馬艷平，郝 樂(lè)，馮國(guó)清，梁志凌，馬江耀，柯 浩，劉振興

廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣東 廣州 510640

無(wú)乳鏈球菌 (Streptococcus agalactiae) 屬于 B 族鏈球菌 (GBS)，宿主范圍廣泛，能感染人類、哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物和魚類等，對(duì)全球公共衛(wèi)生和人體健康造成了嚴(yán)重的安全隱患[1-2]。中國(guó)是羅非魚(Oreochromissp.) 養(yǎng)殖大國(guó)，也是鏈球菌病高流行地區(qū)，其發(fā)病率和死亡率居高不下，居羅非魚傳染病之首，因抗生素濫用或過(guò)量添加，造成耐藥率也越來(lái)越高[3-5]。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在放線桿菌門和厚壁菌門等革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中存在一種新型分泌系統(tǒng)，即VII型分泌系統(tǒng) (Type 7 secretion system, T7SS)[6-8]。VII型分泌系統(tǒng)由多種組分構(gòu)成，分泌早期分泌性抗原靶 6 (Early secretory antigenic target 6, ESAT6)和培養(yǎng)濾液蛋白 10 (Culture filtrate protein 10,CFP10)兩種免疫原性胞外蛋白。VII型分泌系統(tǒng)具有改變細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、促進(jìn)細(xì)菌從巨噬細(xì)胞吞噬體逃逸、抑制吞噬體溶酶體融合、影響細(xì)胞凋亡及裂解細(xì)胞等生物學(xué)功能，與致病性密切相關(guān)[9-10]。分枝桿菌VII型分泌系統(tǒng)與菌株毒力密切相關(guān)，正是由于ESAT6蛋白的缺失，才使得牛型結(jié)核菌毒力缺失，成為卡介苗。目前為止，眾多研究聚焦結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis) VII型分泌系統(tǒng)，ESAT-6基因的缺失會(huì)導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌喪失分泌其他ESX-1分泌蛋白的能力，甚至喪失結(jié)核分枝桿菌致病性[9]。金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)缺失ESAT6和CFP-10編碼基因，造成金黃色葡萄球菌毒力下降，影響了該菌的持續(xù)感染[11]。

無(wú)乳鏈球菌研究顯示，ESAT6蛋白以同源二聚體形式發(fā)揮作用[12-13]。VII型分泌系統(tǒng)單個(gè)基因各自編碼具有特定功能的蛋白質(zhì)，決定著ESAT6/CFP10及其毒力蛋白分泌轉(zhuǎn)運(yùn)，并與細(xì)菌的毒力和致病機(jī)制存在重要聯(lián)系[8,14-17]，因此對(duì)VII型分泌系統(tǒng)的研究有助于了解無(wú)乳鏈球菌毒力蛋白分泌機(jī)制，有助于闡明無(wú)乳鏈球菌的生存、增殖和擴(kuò)散的分子基礎(chǔ)，更可為尋找抗無(wú)乳鏈球菌基因蛋白藥物的作用靶點(diǎn)提供關(guān)鍵性線索，進(jìn)而為從根本上控制無(wú)乳鏈球菌病提供可能性。前期研究對(duì)無(wú)乳鏈球菌的基因組檢索發(fā)現(xiàn)了與VII型/ESAT-6分泌系統(tǒng)同源性較高的基因簇，由11個(gè)基因組成的基因簇構(gòu)成 (esaABCDEF、essABC、esxAB)[18-20]。分子生物學(xué)顯示essA、essB、essC基因編碼膜蛋白，但是其功能研究還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

筆者課題組前期擴(kuò)增到了羅非魚無(wú)乳鏈球菌essA、essB、essC全長(zhǎng)基因，生物信息學(xué)分析顯示essA、essB基因編碼膜蛋白，essC基因編碼蛋白含有典型的FtsL-Spo III E結(jié)構(gòu)，前期研究重組表達(dá)了essA、essB、essC蛋白，免疫羅非魚后，對(duì)無(wú)乳鏈球菌的相對(duì)免疫保護(hù)率分別為82.57%、85.29%、91.60%，是良好的免疫原性蛋白[21]。在此基礎(chǔ)上，本研究以羅非魚源無(wú)乳鏈球菌致病株GDZX1為研究對(duì)象，利用熱敏性自殺載體pSET4S構(gòu)建基因缺失突變株ΔessA、ΔessB、ΔessC，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行分析, 以揭示無(wú)乳鏈球菌essA、essB、essC對(duì)ESAT6蛋白mRNA表達(dá)水平、對(duì)菌株致病性的影響，以期為無(wú)乳鏈球菌VII型分泌系統(tǒng)編碼基因功能研究提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試驗(yàn)用魚

野生型無(wú)乳鏈球菌強(qiáng)毒力菌株GDZX1 (Wild type，Serotype Ia)，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所水產(chǎn)病害研究室分離并保存。溫敏型自殺質(zhì)粒pSET4S和pSET5S由日本國(guó)立動(dòng)物衛(wèi)生研究所Daisuke Takamatsu博士惠贈(zèng)。試驗(yàn)用羅非魚購(gòu)自廣東省羅非魚良種場(chǎng)，體質(zhì)量約為10 g，實(shí)驗(yàn)前在室內(nèi)玻璃缸暫養(yǎng)2周，隨機(jī)抽檢5尾，做病原分離試驗(yàn)，確保試驗(yàn)用魚不攜帶無(wú)乳鏈球菌病原。隨機(jī)分為13組 (12個(gè)攻毒組和1個(gè)對(duì)照組)。保持溶解氧>5.0 mg·L?1，每天換水，保持水質(zhì)良好。試驗(yàn)前每天飽飼2次。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

運(yùn)用 Oligo 7.0 和 Primer 6.0 軟件設(shè)計(jì)引物，試驗(yàn)用引物序列見(jiàn)表1，由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 試驗(yàn)用引物Table 1 Primers in this study

1.3 基因敲除用重組載體的構(gòu)建

1.3.1essA基因敲除重組載體的構(gòu)建

以提取的無(wú)乳鏈球菌GDZX1基因組DNA為模板，essAup-FBamHI/essAup-R引物對(duì)擴(kuò)增essA基因上游同源臂，essAdown-F/essAdown-REcoRI引物對(duì)擴(kuò)增essA基因下游同源臂，反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃預(yù)變性 5 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。以pSET5S質(zhì)粒為模板，Cat(essA)-F/Cat-R引物對(duì)擴(kuò)增氯霉素表達(dá)框(Cat)，反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃ 預(yù)變性 5 min；98 ℃10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 5 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，將擴(kuò)增的片段切膠純化，等體積 (8 μL) 混合，進(jìn)行第 1輪融合PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性5 min；98℃ 15 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，16 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。然后以第1輪融合后的PCR產(chǎn)物為模板，以essAup-FBamHI/essAdown-REcoRI為正、反向引物，進(jìn)行第2輪融合PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃ 預(yù)變性 5 min；98 ℃ 15 s，62 ℃ 15 s，72 ℃90 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 5 min，PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

符合預(yù)期的片段切膠純化，BamHI和EcoRI雙酶切，與同樣雙酶切后的線性化載體pSET4s連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，然后將培養(yǎng)物涂布在含有氯霉素 (25 μg·mL?1) 和壯觀霉素 (50 μg·mL?1) 的 LB 固體平板上，37 ℃ 倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單克隆，利用essAup-FBamHI/essAdown-REcoRI引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定，反應(yīng)程序?yàn)?98 ℃ 預(yù)變性 5 min；98 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃90 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 5 min，PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，鑒定后的陽(yáng)性質(zhì)粒送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.3.2essB基因敲除重組載體的構(gòu)建

以提取的無(wú)乳鏈球菌GDZX1基因組DNA為模板，essBup-FBamHI/essBup-R引物對(duì)擴(kuò)增essB基因上游同源臂，essBdown-F/essBdown-REcoRI引物對(duì)擴(kuò)增essB基因下游同源臂，反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性 5 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。按 1.3.1Cat擴(kuò)增程序，Cat(essB)-F/Cat-R擴(kuò)增Cat表達(dá)框。按1.3.1融合PCR程序，進(jìn)行第1輪融合PCR擴(kuò)增，以essBup-FBamHI/essBdown-REcoRI為正、反向引物，進(jìn)行第2輪融合PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。并按1.3.1重組載體構(gòu)建步驟，構(gòu)建并鑒定重組質(zhì)粒。

1.3.3essC基因敲除重組載體的構(gòu)建

以提取的無(wú)乳鏈球菌GDZX1基因組DNA為模板，essCup-FSalI/essCup-R引物對(duì)擴(kuò)增essC基因上游同源臂，essCdown-F/essCdown-REcoRI引物對(duì)擴(kuò)增essC基因下游同源臂，反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃預(yù)變性 5 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。按 1.3.1Cat擴(kuò)增程序，Cat(essC)-F/Cat-R擴(kuò)增Cat表達(dá)框。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，將擴(kuò)增的片段切膠純化，等體積 (8 μL) 混合，進(jìn)行第1輪融合PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃預(yù)變性 5 min；98 ℃ 15 s，48 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，16個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。然后以第1輪融合PCR產(chǎn)物為模板，以essCup-FSalI/essCdown-REcoRI為正、反向引物，進(jìn)行第2輪融合PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?98 ℃ 預(yù)變性 5 min；98 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 5 min，PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。并按1.3.1重組載體構(gòu)建步驟，構(gòu)建并鑒定重組質(zhì)粒。

1.4 基因缺失突變株的構(gòu)建

參照Takamatsu等[22]的方法，制備GDZX1株電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。分別取 5 μL pSET4S-ΔessA、pSET4S-ΔessB、pSET4S-ΔessC陽(yáng)性質(zhì)粒分別加入到100 μL GDZX1電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中，輕微混勻后將混合物加入0.2 cm電轉(zhuǎn)杯內(nèi)，冰浴10 min，在 2.25 kV·cm?1，200 Ω、25 μF 電轉(zhuǎn)參數(shù)下電擊，迅速加入 1 mL SOC 培養(yǎng)基，30 ℃，160 rpm 振蕩搖動(dòng) 3～4 h；隨后將 300 μL 菌液涂布于 THB Spc+Cm+平板，在30 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。挑取小菌落至 Cm+THB 培養(yǎng)基上，30 ℃ 培養(yǎng) 6～7 h，轉(zhuǎn) 37 ℃培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)移菌落分別至Cm+抗性和Spc+抗性的THB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)。其中在Cm+抗性培養(yǎng)基能生長(zhǎng)、但在Spc+抗性培養(yǎng)基不能生長(zhǎng)的為疑似陽(yáng)性菌落，繼續(xù)穩(wěn)定傳代，PCR鑒定并測(cè)序，菌株保種至?80 ℃冰箱。

1.5 基因缺失突變株 ΔessA、ΔessB、ΔessC 特性分析

1.5.1 生長(zhǎng)曲線分析

劃線接種 ?80 ℃凍存的無(wú)乳鏈球菌野生株(WT)、ΔessA、ΔessB、ΔessC株至THB固體培養(yǎng)基，30 ℃ 培養(yǎng) 24 h。挑取單菌落至 5 mL THB 液體培養(yǎng)基，30 ℃ 振搖 24 h。測(cè)定各菌株光密度 (OD600)，調(diào)整各菌株OD600均為1.80，然后以體積比1∶100 接種至 100 mL THB 液體培養(yǎng)基，30 ℃ 振搖，每隔 2 h取樣 2 mL，測(cè)定 OD600，SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5.2 基因缺失對(duì) ESAT6 蛋白表達(dá)量的研究

1)ESAT6基因qPCR檢測(cè)方法的建立：利用Primer 6.0軟件，設(shè)計(jì) ESAT6 qPCR 檢測(cè)引物，引物序列見(jiàn)表1。依實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的ESAT6-pMD18T載體為模板，測(cè)定質(zhì)粒濃度，10倍梯度稀釋 7 個(gè)梯度。分別以原液、10?1、10?2、10?3、10?4、10?5、10?6稀釋質(zhì)粒為模板，利用 Vazyme AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 試劑盒，配制20 μL qPCR 反應(yīng)體系，其中 2 × AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，上游引物 (10 μmol·L?1)1 μL，下游引物 (10 μmol·L?1) 1 μL，模板 2 μL，ddH2O 6 μL。按 95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃10 s，72 ℃ 20 s，40 個(gè)循環(huán)進(jìn)行 qPCR 反應(yīng)；95 ℃15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s進(jìn)行熔解曲線采集。

2) ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除對(duì) ESAT6蛋白mRNA表達(dá)水平影響分析：劃線接種無(wú)乳鏈球菌WT株、ΔessA株、ΔessB株、ΔessC株至THB固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落至5 mL THB培養(yǎng)基，30 ℃振搖24 h，調(diào)整OD600=1.80后，按 1∶100 接種至 100 mL THB 液體培養(yǎng)基，30 ℃振搖，分別于 4 、8 、12 和 24 h 取樣 5 mL，利用OMEGA RNA提取試劑盒，提取細(xì)菌RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋10倍，以無(wú)乳鏈球菌16Sr-RNA 基因?yàn)閮?nèi)參基因[23]，按 95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s采集熒光，40 個(gè)循環(huán)進(jìn)行qPCR 反應(yīng)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s進(jìn)行熔解曲線的采集。以WT株為對(duì)照，2?ΔΔCT方法計(jì)算敲除株ESAT6 mRNA相對(duì)表達(dá)量，并利用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5.3 毒力試驗(yàn)

取?80 ℃凍存的無(wú)乳鏈球菌WT株、ΔessA、ΔessB、ΔessC菌株，劃線接種THB固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落，接種THB液體培養(yǎng)基，30 ℃ 培養(yǎng) 24 h 后，適度稀釋，取 100 μL 涂布在THB平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)。4株菌株均稀釋至 5×108、5×107、5×106CFU·mL?13 個(gè)劑量，0.1 mL·尾?1腹腔注射健康羅非魚各20尾，對(duì)照組設(shè)置20尾，注射等量PBS溶液。試驗(yàn)魚放置于 40 cm×30 cm×40 cm 的水族箱，連續(xù)充氣，水溫維持在27～30 ℃，每天觀察死亡情況并記錄，死亡羅非魚剖解，重新劃線接種分離病原菌。利用GraphPad Prism軟件繪制生存率曲線，并進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 敲除載體的構(gòu)建

以野生型菌株GDZX1基因組DNA為模板，采用表1引物序列，獲得essA基因上游435 bp同源臂序列，下游502 bp同源臂序列；獲得essB基因上游508 bp同源臂序列，下游508 bp同源臂序列；獲得essC基因上游632 bp同源臂序列，下游571 bp同源臂序列。以pSET5S質(zhì)粒為模板，采用表1引物序列，獲得氯霉素表達(dá)框1 056 bp片段。essAup片段、cat(essA)、essAdown片段，經(jīng)融合PCR，獲得 1 993 bp 的融合片段 (圖1-a)；essBup片段、cat(essB)、essBdown片段，經(jīng)融合PCR，獲得 2 072 bp 的融合片段 (圖1-b)；essCup片段、cat(essC)、essCdown片段，經(jīng)融合 PCR，獲得 2 259 bp的融合片段 (圖1-c)。

圖1 essA、essB、essC同源臂融合PCR結(jié)果Fig. 1 Overlap extension PCR results of essA, essB, essC homologous arms

以此為基礎(chǔ)，將目的片段與酶切后的pSET4S質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 菌株，37 ℃ 培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單克隆菌株，進(jìn)行PCR鑒定，并測(cè)序驗(yàn)證，獲得基因敲除載體，分別命名為pSET4S-ΔessA質(zhì)粒、pSET4S-ΔessB質(zhì)粒、pSET4S-ΔessC質(zhì)粒。

2.2 敲除菌株 ΔessA、ΔessB、ΔessC 的篩選與鑒定

將2.1獲得的pSET4S-ΔessA質(zhì)粒、pSET4SΔessB質(zhì)粒、pSET4S-ΔessC質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入野生型無(wú)乳鏈球菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)中，30 ℃培養(yǎng)48 h，使質(zhì)粒與野生型菌株發(fā)生同源重組，挑取對(duì)氯霉素具有抗性的單克隆菌株至cm+THB液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng) 6 h，轉(zhuǎn)至37 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 12 h，以此傳代培養(yǎng)，對(duì)第9代菌株篩選到的對(duì)氯霉素具抗性的菌株，提取細(xì)菌基因組DNA，分別利用essA驗(yàn)證引物、essB驗(yàn)證引物、essC驗(yàn)證引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖2。利用essA驗(yàn)證引物，WT株擴(kuò)增到479 bp的目的片段，而疑似essA敲除株擴(kuò)增到 1 311 bp的目的片段，符合預(yù)期，對(duì)所獲目的片段進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，essA基因插入了cat基因序列，證明敲除成功，敲除株命名無(wú)乳鏈球菌ΔessA(圖2-a)；利用essB驗(yàn)證引物，WT株擴(kuò)增到740 bp的目的片段，而疑似essB敲除株擴(kuò)增到1 702 bp的目的片段，符合預(yù)期，對(duì)所獲目的片段進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，essB基因插入了cat基因序列，證明敲除成功，敲除株命名為無(wú)乳鏈球菌ΔessB(圖2-b)；利用essC驗(yàn)證引物，WT株擴(kuò)增到1 263 bp的目的片段，而疑似essC敲除株擴(kuò)增到2 077 bp的目的片段，符合預(yù)期，對(duì)所獲目的片段進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，essC基因插入了cat基因序列，證明敲除成功，敲除株命名為無(wú)乳鏈球菌ΔessC(圖2-c)。

圖2 敲除株ΔessA、ΔessB、ΔessC DNA水平PCR鑒定結(jié)果Fig. 2 PCR identification results of ΔessA, ΔessB, ΔessC knockout strains at DNA level

在此基礎(chǔ)上，對(duì)第9代菌株篩選到的對(duì)氯霉素具抗性的菌株，提取菌體RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用RT-PCR技術(shù)在RNA水平上驗(yàn)證基因缺失突變株ΔessA、ΔessB、ΔessC。利用essAF/essA-R引物對(duì)對(duì)ΔessA敲除菌株進(jìn)行mRNA水平驗(yàn)證，利用essB-F/essB-R引物對(duì)對(duì)ΔessB敲除菌株進(jìn)行mRNA水平驗(yàn)證，利用essC-F/essC-R引物對(duì)對(duì)ΔessC敲除菌株進(jìn)行mRNA水平驗(yàn)證，結(jié)果均未擴(kuò)增到目的條帶，證明缺失菌株構(gòu)建成功 (圖3)。

圖3 敲除株ΔessA、ΔessB、ΔessC RNA水平PCR鑒定結(jié)果Fig. 3 PCR identification of ΔessA, ΔessB and ΔessC knockout strains at RNA level

2.3 生長(zhǎng)曲線分析

通過(guò)測(cè)定不同時(shí)間菌液OD600，比較ΔessA、ΔessB、ΔessC與WT株的生長(zhǎng)速度差異，結(jié)果見(jiàn)圖4。與WT株生長(zhǎng)速率相比，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株前期生長(zhǎng)速率明顯減慢，WT株在第8 小時(shí)OD600達(dá)到1.282，在第18 小時(shí)OD600達(dá)到1.878；而ΔessA、ΔessB在第8小時(shí)OD600僅為0.2，在第18小時(shí)OD600才達(dá)到1.4，生長(zhǎng)速率明顯減慢，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與WT株相比，0～18 h OD600具有顯著性差異 (P<0.01)；而ΔessC株與WT株相比，OD600無(wú)顯著性差異。

圖4 敲除菌株ΔessA、ΔessB、ΔessC 生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果Fig. 4 Growth curve of ΔessA, ΔessB and ΔessC knockout strains

2.4 敲除株對(duì)底物蛋白 ESAT6 表達(dá)量的影響結(jié)果

2.4.1ESAT6 基因 qPCR 檢測(cè)方法的建立

以構(gòu)建的ESAT6-pMD18T質(zhì)粒為模板，經(jīng)10 倍梯度稀釋，分別以原液、10?1、10?2、10?3、10?4、10?5、10?67 個(gè)劑量質(zhì)粒為模板，配制 q-PCR反應(yīng)體系，經(jīng)三步法qPCR擴(kuò)增，得到ESAT6基因qPCR擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增效率為95.1%，符合要求 (圖5)；熔解曲線分析得出在75 ℃左右出現(xiàn)單峰，證明擴(kuò)增產(chǎn)物單一；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果得到88 bp的特異性條帶。

圖5 ESAT6 qPCR檢測(cè)方法的建立注：a. 擴(kuò)增效率分析結(jié)果；b. 熔解曲線分析結(jié)果； c. 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果。Fig. 5 qPCR detection method of ESAT6 geneNote:a. Amplification efficiency analysis result; b. Melt curve analysis result; c. Amplification product detection result based on agarose gel.

2.4.2 敲除株對(duì) ESAT6 蛋白 mRNA 表達(dá)水平的影響結(jié)果

以無(wú)乳鏈球菌16S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參基因，在第 4 、第8 、第12和第 24小時(shí)，比較 ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株與WT株ESAT6 mRNA表達(dá)水平差異，結(jié)果見(jiàn)圖6。第4 、第8 、第12 小時(shí)時(shí)，相較于WT株，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株ESAT6 mRNA 表達(dá)水平均顯著降低 (P<0.01)，但在第24小時(shí)，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株ESAT6表達(dá)量與WT株無(wú)顯著性差異。說(shuō)明essA、essB、essC基因缺失在生長(zhǎng)早期影響了ESAT6表達(dá)，導(dǎo)致ESAT6 mRNA表達(dá)水平顯著性降低。

圖6 敲除株ΔessA、ΔessB、ΔessC 與野生株對(duì)底物蛋白ESAT6表達(dá)量的影響結(jié)果注：**. 差異顯著 (P<0.01)。Fig. 6 Effect of substrate protein ESAT6 expression by knockout strains ΔessA, ΔessB, ΔessC and WT strainNote:**. Significant difference (P<0.01).

2.5 毒力試驗(yàn)

ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株與WT株分別稀釋至 5×108、5×107、5×106CFU·mL?13 個(gè)劑量，分別對(duì)羅非魚進(jìn)行毒力試驗(yàn)，比較敲除株與WT株毒力差異 (圖7)。各組以 5×108CFU·mL?1劑量0.1 mL·尾?1注射攻毒，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株累計(jì)死亡率分別為90%、90%、70%，而WT株累計(jì)死亡率為 100%；各組以 5×107CFU·mL?1劑量 0.1 mL·尾?1注射攻毒，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株累計(jì)死亡率分別為60%、90%、60%，而WT 株累計(jì)死亡率為 100%；各組以 5×106CFU·mL?1劑量 0.1 mL·尾?1注射攻毒，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株累計(jì)死亡率分別為50%、50%、30%，而WT株累計(jì)死亡率為100%，經(jīng)成活率曲線分析，5×106CFU·mL?1劑量攻毒時(shí)，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株累計(jì)死亡率均與WT株存在明顯差異(P<0.01)。死亡羅非魚剖解，可見(jiàn)魚體肝臟充血、腹水、眼球突出等無(wú)乳鏈球菌感染典型癥狀 (圖8)，且從腦、肝、脾、腎組織取樣，劃線接種血瓊脂平板，得到呈β溶血、針尖大小的灰白色小菌落，經(jīng)革蘭氏染色和PCR鑒定，為無(wú)乳鏈球菌。PBS組在攻毒試驗(yàn)期內(nèi)未發(fā)現(xiàn)死亡。隨后又對(duì)回接到各個(gè)菌株，以 5×108CFU·mL?1劑量，重復(fù)攻毒，結(jié)果顯示，WT、ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株累計(jì)死亡率分別為100%、90%、80%、70%，證明回歸試驗(yàn)成功。

圖7 敲除菌株ΔessA、ΔessB、ΔessC 與野生株毒力試驗(yàn)結(jié)果Fig. 7 Virulence test of ΔessA, ΔessB, ΔessC knockout strains and WT strain

圖8 攻毒死亡魚解剖及其菌株鑒定結(jié)果注：a. 攻毒死亡魚解剖癥狀；b. 攻毒分離菌株革蘭氏染色結(jié)果；c. 攻毒分離菌株 PCR 鑒定結(jié)果。Fig. 8 Anatomical symptom result and identification of strains of infected dead tilapiaNote:a. Anatomical symptom result of infected dead tilapia; b. Gram staining result of isolated strain after infection;c. PCR identification of isolated strain after infection.

3 討論

VII型分泌系統(tǒng)由多個(gè)膜蛋白、胞質(zhì)蛋白及外分泌蛋白組成，其分泌蛋白的穩(wěn)定釋放依賴于VII型分泌系統(tǒng)不同蛋白的共同作用[18,24]。對(duì)于VII型分泌系統(tǒng)的研究，結(jié)核分枝桿菌研究最為清楚地顯示出膜蛋白R(shí)v3871識(shí)別分泌蛋白ESAT-6/CFP-10復(fù)合物，與CFP-10的C端結(jié)合，并與Rv3870在細(xì)胞內(nèi)膜上相互作用形成有活性的ATP酶，形成一個(gè)具有中央空洞的六環(huán)結(jié)構(gòu)，分泌蛋白通過(guò)六環(huán)分泌通道分泌出胞外?？缒さ鞍卓赡苄纬闪宿D(zhuǎn)位通道，促進(jìn)分泌蛋白的分泌[25]。

無(wú)乳鏈球菌感染是危害羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)最為嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病，前期筆者課題組從患病羅非魚中分離鑒定到一株高毒力菌株GDZX1[26]，對(duì)其毒力特征和致病機(jī)制的研究亟待開(kāi)展。前期研究對(duì)無(wú)乳鏈球菌的基因組檢索發(fā)現(xiàn)了與VII型/ESAT-6分泌系統(tǒng)同源性較高的基因簇[11-12]，由11個(gè)基因組成的基因簇構(gòu)成 (esaABCDEF、essABC、esxAB)。essA、essB蛋白均為跨膜蛋白，可能對(duì)VII型分泌系統(tǒng)正常功能的發(fā)揮起著重要作用。essC蛋白含有典型FstK/SpoEIII結(jié)構(gòu)域 (FSD)，分泌蛋白的分泌需要essC調(diào)控的ATP水解作用提供能量[14]。本研究利用同源重組技術(shù)，構(gòu)建了羅非魚無(wú)乳鏈球菌essA、essB、essC缺失突變株，通過(guò)DNA水平和RNA水平鑒定，均證明缺失突變成功。并對(duì)敲除菌株的VII型分泌系統(tǒng)可能的編碼基因進(jìn)行了測(cè)序分析，均未造成VII型分泌系統(tǒng)其他基因的缺失或突變。對(duì)野生株和各基因敲除株進(jìn)行了生長(zhǎng)特性表型分析，證明essA、essB基因缺失明顯影響了細(xì)菌的生長(zhǎng)，證明essA和essB蛋白與細(xì)菌生長(zhǎng)有關(guān)。隨后對(duì)分泌蛋白ESAT6表達(dá)量的研究發(fā)現(xiàn)，essA、essB、essC基因缺失均導(dǎo)致了分泌蛋白ESAT6 mRNA表達(dá)水平明顯下降，說(shuō)明essA、essB、essC蛋白可以影響ESAT6 mRNA表達(dá)水平，對(duì)于維持無(wú)乳鏈球菌VII型分泌系統(tǒng)的完整性起著重要作用。眾多研究表明，VII型分泌系統(tǒng)單個(gè)基因各自編碼具有特定功能的蛋白質(zhì)，而這些基因以單個(gè)或多個(gè)形式相互作用，使得由它們獨(dú)立編碼的多個(gè)蛋白質(zhì)協(xié)同作用，組成一個(gè)完整的毒力蛋白分泌系統(tǒng)。該分泌系統(tǒng)決定著ESAT6/CFP10及其毒力蛋白的分泌轉(zhuǎn)運(yùn)，結(jié)核分枝桿菌其組分很有可能形成一個(gè)類似于細(xì)菌I型-VI型分泌系統(tǒng)的多重跨膜結(jié)構(gòu)，酵母雙雜交試驗(yàn)揭示，膜蛋白R(shí)v3871識(shí)別分泌蛋白ESAT-6/CFP-10復(fù)合物，與CFP-10的C端結(jié)合，并與Rv3870在細(xì)胞內(nèi)膜上相互作用形成有活性的ATP酶。分子伴侶Rv3868與Rv3870和Rv3871相互作用促進(jìn)ESAT-6和CFP-10蛋白的分泌。Rv3870/Rv3871復(fù)合物形成具有活性的ATP酶，形成一個(gè)具有中央空洞的六環(huán)結(jié)構(gòu)，底物分泌蛋白通過(guò)六環(huán)分泌通道分泌出胞外。膜蛋白R(shí)v3877含有11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，可能形成了位于內(nèi)膜上的轉(zhuǎn)位通道[23]。本研究挖掘到無(wú)乳鏈球菌VII型分泌系統(tǒng)重要的組成蛋白essA、essB、essC，其缺失均造成了ESAT6蛋白分泌障礙，對(duì)無(wú)乳鏈球菌VII型分泌系統(tǒng)其他組成蛋白的挖掘，以及組成蛋白的相互協(xié)同關(guān)系，仍有待進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株和WT株，選擇3個(gè)梯度對(duì)羅非魚進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，essA、essB、essC基因缺失導(dǎo)致了無(wú)乳鏈球菌毒力明顯下降，ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株累計(jì)死亡率均與WT株存在明顯差異 (P<0.01)，影響了菌株毒力，可能與essA、essB、essC基因缺失造成的ESAT6分泌蛋白表達(dá)量降低有關(guān)。這與金黃色葡萄球菌的報(bào)道一致，金黃色葡萄球菌VII型/ESAT6分泌系統(tǒng)分泌蛋白需要essA、essB和essC蛋白的協(xié)同作用[11]，essB蛋白全缺失導(dǎo)致ESS系統(tǒng)不能分泌底物蛋白[27]，部分缺失導(dǎo)致ESS系統(tǒng)分泌底物蛋白表達(dá)量明顯降低[28-29]，證明essB是金黃色葡萄球菌ESS分泌系統(tǒng)的核心組件，繼而通過(guò)十二烷基麥芽糖苷萃取技術(shù)提取了金黃色葡萄球菌essB蛋白，研究發(fā)現(xiàn)essB蛋白與esaA、essA、essD和esxA蛋白形成聚合體，同時(shí)essC蛋白可為ATP水解作用提供能量，才能使金黃色葡萄球菌ESS分泌功能正常發(fā)揮[15,30]，而esxA/ESAT6蛋白是金黃色葡萄球菌ESS分泌系統(tǒng)的分泌蛋白，與金黃色葡萄球菌毒力與膿腫形成密切相關(guān)[27]。蟾蜍分枝桿菌 (Mycobacterium xenopi) 研究也發(fā)現(xiàn)相似的膜蛋白，組成ESX-5 T7SS分泌系統(tǒng)，與毒力密切相關(guān)[31]。

本研究證明無(wú)乳鏈球菌essA、essB、essC蛋白對(duì)ESAT6分泌蛋白的分泌至關(guān)重要，維持無(wú)乳鏈球菌VII型分泌系統(tǒng)的完整性，可能是無(wú)乳鏈球菌VII型分泌系統(tǒng)的關(guān)鍵膜蛋白，其缺失不僅影響了ESAT6蛋白的表達(dá)，而且直接影響了菌株毒力，是潛在的無(wú)乳鏈球菌毒力因子。但是這些膜蛋白是如何控制分泌蛋白分泌的，是否存在蛋白之間的相互作用，膜蛋白僅控制分泌蛋白分泌還是可以自身參與入侵宿主過(guò)程，這些問(wèn)題有待進(jìn)一步探索研究。