陳建華，李 雪，趙 建，朱洪賡，王海華，朱 明

1. 江蘇海洋大學(xué)/江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 連云港 222005

2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室，廣東 廣州 510380

3. 江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所/南昌市特種水產(chǎn)繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，江西 南昌 330039

鹽度是與魚類生活密切相關(guān)的非生物環(huán)境因子之一，對魚類正常生理活動具有重要影響[1-2]。當(dāng)水體鹽度發(fā)生變化時，魚體內(nèi)滲透壓平衡將被打破，從而對魚類胚胎發(fā)育[3]、幼魚存活[4]、體內(nèi)酶活性[5]及激素水平[6]等產(chǎn)生影響。研究表明，過高[7]或過低[8-9]的水體鹽度均不利于魚類胚胎正常發(fā)育，導(dǎo)致孵化時間延長，孵化率降低及畸形率升高等。水體鹽度的變化也與魚類生長性能和成活率存在緊密聯(lián)系，適當(dāng)鹽度 (3 和 5 ng·L?1) 有利于提高斑點叉尾鮰 (Ictalurus punctatus) 幼魚的生長性能和成活率，但當(dāng)鹽度達(dá)9 ng·L?1時，其成活率急劇下降[10]。江黃顙魚 (Pseudobagrus vachelliRichardson) 的生長率和成活率均隨脅迫鹽度升高而下降[11]。鹽度的急性變化對魚類的影響則更為嚴(yán)重，會引起魚類的應(yīng)激反應(yīng)，造成其內(nèi)環(huán)境的不穩(wěn)定，能量消耗大增，甚至導(dǎo)致魚類死亡。何燕富等[12]研究顯示馬來西亞紅羅非魚 (Oreochromis mossambicus×O. niloticus) 幼魚在鹽度 25 的急性鹽度脅迫下死亡率達(dá)100%。

大鱗副泥鰍 (Paramisgurnus dabryanus)隸屬于鯉形目、鰍科、副泥鰍屬，為底棲小型魚類，是我國特種淡水養(yǎng)殖品種，具有環(huán)境適應(yīng)性強、養(yǎng)殖周期短、營養(yǎng)豐富等特點。目前，有關(guān)大鱗副泥鰍的報道主要集中在系統(tǒng)分類[13]、攝食規(guī)律[14]、繁殖生物學(xué)[15-16]、免疫反應(yīng)[17]、轉(zhuǎn)錄組測序[18]以及成鰍耐鹽性[19]等方面。研究顯示，鰍科魚類具有一定的耐鹽特性，其耐鹽能力高于大多數(shù)淡水魚類，可作為鹽堿水域的增養(yǎng)殖魚類[19]，但有關(guān)鹽度對大鱗副泥鰍胚胎及仔魚階段影響的報道較少；此外，我國擁有大量的鹽堿水域資源，該水域的鹽堿度高于淡水，不利于魚類等水生生物的生存[20]，極大地限制了鹽堿水域資源的利用，造成大量水域資源荒廢。本研究探討了鹽度對大鱗副泥鰍胚胎及仔魚發(fā)育的影響，深入了解其對鹽度的適應(yīng)性，以期為選育鹽堿水域養(yǎng)殖品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

從本地泥鰍產(chǎn)業(yè)園挑選健康、活力強的成鰍作為親鰍 [體長 (20±2.2) cm，體質(zhì)量 (142.5±26.4) g]，通過注射催產(chǎn)藥物后進(jìn)行人工授精獲得受精卵。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹽度對胚胎孵化及仔魚生長的影響

依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置鹽度0 (對照)、2、4、6、8、10組，每組設(shè)3個平行。各鹽度組試液均用充分曝氣的自來水與過濾的海水配制并用鹽度計校正。實驗所用容器為長 300 mm×寬 200 mm×高147 mm的塑料箱，每個塑料箱中盛入3 L相應(yīng)鹽度的實驗用水，隨機放入100枚發(fā)育至原腸期的胚胎開始實驗，直至仔魚卵黃囊完全吸收為止。實驗期間，每12 h更換1/3相應(yīng)鹽度的水體，水溫為23～24 ℃。實驗過程中用Nikon體視鏡觀察并拍攝胚胎及仔魚的形態(tài)特征，計算各組孵化率、畸形率、仔魚成活率、孵化時間、仔魚全長及特定生長率(SGR) 和卵黃囊吸收率 (R)。

式中：LT為仔魚最終全長 (μm)；L0為初孵仔魚全長 (μm)；t為仔魚孵化到實驗結(jié)束所經(jīng)歷的時間 (d)。

式中：V0為初孵仔魚卵黃囊體積；Vt為實驗結(jié)束時仔魚卵黃囊體積；t為經(jīng)歷的時間 (h)。

由于大鱗副泥鰍發(fā)育不同時期卵黃囊形狀不同，分別選取2種不同形狀時卵黃囊體積的計算公式[21-22]。當(dāng)卵黃囊成錘形時，其體積分為兩部分，即膨大部分和狹長部分，計算公式為V=L1H12π/6+L2H22π/12；當(dāng)卵黃囊成柱狀時，為V=LH2π/12。兩式中：L1為卵黃囊膨大部分長徑；L2為卵黃囊狹長部分長徑；H1為卵黃囊膨大部分短徑；H2為卵黃囊狹長部分短徑；L為卵黃囊長徑；H為卵黃囊短徑。

1.2.2 不同鹽度下不投餌存活系數(shù) (Survival activity index, SAI) 的測定

仔魚活力以SAI作為衡量指標(biāo)[23]。仔魚完全孵出后，挑選無畸形的正常仔魚50尾，放入不同鹽度 (0、2、4、6、8、10)、直徑為 20 cm 的圓形桶中靜水培育，每組設(shè)3個平行。實驗期間不投餌，每天更換1/2相應(yīng)鹽度的水體，發(fā)現(xiàn)死魚及時撈出，每日統(tǒng)計仔魚死亡情況，直至仔魚全部死亡，比較其 SAI。SAI計算公式為：

式中：N為起始的仔魚數(shù)；k為仔魚全部死亡所需時間 (d)；hi為第i天時仔魚的累計死亡數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (SD)”表示，利用SPSS 26.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析 (One-way ANOVA) 和 LSD 多重比較分析組間的差異性，P<0.05為差異顯著。柱狀圖由Origin 2018軟件繪制，圖片處理使用Photoshop 2020軟件。

2 結(jié)果

2.1 鹽度對胚胎孵化時間和孵化率的影響

胚胎在不同鹽度水體中的孵化情況見表1。胚胎孵化時間在鹽度為2和4時顯著短于其他組 (P<0.05)，之后隨著鹽度的升高其孵化時間延長并顯著長于對照組 (P<0.05)。胚胎孵化率在低鹽度 (2和4) 時略有增加，之后則隨著鹽度的增加而下降，但不同鹽度組間差異不顯著 (P>0.05)。

表1 不同鹽度下大鱗副泥鰍胚胎的孵化時間和孵化率 (±SD)Table 1 Incubation time and hatching rate of P. dabryanus at different salnities

表1 不同鹽度下大鱗副泥鰍胚胎的孵化時間和孵化率 (±SD)Table 1 Incubation time and hatching rate of P. dabryanus at different salnities

注：同行中不同字母表示差異顯著 (P<0.05)。Note:Values with different letters within the same column have significant difference (P<0.05).

指標(biāo)Index鹽度組 Salinity group對照 Control 2 4 6 8 10孵化時間Incubation time/h 26.1±0.1d 22.2±0.2e 22.1±0.3e 28.8±0.0c 31.3±0.64b 31.2±0.17a孵化率Hatching rate/% 50.67±2.5ab 51.00±4.36ab 53.67±2.1a 47.33±7.57ab 43.67±4.04b 43.33±3.79b

2.2 鹽度對仔魚畸形率和成活率 [3 日齡 (Days after hatching, dah)]的影響

仔魚畸形率隨鹽度的升高而逐漸增加，其中鹽度10組畸形率最高，為對照組的6.08倍 (圖1)。通過對仔魚形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)，在鹽度脅迫下仔魚主要出現(xiàn)尾部彎曲、短小，脊柱彎曲、圍心腔水腫及卵黃囊異常等畸形現(xiàn)象 (圖2)。仔魚出膜3 dah后，鹽度0、2、4組成活率均達(dá)90%以上，而從鹽度6組開始顯著降低，在鹽度10時幾乎全部死亡 (圖1)。

圖1 不同鹽度對大鱗副泥鰍仔魚畸形率和成活率的影響注：同一系列方柱上不同字母表示差異顯著 (P<0.05)。后圖同此。Fig. 1 Effects of different salnities on abnormality rate and survival rate of P. dabryanus larvaeNote:Different letters on the same series of columns indicate significant difference (P<0.05). The same case in the following figures.

圖2 不同鹽度對大鱗副泥鰍仔魚發(fā)育的影響Fig. 2 Effects of different salinities on development of P. dabryanus larvae

2.3 不同鹽度對仔魚生長的影響

在鹽度為2、4和6時，初孵仔魚全長顯著低于對照組 (P<0.05)，之后隨著鹽度上升而增加，其中鹽度10組的全長高于對照組 (圖3)。3 dah仔魚的全長則隨著鹽度升高而下降，其中鹽度8組的全長顯著低于對照組 (P<0.05)。大鱗副泥鰍仔魚特定生長率呈現(xiàn)先升后降的趨勢 (圖4)，其中鹽度2和4組顯著高于對照組 (P<0.05)，而鹽度8組則顯著降低 (P<0.05)。

圖4 不同鹽度對大鱗副泥鰍仔魚特定生長率的影響Fig. 4 Effects of different salinities on specific growth rate of P. dabryanus larvae

2.4 不同鹽度對仔魚卵黃囊吸收率的影響

隨著鹽度的升高，仔魚卵黃囊吸收率呈現(xiàn)先升后降的趨勢，其中鹽度2和4組仔魚卵黃囊吸收率顯著高于對照組 (圖5，P<0.05)。

圖5 不同鹽度對大鱗副泥鰍仔魚卵黃囊吸收率的影響Fig. 5 Effects of different salinities on yolk absorption rate of P. dabryanus larvae

2.5 不同鹽度對仔魚 SAI的影響

仔魚SAI隨著水體鹽度的升高先增后降 (圖6)。當(dāng)鹽度為4時SAI最高；而在鹽度8和10時SAI顯著下降 (P<0.05)。鹽度≤6時仔魚存活時間最長(9 d)；鹽度8時仔魚存活4～5 d，而鹽度10時仔魚在第3天時全部死亡。

圖6 不同鹽度對大鱗副泥鰍仔魚活力的影響Fig. 6 Effects of different salinities on survival activity index of P. dabryanus

3 討論

3.1 大鱗副泥鰍胚胎發(fā)育與鹽度的關(guān)系

鹽度是影響魚類胚胎發(fā)育的重要生態(tài)因子之一。環(huán)境鹽度的變化將影響魚類受精卵膜內(nèi)外滲透壓平衡，盡管魚類受精卵本身具有一定的滲透壓調(diào)節(jié)能力，但能力有限[24]。鹽度過高或過低會造成卵膜內(nèi)外滲透壓差變化劇烈，使膜與周圍環(huán)境之間正常的物質(zhì)交換受阻，導(dǎo)致發(fā)育中的胚胎細(xì)胞不能正常分裂或存活[25]，引起胚胎發(fā)育畸形甚至死亡，最終影響到胚胎孵化率[26-27]。本研究中，胚胎孵化率在低鹽度 (2和4) 時略有增加，之后隨著鹽度增加而下降，這可能是在適鹽范圍內(nèi)，通過卵內(nèi)原生質(zhì)層調(diào)節(jié)使受精卵內(nèi)滲透壓保持相對穩(wěn)定[28]，從而使胚胎具有較高的孵化率；但隨著水體鹽度的升高，卵膜內(nèi)外滲透壓差超過胚胎的調(diào)節(jié)能力范圍，導(dǎo)致其胚胎孵化率下降。

魚類胚胎孵化出膜主要依靠孵化酶作用和胚體運動，前者使卵膜溶解減薄[29]。有研究表明，孵化酶的活性受環(huán)境因子的影響，如底鳉 (Fundulus grandis) 孵化酶具有嗜鹽性，當(dāng)鈉離子(Na+)強度低于0.05 mol·L?1時，在 18 h 內(nèi)酶的活力便會喪失 50%，但添加氯化鈉 (NaCl) 可使其在 48 h 內(nèi)恢復(fù)活性[30]。本研究中，在較低鹽度時胚胎孵化時間縮短，而隨著鹽度升高其孵化時間則明顯延長。這種情況在尖鰭鯉 (Cyprinus acutidorsalis)[31]和廣東魴 (Megalobrama hoffmanni)[32]中也存在，適當(dāng)?shù)乃w鹽度能夠縮短孵化時間，但當(dāng)鹽度超過一定范圍時，其胚胎發(fā)育則受到抑制，從而導(dǎo)致胚胎孵化時間延長。這種現(xiàn)象可能是低鹽度環(huán)境有利于激活孵化酶活性，而在較高的鹽度環(huán)境中孵化酶的活性受到破壞所致。

3.2 大鱗副泥鰍仔魚畸形率和成活率與鹽度的關(guān)系

研究表明，鹽度對早期仔魚生長有一定影響，鹽度升高可能造成仔魚畸形率上升，進(jìn)而導(dǎo)致成活率下降[33]。本研究中，從鹽度6開始大鱗副泥鰍仔魚的成活率顯著下降，在鹽度10時幾乎全部死亡；仔魚畸形率也隨鹽度的升高而逐漸增加。這說明鹽度對大鱗副泥鰍仔魚發(fā)育和成活產(chǎn)生一定影響，在適當(dāng)鹽度范圍內(nèi)仔魚成活率較高，鹽度進(jìn)一步升高則不利于發(fā)育及成活。這可能由于低鹽度更接近魚類等滲點，此時仔魚用于調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓平衡所消耗的能量較少；而在較高鹽度的水體中，由于仔魚出膜后失去了卵膜的保護(hù)作用，其滲透壓調(diào)節(jié)機制尚不完善，對環(huán)境變化的耐受力差，而且仔魚需要消耗更多能量用于維持體內(nèi)滲透壓的穩(wěn)定，導(dǎo)致其活動能力減弱，從而引起死亡率急劇上升[34]。

3.3 鹽度對大鱗副泥鰍仔魚生長發(fā)育的影響

仔魚的體生長與其發(fā)育程度密切相關(guān)[35]，早期發(fā)育階段是魚類的各種器官系統(tǒng)、生理機能形成和完善的重要時期，此時環(huán)境因子的變化極易影響其發(fā)育程度，從而影響仔魚生長[36]。本研究中，鹽度8組的3 dah仔魚全長和特定生長率均顯著降低，說明較高鹽度對大鱗副泥鰍仔魚的生長具有一定的抑制作用。這主要是因為水體鹽度升高，使仔魚發(fā)育過程中需要動用更多的能量來維持體內(nèi)滲透壓平衡，而用于仔魚生長的能量則相應(yīng)減少，從而減緩仔魚全長的增加。

仔魚在開口攝食前通過吸收卵黃囊中的營養(yǎng)維持機體發(fā)育需要，卵黃囊吸收的快慢能反映出仔魚的生長發(fā)育狀況。本研究中，鹽度2和4組仔魚卵黃囊消耗速度最快，而鹽度8低于對照組。這可能是因為低鹽度 (2和4) 有利于大鱗副泥鰍仔魚的生長發(fā)育，其生長速度相對較快，從而需要消耗更多的能量來滿足機體生長，而鹽度的升高則延遲了卵黃囊期仔魚發(fā)育，導(dǎo)致其卵黃囊吸收減慢。

初孵仔魚出膜后，在不投餌的情況下依靠卵黃囊可以存活一段時間，其存活時間長短與受精卵質(zhì)量、卵黃囊營養(yǎng)物質(zhì)數(shù)量和質(zhì)量以及仔魚生活環(huán)境等因素有關(guān)[37-38]。SAI是判斷仔魚活力、質(zhì)量好壞的常用指標(biāo)之一[39-40]。通常來說，仔魚存活時間越久，SAI越大，表明仔魚活力越好。本研究中，鹽度為0～6時，仔魚SAI較高，活力較好；而鹽度8～10時，SAI 下降明顯，表明鹽度偏高不利于大鱗副泥鰍仔魚生存，這與馮廣鵬等[41]及王宏田和張培軍[25]的研究結(jié)果相似?？赡苁且驗榈望}度條件下，仔魚用于維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定所消耗的能量較小，而更多的能量可用于機體正常生長發(fā)育。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)乃w鹽度對大鱗副泥鰍胚胎孵化及仔魚生長有一定的促進(jìn)作用，但當(dāng)鹽度高于6時則不利于其胚胎及仔魚發(fā)育。綜合各項指標(biāo)，大鱗副泥鰍胚胎發(fā)育及仔魚生長的適宜鹽度為0～4。因此，在大鱗副泥鰍苗種繁育生產(chǎn)實踐中使用適宜鹽度的孵化用水可獲得更佳的苗種生產(chǎn)效果。