吳金嫻 劉曉燕 黎鑫琦 梅恒 周芙玲

急性髓系白血病(AML)是一組由造血干/祖細(xì)胞獲得性遺傳或表觀遺傳病變引起的異質(zhì)性克隆性疾病[1-3]。骨髓移植是治愈AML的有效途徑，但費(fèi)用高昂。大多AML患者仍采用化療治療，但疾病易復(fù)發(fā)，預(yù)后不佳，提高治療效果并改善預(yù)后是亟待解決的問(wèn)題[4]。越來(lái)越多的證據(jù)支持骨髓微環(huán)境異常對(duì)AML發(fā)生發(fā)展有重要影響，白血病可重塑骨髓微環(huán)境，促進(jìn)白血病細(xì)胞自身增殖耐藥[5]。骨髓微環(huán)境由間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)纖維、微血管網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞外基質(zhì)組成[6]。MSC在一定條件下，具有分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的潛力。骨髓MSC在正常和異常造血過(guò)程中起著重要作用，但其潛在的分子機(jī)制尚不清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)異常骨髓微環(huán)境可成為AML發(fā)生和維持的始動(dòng)因素。骨髓微環(huán)境通過(guò)自身重塑誘導(dǎo)AML發(fā)生或促進(jìn)疾病進(jìn)展。如微環(huán)境中交感神經(jīng)病變破壞MSC穩(wěn)態(tài)平衡，MSC過(guò)度增殖而逐漸耗竭，早期成骨細(xì)胞分化增加，而成熟成骨細(xì)胞生成降低，以致骨小梁數(shù)量減少，骨結(jié)構(gòu)破壞。由內(nèi)皮細(xì)胞組成的微小動(dòng)脈和血竇密度則會(huì)增加，且結(jié)構(gòu)紊亂。MSC中細(xì)胞因子如趨化因子12(CXCL12)、干細(xì)胞因子(SCF)表達(dá)水平下降[3]。不同于正常造血干細(xì)胞，白血病干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持對(duì)CXCL12、SCF依賴(lài)較小，所以微環(huán)境的重塑抑制了正常造血，促進(jìn)了AML的進(jìn)展。但是關(guān)于AML患者骨髓MSC(AML-MSC)的潛在分子改變?nèi)绾未龠M(jìn)白血病發(fā)生的機(jī)制仍存在爭(zhēng)議。本研究將在細(xì)胞和分子水平上對(duì)AML-MSC和健康人骨髓MSC(HD-MSC)之間的生物學(xué)變異進(jìn)行多方面比較，提供骨髓微環(huán)境調(diào)控AML的新證據(jù)，為AML治療提供新的視角，尋找治療潛在靶點(diǎn)。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象：2020年1月～6月于武漢大學(xué)中南醫(yī)院血液內(nèi)科初診為AML患者4例，其中男2例，女2例，中位年齡34歲，白血病分型為M2、M5。納入同期于我院體檢的健康者4例，其中男2例，女2例，中位年齡32歲。白血病細(xì)胞株HL-60購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫(kù)，人骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離液購(gòu)自天津TBD公司，人骨髓MSC完全培養(yǎng)基、人骨髓MSC成骨培養(yǎng)基和人骨髓MSC成脂培養(yǎng)基均購(gòu)自廣州賽業(yè)公司，Trizol試劑購(gòu)自中國(guó)諾唯贊，人CD45抗體、CD90抗體、CD73抗體、CD34抗體和CD44抗體均購(gòu)自biolegend，人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1、趨化因子8(CXCL8)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、白細(xì)胞介素(IL)-1β、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購(gòu)自CUSABIO，凋亡試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物，阿糖胞苷購(gòu)自賽德薩。本研究經(jīng)武漢大學(xué)中南醫(yī)院研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

2.方法

(1)人骨髓MSC分離與培養(yǎng)：抽取所有受試者骨髓血2～3 ml，置于抗凝管中，低溫保存。用巴氏管沿管壁加入2～3 ml等體積骨髓分離液。以550 g的離心力離心25 min后，吸取單個(gè)核細(xì)胞層。用10 ml MSC培養(yǎng)基重懸單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)至10 cm培養(yǎng)皿中。3 d后換液去除未貼壁細(xì)胞，以后每3 d換液1次，直至貼壁的MSC長(zhǎng)滿(mǎn)10 cm培養(yǎng)皿，進(jìn)行傳代。

(2)人骨髓MSC表面抗原表達(dá)水平檢測(cè)：取傳至第3代人骨髓MSC，分為AML-MSC組和HD-MSC組，分別加入以PE標(biāo)記的CD34、CD44和CD45、FITC標(biāo)記的CD90、APC標(biāo)記的CD73各流式抗體2 μl,孵育后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞CD34、CD44、CD45、CD90、CD73表面抗原表達(dá)水平。根據(jù)MSC國(guó)際定義標(biāo)準(zhǔn),骨髓MSC不表達(dá)CD34、CD45(陽(yáng)性率均在5%以下)，表達(dá)CD44、CD90、CD73(陽(yáng)性率在95%以上)[7]。

(3)人骨髓MSC的成骨分化及成脂分化：將兩組人骨髓MSC按照說(shuō)明書(shū)要求配置相關(guān)試劑，并對(duì)其進(jìn)行成骨分化及成脂分化誘導(dǎo)。成骨誘導(dǎo)14～21 d后，用茜素紅染色鑒定成骨分化情況。成脂誘導(dǎo)10 d后，用油紅O染色鑒定成脂情況。

(4)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：用Trizol試劑從AML-MSC和HD-MSC中提取總RNA。RNA文庫(kù)的制備和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由天津諾和公司進(jìn)行。P<0.05和|log2(FoldChange)|>0的基因被認(rèn)為是差異表達(dá)基因(DEGs)。本研究使用clusterProfiler R package對(duì)差異基因進(jìn)行基因本體論(GO)富集分析和京都基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析。閾值<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

(5)ELISA法檢測(cè)MSC上清液中細(xì)胞因子水平：收集第3代AML-MSC和HD-MSC的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照指示準(zhǔn)備試劑、樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行孵育，在每孔中加入50 μl的停止液。5 min內(nèi)在450 nm處讀取OD值代表細(xì)胞因子表達(dá)水平。檢測(cè)TGF-β1、CXCL8、VEGF、IL-1β、GM-CSF與IL-6的表達(dá)水平。

(6)AML-MSC與白血病細(xì)胞株HL-60共培養(yǎng)：將HL-60分為兩組，共培養(yǎng)組為HL-60與AML-MSC共培養(yǎng)，不共培養(yǎng)組僅為HL-60，調(diào)整細(xì)胞的密度為1×106/ml，接種于6孔板中，加入阿糖胞苷使之終濃度為1 μM，培養(yǎng)48 h后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞凋亡情況。

結(jié) 果

1.兩組細(xì)胞分離與培養(yǎng)情況：所有受試者的骨髓血經(jīng)過(guò)密度梯度離心后獲得單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后部分細(xì)胞貼壁，約15 d細(xì)胞融合至80%，可進(jìn)行傳代，連續(xù)傳5～6代細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生變化，7代后開(kāi)始老化。選取第3代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)AML-MSC組與HD-MSC組細(xì)胞在形態(tài)上沒(méi)有差異，均顯示出典型的紡錘形(圖1)。

圖1 兩組細(xì)胞分離與培養(yǎng)情況

2.兩組細(xì)胞成骨和成脂分化情況：用成骨和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基在體外對(duì)MSC進(jìn)行誘導(dǎo)，經(jīng)茜素紅染色，可見(jiàn)橘紅色的鈣結(jié)節(jié)，說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生礦化，成骨分化基本完成(圖2A、B)。經(jīng)油紅O染色后，可見(jiàn)細(xì)胞胞漿內(nèi)布滿(mǎn)大小不一的紅色脂滴顆粒，提示成脂分化基本完成(圖2C、D)。AML-MSC組與HD-MSC組細(xì)胞在體外均完成成骨分化與成脂分化。

圖2 兩組細(xì)胞成骨和成脂分化情況(A、B：成骨分化；C、D：成脂分化；A、C：AML-MSC組；B、D：HD-MSC組；×200)

3.兩組細(xì)胞表面抗原表達(dá)水平比較：流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示分離所得的AML-MSC與HD-MSC均為純度較高的骨髓MSC，其表面抗原表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 兩組細(xì)胞表面抗原表達(dá)水平比較

4. 兩組細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序情況：以P<0.05和|log2(FoldChange)|>0作為標(biāo)準(zhǔn)篩選AML-MSC和HD-MSC之間差異基因。通過(guò)比較AML-MSC與HD-MSC RNA-seq共檢測(cè)到563個(gè)DEGs，其中262個(gè)上調(diào)，301個(gè)下調(diào)。為進(jìn)一步了解已識(shí)別的DEGs影響通路和過(guò)程，分別進(jìn)行GO和KEGG分析。使用clusterProfiler Rpackage對(duì)上述563個(gè)差異基因進(jìn)行GO分析。生物過(guò)程(BP)改變可能與DNA生物合成過(guò)程的正向調(diào)控、蛋白磷酸化、成纖維細(xì)胞遷移的正向調(diào)控等途徑有關(guān)；細(xì)胞組成(CC)變化與核復(fù)制、焦點(diǎn)粘連等途徑有關(guān)；分子功能(MF)改變主要涉及細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)成分、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合等。本研究隨后進(jìn)行KEGG分析，結(jié)果顯示通路KEGG主要富集于吞噬體、感染、細(xì)胞因子受體相互作用等通路。見(jiàn)圖4。

圖4 兩組細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序情況(A:DEGs的火山圖譜;B:DEGs的熱圖;C:GO分析柱狀圖;D:DEGs的KEGG分析氣泡圖)

5.兩組細(xì)胞上清液細(xì)胞因子水平比較：AML-MSC組中TGF-β1、CXCL8、VEGF水平均高于HD-MSC組(P<0.05)，而IL-1β、GM-CSF與IL-6水平在兩組細(xì)胞間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子水平比較

6.AML-MSC與白血病細(xì)胞株HL-60共培養(yǎng)后細(xì)胞凋亡的情況比較：共培養(yǎng)組活細(xì)胞比例(63.19%±2.38%)高于不共培養(yǎng)組(47.32%±3.17%，P<0.05)。

討 論

MSC在骨髓微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，其異常改變可能導(dǎo)致AML的發(fā)生和發(fā)展。越來(lái)越多的證據(jù)表明，骨髓微環(huán)境異?？赡苁茿ML發(fā)生和維持的起始因素。骨髓微環(huán)境通過(guò)自我重塑誘導(dǎo)AML進(jìn)展和化療耐藥性[3]。因此，了解AML-MSC的異常變化，有助于探索骨髓微環(huán)境異常與AML之間的作用機(jī)制，并為治療AML尋找新的靶點(diǎn)。

異常骨髓微環(huán)境能引起造血干細(xì)胞遺傳或信號(hào)通路變化。Blau等[8]對(duì)AML患者進(jìn)行染色體分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30%～70%AML患者M(jìn)SC發(fā)生染色體異常改變，且MSC基因組變化往往伴隨造血干細(xì)胞中不利于AML預(yù)后的染色體異常改變[9]。此外有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，AML-MSC生長(zhǎng)能力受損，并伴特定的甲基化特征，對(duì)正常造血干細(xì)胞支持減少，AML-MSC異常改變導(dǎo)致MDS和AML造血功能不足，惡性骨髓細(xì)胞和MSC之間調(diào)控明顯失調(diào)[10]。但目前對(duì)AML-MSC的大多研究都相對(duì)零散，對(duì)AML發(fā)病機(jī)制的認(rèn)知及解釋仍嚴(yán)重不足。本文通過(guò)體外培養(yǎng)AML患者與健康人骨髓MSC，首先對(duì)AML-MSC與HD-MSC在免疫表型和多項(xiàng)分化能力方面進(jìn)行比較，結(jié)果兩者顯示出相似性，與相關(guān)研究結(jié)果一致[11]。利用高通量測(cè)序和生物信息學(xué)技術(shù)共鑒定出563個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因262個(gè)，下調(diào)基因301個(gè)。KEGG富集分析顯示，通路KEGG主要富集于吞噬體、感染、細(xì)胞因子受體相互作用等通路。既往研究也有類(lèi)似結(jié)果，有研究報(bào)道這些通路與AML發(fā)病機(jī)制和預(yù)后相關(guān)[12]。值得注意的是，KEGG通路在細(xì)胞因子通路顯著富集。MSC來(lái)源炎癥相關(guān)因子也是調(diào)控AML進(jìn)展的重要因素。研究報(bào)道AML疾病進(jìn)展與MSC來(lái)源的TGF-β1、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)及前列腺素E2(PGE2)、IL-6等細(xì)胞因子異常分泌相關(guān)[13-15]。因此，本研究通過(guò)對(duì)MSC上清液細(xì)胞因子進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AML-MSC高表達(dá)TGF-β1、CXCL8、VEGF。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)健康人MSC添加TGF-β1會(huì)使健康細(xì)胞功能受損[16]，表明MSC來(lái)源的CXCL8可通過(guò)PI3K/AKT通路促進(jìn)白血病進(jìn)展。另外，VEGF過(guò)度表達(dá)在臨床上與白血病患者的侵襲性臨床病程、化療反應(yīng)和不良預(yù)后相關(guān)[17]。這些因子可通過(guò)改變MSC自身生物學(xué)特性及調(diào)控造血干細(xì)胞中信號(hào)通路而影響AML疾病進(jìn)展。此前有研究結(jié)果顯示，AML耐藥不僅與AML細(xì)胞自身生物學(xué)特征相關(guān),且骨髓微環(huán)境在其中發(fā)揮的重要作用相關(guān)。骨髓微環(huán)境不但可通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子及細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸,保護(hù)AML細(xì)胞免受化療藥物殺傷,且可通過(guò)促進(jìn)白血病細(xì)胞生長(zhǎng),調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路以介導(dǎo)AML細(xì)胞耐藥[5]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白血病細(xì)胞與AML-MSC共培養(yǎng)后，可降低阿糖胞苷對(duì)其的殺傷作用，增加耐藥性，進(jìn)一步支持AML-MSC在AML進(jìn)展中發(fā)揮耐藥作用的觀點(diǎn)。

綜上，來(lái)自AML患者的原代骨髓MSC與來(lái)自健康供體的正常骨髓MSC相比，顯示出不同的細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄水平，AML-MSC增加白血病細(xì)胞的耐藥性，為研究MSC促進(jìn)AML進(jìn)展提供新的證據(jù)與研究思路。