陳晨，文志發(fā)，劉佳

（南京市婦幼保健院，江蘇 南京 210004）

0 引言

依據(jù)世界衛(wèi)生組織指南，反復(fù)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）的定義為和同一配偶發(fā)生連續(xù)三次及以上且妊娠小于28周的自然妊娠失敗，是一種比較常見的妊娠并發(fā)癥，引起RSA的病因復(fù)雜且無(wú)典型的臨床表現(xiàn)，其中能找到明確病因的僅占50%，另一部分無(wú)明確病因的稱為原因不明反復(fù)自然流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA）[1]。RSA的病因多樣，主要包括母體生殖道解剖異常，內(nèi)分泌紊亂，夫妻染色體異常，生殖系統(tǒng)感染，宮頸機(jī)能不全，免疫功能異常及血栓形成傾向，其中大部分與免疫紊亂有關(guān)[2]。而免疫性流產(chǎn)又可以分為自身免疫型和同種免疫型，其中同種免疫型流產(chǎn)的發(fā)生則與人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）免疫應(yīng)答密切相關(guān)[3]，臨床上往往表現(xiàn)為患者血清的HLA抗體檢測(cè)結(jié)果呈陰性。目前，隨著醫(yī)療水平不斷進(jìn)步，淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療（lymphocyte active immunotherapy, LAI）已經(jīng)作為專門用于RSA患者中以HLA抗體缺乏為特征的重要臨床診療措施[4-5]。根據(jù)近年臨床案例的回顧性分析，淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療可顯著提高該類RSA患者最終妊娠的成功率，同時(shí)母子的安全性良好[6-7]。本院與南京市紅十字血液中心合作，血液供應(yīng)者以無(wú)償獻(xiàn)血的方式一次性獻(xiàn)全血400mL，選取全血經(jīng)成分分離后的白膜用于淋巴細(xì)胞的提取，然后用自體血漿深低溫凍存，使用時(shí)分次復(fù)蘇后供RSA患者用于免疫治療。本研究統(tǒng)計(jì)分析淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療前后患者體內(nèi)抗HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ抗體的變化情況及治療效果，并初步探討其間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 對(duì)象

選擇2019年10月至2020年10月由本院中醫(yī)科門診確診的82例RSA患者，連續(xù)自然流產(chǎn)≥3次，血常規(guī)、肝腎功能及凝血功能均正常，抗心磷脂抗體、抗β2糖蛋白抗體、抗子宮內(nèi)膜抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性，無(wú)傳染病性疾病，HLA-Ⅰ、Ⅱ類特異性抗體為陰性，并且排除染色體異常、子宮解剖結(jié)構(gòu)異常、內(nèi)分泌異常、自身免疫性疾病。

1.2 試劑

HLA特異性抗體檢測(cè)試劑盒（美國(guó)萊姆德公司）。

1.3 方法

1.3.1 淋巴細(xì)胞制備

首先確定丈夫無(wú)傳染性疾?。ㄒ倚透窝?、丙型肝炎、艾滋病、梅毒），然后獻(xiàn)全血400mL，通過(guò)成分分離形成白膜，經(jīng)Ficoll密度梯度離心法獲得淋巴細(xì)胞，由90%自體血漿+10%二甲基亞砜重懸，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞濃度至（2-4）×107個(gè)/mL，程序降溫置于液氮中凍存，復(fù)蘇方可后使用。

1.3.2 免疫方法

復(fù)蘇后的淋巴細(xì)胞給予患者前臂內(nèi)側(cè)多點(diǎn)皮下注射。

1.3.3 治療方案

皮下注射淋巴細(xì)胞4次為一個(gè)療程，每次注射間隔時(shí)間為2周，一個(gè)療程后復(fù)查患者體內(nèi)的HLA抗體，若結(jié)果轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，可考慮備孕，孕后再加強(qiáng)注射3~4次，每次間隔3~4周，直至孕12周。若轉(zhuǎn)陽(yáng)備孕后未能妊娠，每隔6~8周加強(qiáng)注射1次。若HLA抗體檢測(cè)結(jié)果未轉(zhuǎn)陽(yáng)，需繼續(xù)進(jìn)行一療程免疫治療后再考慮妊娠。

1.3.4 HLA抗體檢測(cè)

研究對(duì)象均于早上抽取空腹靜脈血3mL，靜置30min后以3500轉(zhuǎn)每分鐘離心15min，然后分離血清于凍存管，置于-20℃冰箱保存，測(cè)定前血清經(jīng)解凍并平衡至室溫。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)患者血清中HLA-Ⅰ、Ⅱ類抗體，嚴(yán)格按照HLA特異性抗體檢測(cè)試劑盒（美國(guó)萊姆德公司）說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 HLA抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率比較

患者第一療程結(jié)束7天后抽血，檢測(cè)其血清中HLA-Ⅰ、Ⅱ類特異性抗體，計(jì)算第一療程HLA抗體的轉(zhuǎn)陽(yáng)率。第一療程未轉(zhuǎn)陽(yáng)患者，繼續(xù)予以第二療程然后再次檢測(cè)，計(jì)算第二療程HLA抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率和累計(jì)轉(zhuǎn)陽(yáng)率。

1.4.2 妊娠成功率比較

妊娠成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)為至少需滿足妊娠≥14周且B超檢查未見異常。隨訪RSA患者，統(tǒng)計(jì)各組妊娠成功率，以其作為療效評(píng)價(jià)的依據(jù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HLA抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率統(tǒng)計(jì)

82例RSA患者依據(jù)上述治療方案進(jìn)行免疫治療，第一療程結(jié)束后有54例HLA-Ⅰ、Ⅱ類特異性抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)，第一療程的轉(zhuǎn)陽(yáng)率為65.9%；第二療程結(jié)束后又有19例HLA-Ⅰ、Ⅱ類特異性抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)，累計(jì)轉(zhuǎn)陽(yáng)率為89%。

2.2 淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療后HLA抗體陽(yáng)性與陰性者再次妊娠成功率統(tǒng)計(jì)

82例接受治療患者中，治療前82例HLA抗體均為陰性，治療后73例產(chǎn)生HLA抗體（累計(jì)轉(zhuǎn)陽(yáng)率89%），其中再次妊娠成功66例，成功率90.4%；未產(chǎn)生HLA抗體的9例中，成功1例，成功率11.1%，HLA抗體陽(yáng)性者再次妊娠成功率顯著高于陰性者，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 82例RSA患者淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療后HLA抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率統(tǒng)計(jì)(n,%)

表2 82名RSA患者淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療后HLA抗體陽(yáng)性與陰性者妊娠成功率統(tǒng)計(jì)

3 討論

RSA的發(fā)生在育齡女性中并不罕見，同時(shí)其再次流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)伴隨流產(chǎn)次數(shù)的增加而不斷升高，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，RSA患者再次流產(chǎn)的概率可高達(dá)75%[8]。隨著我國(guó)生殖免疫學(xué)不斷進(jìn)步，不少學(xué)者逐步認(rèn)識(shí)到RSA的發(fā)生與發(fā)展和患者的免疫功能異常息息相關(guān)[9]。近年來(lái)，也出現(xiàn)由于抗核抗體導(dǎo)致RSA的幾種假說(shuō)：（1）抗核抗體的抗原具有RNA多聚酶的作用，產(chǎn)生的相關(guān)抗體引起RNA轉(zhuǎn)錄障礙，使得DNA無(wú)法復(fù)制，從而導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。（2）由于外界因素侵犯了自身的免疫屏障，促進(jìn)淋巴細(xì)胞活化，而活化生成的淋巴細(xì)胞中的染色質(zhì)是引起抗核抗體產(chǎn)生的重要抗原，累積的免疫原不斷刺激免疫系統(tǒng)，從而導(dǎo)致RSA的發(fā)生與發(fā)展。（3）抗核抗體可能干擾了胚胎細(xì)胞復(fù)制分裂的過(guò)程，從而引起流產(chǎn)[10]。（4）抗核抗體參與形成的免疫復(fù)合物沉著于蛻膜血管組織的表面，影響胎盤的正常發(fā)育，因而引發(fā)流產(chǎn)[11]。（5）還有少數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為抗核抗體可能會(huì)阻礙子宮內(nèi)膜的發(fā)育，影響胚胎著床和生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致流產(chǎn)[12]。

從生殖免疫學(xué)角度分析，妊娠可設(shè)想為是一種半同種移植的過(guò)程，而流產(chǎn)則可視為半同種移植的失敗[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，由于RSA患者人類白細(xì)胞抗原（HLA）相容性增強(qiáng)，HLA抗體呈陰性，母體對(duì)胚胎父系同種抗原呈低識(shí)別或者低反應(yīng)狀態(tài)，以致不能夠產(chǎn)生足量的保護(hù)性抗體，胚胎就會(huì)遭受母體免疫系統(tǒng)的攻擊反應(yīng)，最終導(dǎo)致流產(chǎn)[14-15]。

針對(duì)RSA患者的淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫療法，經(jīng)過(guò)幾十年的臨床驗(yàn)證，幫助大部分RSA患者妊娠成功并分娩，其治療效果有目共睹。主動(dòng)免疫治療是用他人富含人類白細(xì)胞抗原的淋巴細(xì)胞對(duì)患者進(jìn)行多次皮下注射，有效刺激機(jī)體產(chǎn)生HLA抗體，誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)胚胎產(chǎn)生免疫耐受。但同時(shí)大量臨床案例也表明RSA患者是否能夠產(chǎn)生HLA抗體與其接觸抗原量、免疫反應(yīng)次數(shù)等因素有關(guān)。大量研究表明主動(dòng)免疫治療后產(chǎn)生的HLA抗體與再次妊娠的成功率呈正相關(guān)，因此主動(dòng)免疫治療后對(duì)HLA抗體的監(jiān)測(cè)尤為重要[16]。

本研究中82例RSA患者免疫治療前HLA-Ⅰ、Ⅱ抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性，在接受淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療兩個(gè)療程后，73例HLA抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)，HLA抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)后再次妊娠的成功率高達(dá)90.4%，而HLA抗體仍為陰性的妊娠成功率僅為11.1%。由此可證明淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療能有效促使RSA患者HLA抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)，并可提高妊娠成功率。然而本次研究也發(fā)現(xiàn)妊娠成功者中仍有1例HLA-Ⅰ、Ⅱ抗體均為陰性，妊娠失敗者中也有7例HLA抗體已轉(zhuǎn)陽(yáng)，分析原因，一方面可能是由于免疫反應(yīng)具有個(gè)體差異；另一方面也說(shuō)明RSA的病因復(fù)雜多樣，至今尚未完全明了。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，經(jīng)淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療分娩的嬰兒各項(xiàng)指標(biāo)均正常，成功率可達(dá)70%以上[17]，證實(shí)淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫療法的確對(duì)RSA患者治療效果良好，而HLA抗體與復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（RSA）治療效果也密切相關(guān)，可作為重要的臨床監(jiān)測(cè)指標(biāo)。隨著生殖免疫學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，RSA的發(fā)病機(jī)理及淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫的治療機(jī)制將得到進(jìn)一步的闡明。