論

傳統(tǒng)上，按照美國退伍軍人協(xié)會制定的標(biāo)準，SCLC可分為局限期和廣泛期[10]。美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)的TNM系統(tǒng)更適合于篩選出適合手術(shù)治療的SCLC患者。但無論根據(jù)哪種分期方法，僅無縱隔和鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的TNM分期Ⅰ期的局限期患者有可能可接受手術(shù)治療。而沒有手術(shù)機會的廣泛期患者約占所有新診斷的SCLC的65%，其治療方案選擇非常有限。根據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)臨床實踐指南:小細胞肺癌(2022.V2)及中國臨床腫瘤學(xué)會小細胞肺癌診療指南2022，以鉑類藥物為基礎(chǔ)的雙藥化療聯(lián)合免疫治療方案是廣泛期患者的一線治療方案[11-12]。二線治療方面，日本的一項研究顯示，由順鉑、依托泊苷、伊立替康3種藥物組成的聯(lián)合化療較伊立替康單藥化療患者的總生存期(OS)有所延長(18.2個月比12.5個月,P=0.007 9)[13]。針對細胞毒性T淋巴細胞抗原(CTLA)-4或程序性死亡受體-配體1(PD-L1)免疫治療和靶向Delta樣經(jīng)典 Notch 配體 3(DLL3)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等小分子激酶抑制劑也取得了一些進展[14-16]。程序性死亡受體-1(PD-1)/PD-L1單克隆抗體的成功臨床試驗為惡性腫瘤免疫學(xué)開辟了新的途徑。Paz-Ares等[17]的一項隨機、對照、開放的3期臨床研究結(jié)果顯示，Durvalumab+順鉑/卡鉑+依托泊苷顯著改善了廣泛期SCLC患者的OS。雖然免疫治療已躋居SCLC治療的一線方案，但以含鉑類藥物為基礎(chǔ)的雙藥聯(lián)合化療方案仍是SCLC治療的重要手段，其位置不可替代。

順鉑是SCLC最廣泛使用的抗腫瘤細胞的化療藥物。含順鉑的化療方案可顯著延長患者的OS。大部分SCLC患者經(jīng)初始治療可獲得疾病緩解或控制，但多數(shù)患者在4～6個周期后出現(xiàn)疾病進展，意味著肺癌細胞對化療藥物出現(xiàn)耐藥，而二線治療效果很差。因此，研究SCLC化療耐藥的機制，探索其中發(fā)揮關(guān)鍵作用的靶點，可能有助于開發(fā)逆轉(zhuǎn)SCLC化療耐藥的治療策略，也有助于制定個體化的治療方案，從而提高療效并最大程度減少不良反應(yīng)。既往研究結(jié)果顯示，促使SCLC化療耐藥的主要機制包括DNA損傷修復(fù)異常(DDR)、細胞自噬異常等[18]。FOXM1是在DDR過程中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，其可通過轉(zhuǎn)錄活化DNA聚合酶，PolE2、復(fù)制因子C4(RFC4)，并作為DNA連接酶Ⅲ的共作用因子參與DNA堿基切除修復(fù)、同源重組、DNA連接等多種DDR過程[19]。FOXM1通過直接調(diào)控G1/S和G2/M進展所必需的轉(zhuǎn)錄信號網(wǎng)絡(luò)，在細胞增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用，特別是對細胞周期基因的積極調(diào)控[20]。下調(diào)FOXM1基因表達顯著改善卵巢癌、非小細胞肺癌(NSCLC)對順鉑的耐藥性[19,21]。除此之外，F(xiàn)OXM1還參與惡性腫瘤的血管形成、遠處轉(zhuǎn)移等多個重要環(huán)節(jié)，并與多種惡性腫瘤患者的預(yù)后明顯相關(guān)[22-24]。SCLC組織中同樣出現(xiàn)FOXM1表達水平明顯升高，并與患者的不良預(yù)后相關(guān)，包括生存期和化療耐藥性。Liang等[20]發(fā)現(xiàn)，與低FOXM1表達組相比，高FOXM1表達組SCLC與晚期臨床分期、胸外轉(zhuǎn)移及OS降低顯著相關(guān)(7.90個月比12.46個月)。此外，高FOXM1表達組在標(biāo)準化療后的無進展生存期更短(3.90個月比8.69個月)。Liu等[25]的研究證實，F(xiàn)OXM1過表達可降低NSCLC對順鉑的敏感性，而FOXM1表達下調(diào)可使對順鉑耐藥的NSCLC細胞對順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡敏感，表明過表達FOXM1與NSCLC中順鉑耐藥性有關(guān)。

Tian等[9]的研究結(jié)果顯示，染料木黃酮可通過抑制FOXM1通路的過度活化發(fā)揮對SCLC的抗腫瘤作用，上調(diào)SCLCH446細胞FOXM1表達水平，H446細胞可出現(xiàn)對Genistein耐藥，表明FOXM1可介導(dǎo)SCLC對化療藥物的耐藥過程。提示FOXM1有可能在SCLC順鉑耐藥中發(fā)揮重要作用。本研究通過對順鉑耐藥的SCLC細胞系H446/DDP的研究發(fā)現(xiàn)，與順鉑敏感的H446細胞相比，H446/DDP細胞中FOXM1基因mRNA和蛋白的表達水平均顯著增加；而抑制H446/DDP細胞中FOXM1表達，則可顯著抑制其對順鉑的耐藥性。上調(diào)FOXM1表達水平則可使化療敏感的SCLC細胞出現(xiàn)耐藥，表明FOXM1是SCLC順鉑耐藥過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

事實上，F(xiàn)OXM1是調(diào)控細胞增殖和凋亡的重要轉(zhuǎn)錄因子，在細胞從G1期向S期進化和維持染色體穩(wěn)定性方面起關(guān)鍵作用。FOXM1通過激活其靶基因CDC25A、CDC25B、cyclinB1、cyclinD1、PLK1及抑制p21、p27等的表達調(diào)控細胞周期進展，促進惡性腫瘤的發(fā)生[26]。Nestal de Moraes等[27]發(fā)現(xiàn)，survivin是FOXM1的直接轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，在乳腺癌耐藥細胞系中，F(xiàn)OXM1和survivin的表達明顯上調(diào)，將FOXM1基因敲除后會導(dǎo)致survivin的表達下降，表明FOXM1可能直接調(diào)控survivin參與惡性腫瘤的耐藥[27]，與本研究結(jié)果一致。Kongsema等[28]研究發(fā)現(xiàn)，硫鏈絲菌素可顯著抑制乳腺癌細胞生長，并可明顯降低FOXM1及cyclin B1的表達水平，這一效應(yīng)存在明顯的藥物濃度依賴性，提示靶向FOXM1/cyclin B1通路可能發(fā)揮抗腫瘤作用。綜合以上研究結(jié)果，推測FOXM1具有成為逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐藥治療靶點的巨大潛力。同時，本研究也存在一些不足之處，針對FOXM1介導(dǎo)SCLC順鉑耐藥的機制，本研究發(fā)現(xiàn)順鉑耐藥細胞株中CDC25B、survivin和cyclin B1表達水平顯著升高，提示這些下游信號可能與FOXM1介導(dǎo)SCLC順鉑耐藥有關(guān)，與上述研究報道一致，但未能進一步闡明其具體作用及其與DDR異常的關(guān)系。這些問題將在今后的研究中進一步探討。

綜上所述，F(xiàn)OXM1基因在SCLC順鉑耐藥細胞中表達顯著上調(diào)，且通過正向調(diào)控其下游靶向基因介導(dǎo)細胞的耐藥，表明FOXM1是SCLC順鉑耐藥過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可為開發(fā)新的SCLC治療方案提供新靶點和方向。