王 倫，王崇懿，劉建勇

廣東海洋大學 水產(chǎn)學院，廣東 湛江 524088

凡納濱對蝦 (Litopenaeus vannamei) 又名南美白對蝦，因其具有廣鹽性、生長快、抗逆能力強、適宜高密度養(yǎng)殖等優(yōu)點，是世界三大對蝦養(yǎng)殖品種之一[1-3]。據(jù)統(tǒng)計，2020年我國凡納濱對蝦海水養(yǎng)殖產(chǎn)量達119.774萬t，占海水蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量的80.50%，是我國最主要的海水對蝦養(yǎng)殖品種[4]。對蝦生長性狀與經(jīng)濟回報高度相關(guān)，是選育最主要的目標性狀，在選育過程中需要準確估計其遺傳參數(shù)，以確保選育的可靠性。有關(guān)凡納濱對蝦生長性狀遺傳參數(shù)評估的研究已有較多報道[5-7]，由于遺傳參數(shù)估計受不同世代、不同群體、生長條件、年齡、性別等因素影響[8-10]，因此選育中有必要對生長性狀的遺傳參數(shù)進行實時“更新”。

近年來，對蝦的放養(yǎng)密度不斷增加，但高密度養(yǎng)殖會降低水環(huán)境中的pH，增加總氮和氨氮含量[11-12](對蝦高密度養(yǎng)殖氨氮質(zhì)量濃度可高達46 mg·L?1[13]，pH 低至 4.1[14])；而夏季高溫則會增加養(yǎng)殖水體中的鹽度[15-16]。生活在較高氨氮、鹽度和較低pH的水體中，對蝦會出現(xiàn)生長緩慢、免疫力下降、對病原菌的易感性升高等不良現(xiàn)象，導致其養(yǎng)殖成活率降低[17-21]。開展耐高氨氮、耐高鹽和耐低pH等抗逆性的遺傳改良是解決以上問題的有效途徑。關(guān)于高氨氮、高鹽和低pH等單因子或雙因子對凡納濱對蝦脅迫的研究已有相關(guān)報道。例如，胡志國等[22-23]對凡納濱對蝦耐高氨氮、耐鹽度的成活率與雜種優(yōu)勢及配合力進行分析；趙先銀等[24]研究了低pH脅迫對凡納濱對蝦成活率和特異性酶活力的影響；熊大林等[11,25]報道了高溫和氨氮兩因子復合脅迫對凡納對蝦滲透調(diào)節(jié)與鰓組織生理響應(yīng)的影響。在凡納濱對蝦實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，其所受的脅迫常常為多個環(huán)境脅迫因子的綜合脅迫，相比于單因子脅迫其對對蝦的危害更大，然而對凡納濱對蝦三因子綜合脅迫方面的研究尚未見報道。因此，有必要深入了解多因子綜合脅迫 (高鹽、低pH與高氨氮共同脅迫) 對凡納濱對蝦的影響。

本研究以凡納濱對蝦“興海1號”選育核心群體與國外引進的不同遺傳背景的凡納濱對蝦群體交配，成功構(gòu)建80個家系，以生長和抗逆性狀為主要選育目標，評估凡納濱對蝦生長和耐綜合脅迫(高鹽、低pH與高氨氮共同脅迫) 性狀的遺傳參數(shù)，以期為凡納濱對蝦生長和抗逆性選育提供依據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗于2020年3月在湛江市國興水產(chǎn)科技有限公司 (國興公司) 進行，所用親蝦來源于本實驗室培育的凡納濱對蝦“興海1號”核心群體，以及泰國和美國的4個引進群體。按袁瑞鵬等[26]的方法強化親蝦并建立家系。6 d內(nèi)成功構(gòu)建全同胞家系80個，育苗過程中淘汰42個，剩余38個 (均為全同胞)。孵化后，每個家系取無節(jié)幼體約3 500尾，根據(jù)標準化育苗方式于500 L的桶中獨自育至仔蝦，而后移至獨立水泥池進行標粗培育。培育至3 cm時，每個家系隨機取300尾進行熒光標記，將所有標記好的對蝦置于長13 m×寬10 m×高0.6 m 的池內(nèi)，同環(huán)境養(yǎng)殖 60 d。

1.2 高氨氮、高鹽和低 pH 綜合脅迫實驗

2019年3—7月由國興公司對凡納濱對蝦養(yǎng)殖土塘塘底水質(zhì)指標進行監(jiān)測，結(jié)果顯示，鹽度上限為35，pH下限為6。綜合脅迫預(yù)實驗：對蝦同環(huán)境養(yǎng)殖60 d后，參照袁瑞鵬[27]的方法開展高氨氮脅迫預(yù)實驗，確定同環(huán)境養(yǎng)殖60 d高氨氮脅迫48 h 半致死濃度 (LC50) 為銨根離子 120 mg·L?1，設(shè)置高鹽和低pH分別恒定為35和6±0.1[28]，將高氨氮脅迫 48 h 的 LC50(120 mg·L?1) 折中 (60 mg·L?1)往 1 mg·L?1或 120 mg·L?1方向，以間隔 1 mg·L?1依次遞減或遞增，可遞分為120個梯度，一次實驗難以完成，以40個梯度為1組 (共3組)，第1組為：鹽度和pH均為35和6±0.1，氨氮質(zhì)量濃度由 60 mg·L?1遞減 20 個 (依次為 60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41 mg·L?1)；鹽度和 pH 均為35 和 6±0.1，氨氮質(zhì)量濃度 由 60 mg·L?1遞增 20 個(依次為 61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80 mg·L?1)。其他兩個組以此類推分別繼續(xù)往前和往后遞減和遞增。3組預(yù)實驗分開進行，先分別對第1組的40個梯度開展脅迫實驗，調(diào)高鹽度、低pH及高氨氮的藥品及測量儀器分別為粗鹽 (鹽度計折射儀HT211ATC)、1 mol·L?1鹽酸 (HCl)、1 mol·L?1氫氧化鈉 (NaOH)[29](高精度pH測試筆ATC)和氯化銨(NH4Cl) 分析純晶體 (水質(zhì)分析儀W-I)。預(yù)實驗設(shè)3個重復組 (每組30尾) 于調(diào)好的實驗海水中進行，因水體中的低pH會緩慢恢復正常，故每2 h調(diào)整一次實驗海水pH并統(tǒng)計死亡數(shù)，全程保持溶解氧質(zhì)量濃度不低于 6.0 mg·L?1，時間持續(xù)至對蝦死亡過半為止。當高鹽為35、低pH為6±0.1和高氨氮質(zhì)量濃度為 70 mg·L?1時，由 SPSS 19.0 軟件算出半致死時間 (LT50) 為 47.31 h，最接近 48 h，故將該三因子濃度作為綜合脅迫的濃度 (因在第1組中便確定了綜合脅迫的濃度，故并未繼續(xù)開展第2和第3組預(yù)實驗)。

綜合脅迫正式實驗：對蝦暫養(yǎng)3 d后開始實驗[實驗對蝦體質(zhì)量 (5.21±2.16) g、體長 (77.09±11.41)mm]，由綜合脅迫預(yù)實驗確定的濃度開展正式實驗，其他脅迫條件與綜合脅迫預(yù)實驗相同，從每個家系中隨機取實驗用蝦30尾[30-31]置于小框中，于水深 30 cm 的池 (5 m×5 m) 中進行綜合脅迫。按家系排序，生長性狀與耐綜合脅迫性狀一一對應(yīng)，每2 h調(diào)一次實驗海水pH、統(tǒng)計死亡數(shù)、記錄存活時間[32]，并測量生長相關(guān)性狀 (用精度為0.01位的分析天平連接電腦自動錄入體質(zhì)量數(shù)據(jù)，數(shù)碼相機拍照后用Image J軟件測體長、頭胸甲長及腹節(jié)全長)，實驗持續(xù)至全部對蝦死亡時結(jié)束。

1.3 數(shù)據(jù)分析及遺傳參數(shù)估算

用多性狀動物模型估計生長及耐綜合脅迫性狀的遺傳參數(shù)，模型為：

式中：yijkl為第i尾蝦生長及耐綜合脅迫性狀的觀測值；μ為總體均值；ai為第i尾蝦的加性遺傳效應(yīng)； B lj為同環(huán)境養(yǎng)殖前的體長作為協(xié)變量；ck為共同環(huán)境效益； T ankl為第l個養(yǎng)殖池的固定效應(yīng)；eijkl為第i尾蝦的隨機殘差。

遺傳相關(guān)、表型相關(guān)及Z-score檢驗的計算公式參照[33-34]：

式中：rg為遺傳 (表型) 相關(guān)；σxy是兩個性狀的加性遺傳或表型協(xié)方差，是它們的加性遺傳或表型方差；xi和xj是指各性狀的遺傳力或兩性狀間的相關(guān)系數(shù)，是指相應(yīng)遺傳力或相關(guān)系數(shù)的標準誤。

利用ASReml 4軟件進行方差組分剖分及遺傳力估計，凡納濱對蝦生長相關(guān)性狀及耐綜合脅迫性狀的遺傳力用動物模型估計[35]。因剩余家系均為全同胞家系，無法準確剖分共同環(huán)境效益，此外在模型中加入養(yǎng)殖池固定效應(yīng)后，模型不收斂，故分析時將共同環(huán)境效益及養(yǎng)殖池固定效應(yīng)剔除掉。模型中并未包含性別固定效應(yīng)，因為測量體質(zhì)量時仍有大部分對蝦難以辨別性別。

2 結(jié)果

2.1 生長相關(guān)性狀及耐綜合脅迫性狀的描述性統(tǒng)計

本實驗首次嘗試以高鹽35、低pH 6±0.1和高氨氮質(zhì)量濃度 70 mg·L?1，開展凡納濱對蝦三因子綜合脅迫。結(jié)果顯示，5個性狀的變異系數(shù)為14.75%～57.51%，其中體質(zhì)量和耐綜合脅迫的變異系數(shù)較高 (41.44%和57.51%)；體長、頭胸甲長、腹節(jié)全長的變異系數(shù)分別為14.79%、15.47%和14.75% (表1)。一般線性模型分析表明，家系間生長相關(guān)性狀均存在極顯著差異 (P<0.01)；耐綜合脅迫存活時間的變化為6～88 h，家系間的差異較大，分析表明凡納濱對蝦家系間生長相關(guān)性狀及耐綜合脅迫性狀存在豐富的遺傳變異 (圖1)。此外，實驗過程中還觀察到，隨著脅迫時間的增加，對蝦表現(xiàn)出活動遲緩、側(cè)躺，用玻璃棒觸碰只有游泳足緩慢擺動；死亡對蝦腹部肌肉和鰓絲發(fā)白，肝胰腺呈淡紅褐色 (圖2)；進一步的組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，與實驗前相比，脅迫后的蝦肌肉組織纖維束的間隙變大、鰓組織腫脹、肝胰腺的管腔變?yōu)椴灰?guī)則形狀并發(fā)生溶解現(xiàn)象 (圖3)。

表1 凡納濱對蝦生長相關(guān)性狀及耐綜合性狀的描述性統(tǒng)計Table 1 Phenotypic parameters of growth traits and comprehensive tolerance traits of L. vannamei

圖1 凡納濱對蝦家系生長相關(guān)性狀箱線圖 (a—d) 及耐綜合脅迫平均存活時間箱線圖 (e)Fig. 1 Box plot of growth-related traits of L. vannamei family (a?d) and box plot of average survival time tolerant to comprehensive stress (e)

圖2 凡納濱對蝦綜合脅迫前后對比圖注：a. 綜合脅迫前的鰓；b. 綜合脅迫后的鰓；c. 綜合脅迫前的肝胰腺；d. 綜合脅迫后的肝胰腺。Fig. 2 Comparison of L. vannamei before and after comprehensive stressNone:a. Gills before comprehensive stress; b. Gills afer comprehensive stress; c. Hepatopancreas before comprehensive stress;d. Hepatopancreas afer comprehensive stress.

圖3 凡納濱對蝦綜合脅迫前后組織切片圖注：a. 綜合脅迫前的肌肉切片；b. 綜合脅迫后的肌肉切片；c. 綜合脅迫前的鰓切片；d. 綜合脅迫后的鰓切片；e. 綜合脅迫前的肝胰腺切片；f. 綜合脅迫后的肝胰腺切片。Fig. 3 Tissue sections of L. vannamei before and after comprehensive stressNote:a. Muscle section before comprehensive stress; b. Muscle section afer comprehensive stress; c. Gill section before comprehensive stress; d. Gill section afer comprehensive stress; e. Hepatopancreas section before comprehensive stress; f. Comprehensive stress posterior hepatopancreas section.

2.2 生長相關(guān)性狀及耐綜合脅迫性狀的遺傳參數(shù)

凡納濱對蝦生長相關(guān)性狀及耐綜合脅迫性狀的遺傳力見表2。生長相關(guān)性狀的遺傳力介于 (0.37±0.09)～(0.51±0.10)，為高遺傳力，其中體長的遺傳力最高(0.51±0.10)，說明生長性狀以體長進行選育能獲得較大遺傳進展；耐綜合脅迫性狀的遺傳力為0.21±0.06，遺傳力中等，Z-score檢驗表明，所有遺傳力均到達極顯著水平 (P<0.01)。

表2 凡納濱對蝦生長相關(guān)性狀與耐綜合脅迫性狀的方差組分及遺傳力Table 2 Variance components and heritability of growth traits and comprehensive stress tolerance traits of L. vannamei

凡納濱對蝦生長相關(guān)性狀及耐綜合脅迫性狀的遺傳相關(guān)及表型相關(guān)見表3。生長相關(guān)性狀間的遺傳相關(guān)和表型相關(guān)分別介于(0.54±0.13)～(0.99±0.01) 和 (0.72±0.02)～(0.94±0.01)，Z-score 檢驗均呈極顯著高度正相關(guān) (P<0.01)。生長相關(guān)性狀及耐綜合脅迫性狀間的遺傳相關(guān)和表型相關(guān)分別介于(0.11±0.23)～(0.39±0.19) 和 (0.09±0.04)～(0.23±0.04)，兩者的遺傳相關(guān)均為中、低度正相關(guān)，其中體長與耐綜合脅迫性狀間的遺傳相關(guān)性達顯著水平 (P<0.05)。

表3 凡納濱對蝦生長相關(guān)性狀與耐綜合脅迫性狀的遺傳相關(guān)及表型相關(guān)Table 3 Genetic correlation and phenotypic correlation between growth traits and comprehensive stress tolerance traits of L. vannamei

3 討論

3.1 綜合脅迫對凡納濱對蝦的毒害作用

在凡納濱對蝦實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，其所受的脅迫常常為多個環(huán)境脅迫因子的綜合脅迫，當pH下降時亞硝態(tài)氮濃度上升使毒性增強[36]；鹽度變化對氨氮也有較大影響[37]，相比于單因子脅迫其對對蝦的危害更大。因此，有必要了解多因子綜合脅迫對凡納濱對蝦的影響。高鹽、低pH和高氨氮是凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體中重要的脅迫因子，高鹽急脅迫會影響內(nèi)環(huán)境滲透壓與呼吸代謝水平及免疫功能[18,38]，長期脅迫還會抑制對蝦生長[21]；低pH脅迫會造成對蝦組織缺氧、影響機體代謝[20]和免疫功能[19]；高氨氮脅迫會降低對蝦免疫力及影響對蝦代謝水平[17]。本實驗以高鹽度為35、低pH為6±0.1 和高氨氮為 70 mg·L?1開展凡納濱對蝦三因子綜合脅迫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，綜合脅迫下對蝦的鰓絲和肌肉變白，肝胰腺呈淡紅褐色；進一步的組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，綜合脅迫會使凡納濱對蝦肌肉纖維束間隙變大、鰓組織腫脹、肝胰腺管腔變形并發(fā)生溶解現(xiàn)象。推測綜合脅迫會使凡納濱對蝦鰓、肌肉和肝胰腺受到損傷，從而造成機體缺氧、破壞內(nèi)環(huán)境滲透壓并使機體的正常代謝紊亂，使對蝦逐漸死亡，具體脅迫死亡原因還有待進一步研究。此外，在后期研究高鹽、低pH和高氨氮綜合脅迫對對蝦的分子作用機制時，可將鰓、肝胰腺和肌肉作為首選的目標器官和組織。

3.2 生長和耐綜合脅迫性狀的遺傳參數(shù)

對蝦生長性狀與經(jīng)濟回報高度相關(guān)，是育種計劃中一個非常重要的性狀。本研究中凡納濱對蝦生長相關(guān)性狀的遺傳力估計值為高遺傳力水平 [(0.37±0.09)～(0.51±0.10)]，與張嘉晨等[39]估計的凡納濱對蝦生長相關(guān)性狀的遺傳力 [(0.35±0.01)～(0.48±0.15)]基本一致，高于前幾世代的遺傳力[(0.11±0.02)～(0.23±0.05)][5]，可能是由于遺傳或環(huán)境等多種因素造成的，例如不同世代、不同群體、生長條件、年齡、性別及分析模型等[8-10]。高遺傳力 (h2)估計值與低全同胞效應(yīng) (c2) 和低遺傳力與高全同胞效應(yīng)，表明數(shù)據(jù)中加性遺傳效應(yīng)和常見環(huán)境效應(yīng)之間存在一定程度的混雜[40-41]，Castillo-Juárez等[42]報道對凡納濱對蝦收獲體質(zhì)量的全同胞效應(yīng)估計值都很小 (c2<0.1)，但不考慮全同胞效應(yīng)會導致估計的遺傳力偏高，為了更好地估計收獲體質(zhì)量的遺傳力和常見的環(huán)境影響，每尾公蝦需要更多雌蝦來產(chǎn)生更多的半同胞家系。本研究因所剩家系均為全同胞家系，無法準確剖分共同環(huán)境效益，故分析時并未包含共同環(huán)境效益。如上所述，本研究凡納濱對蝦生長相關(guān)性狀的遺傳力估計值與公布的凡納濱對蝦生長相關(guān)性狀遺傳力估計值大體一致，表明本研究中受全同胞效應(yīng)的影響小，這可能與本研究前期所建家系間年齡差異小 (1～6 d) 及后期同環(huán)境養(yǎng)殖有關(guān)，即研究中估計的遺傳參數(shù)可能接近該群體的“真實”參數(shù)。對蝦的耐受性狀是另一個重要的性狀，耐受性狀為閾值性狀，一般遺傳力較低，關(guān)于凡納濱對蝦耐受性狀在單因子脅迫方面的報道較多，Zhang等[5]報道該品種耐低溶氧性狀的遺傳力為 (0.07±0.04)～(0.15±0.07)及 Yuan 等[6]報道耐高氨氮性狀的遺傳力為 (0.13±0.11)～(0.17±0.08)；有關(guān)凡納濱對蝦耐綜合脅迫的遺傳參數(shù)未見報道，本實驗首次嘗試估計其遺傳參數(shù)，結(jié)果顯示，耐綜合脅迫性狀為中等遺傳力 (0.21±0.06) (P<0.01)，這表明通過選擇提高對蝦的綜合脅迫耐受性能是可行的。

3.3 生長和耐綜合脅迫性狀的遺傳相關(guān)

為了優(yōu)化選育工作，在任何選育計劃中都應(yīng)準確估計重要性狀之間的遺傳相關(guān)性。本研究中，生長相關(guān)性狀間的遺傳相關(guān)介于 (0.54±0.13)～(0.99±0.01) (P<0.01)，表現(xiàn)出非常高的相關(guān)性，與其他學者的研究結(jié)果一致[5-7]，這些結(jié)果表明，所有的生長性狀都可能由共同基因 (基因多效性) 控制。因此，僅選擇一種生長性狀進行改良可以同時改善育種計劃中的其他生長性狀。在本研究中生長相關(guān)性狀與耐綜合脅迫性狀的遺傳相關(guān)介于 (0.11±0.23)～(0.39±0.19)，為低到中度正相關(guān)，其中體長與耐綜合脅迫性狀的遺傳相關(guān)最高 (0.39±0.19) (P<0.05)，同體長與氨氮耐受性呈遺傳正相關(guān)[33]、生長性狀與耐低溶氧性狀呈遺傳正相關(guān)[5]、生長性狀與高氨氮耐受性呈遺傳正相關(guān)[6]的結(jié)果一致，說明對生長性狀選擇不會使耐綜合脅迫性狀衰退，還能使耐綜合脅迫性狀得到一定的改良。此外，本研究估計的生長相關(guān)性狀與耐綜合脅迫性狀遺傳相關(guān)的標準誤(SE) 均較高，與Zhang等[5]的結(jié)果相似，說明這些評估還不能非常準確地估計遺傳相關(guān)性，因此，需要對凡納濱對蝦生長性狀與耐受性狀 (耐綜合脅迫性狀) 之間的遺傳相關(guān)性進行更多的準確研究，以實現(xiàn)育種目標的進一步提高。

4 結(jié)論

本研究利用多性狀動物模型和ASReml 4軟件估計凡納濱對蝦105日齡的生長和耐綜合脅迫性狀的方差組分及遺傳參數(shù)。研究結(jié)果顯示生長和耐綜合脅迫性狀分別為高等和中等遺傳力水平；此外“生長性狀間”與“生長和耐綜合脅迫性狀間”的遺傳相關(guān)分別為高度和低到中的正相關(guān)。表明生長和耐綜合脅迫性狀均可通過選育進行遺傳改良；任何生長性狀均能被其他生長性狀替代以進行間接選擇；對生長性狀進行選育，耐綜合脅迫性狀也可獲得間接改良。