鄧思怡，劉 軍，常 威，溫州權(quán)，汪 華*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所，湖北 武漢 430064；2.華中作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064；3.利川市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，湖北 利川 445400)

黃連(CoptischinensisFranch)又名雞爪連、川黃連等，是多年生草本植物[1-2]。黃連主要以根莖供藥用，由于其具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、降糖等藥用活性，在醫(yī)療及保健等行業(yè)得到了廣泛應(yīng)用，黃連種植具有廣闊的前景[3]。黃連在我國四川、貴州、湖南、湖北和陜西等省均有栽培，多產(chǎn)于海拔500 m～2000 m之間的山地森林或山谷陰處。湖北省利川市是我國黃連的主要產(chǎn)地之一。有41%的地區(qū)是海拔800 m～1200 m的山地，年均溫12.3℃，年降雨量1200 mm～1400 mm；海拔1200 m～2000 m的高山面積占比為52%，年均溫11.1℃，年降雨量1370 mm，生態(tài)環(huán)境非常適宜黃連的生長。2011年，利川市獲得中國中藥協(xié)會(huì)頒發(fā)的“中國生態(tài)黃連之鄉(xiāng)”稱號(hào)[4]。利川市黃連種植面積大，品質(zhì)好，但在其栽培過程中，病害防治是產(chǎn)業(yè)上的難點(diǎn)。明確利川黃連重要病害的病原，對(duì)其病害防治具有重要意義。本研究對(duì)湖北省利川市的黃連樣品上的病原進(jìn)行了分離和純化，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等方法對(duì)病原進(jìn)行了鑒定，并通過柯赫氏法則測(cè)定其致病性，旨在為黃連病害生產(chǎn)防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2021年12月，由利川市農(nóng)技推廣中心溫州權(quán)站長從湖北省恩施州利川市建南鎮(zhèn)采集的根部感病黃連植株，郵寄到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離培養(yǎng)。如圖1所示，樣品葉片干枯，呈紫紅色，發(fā)黑，根部可以觀察到黑褐色病部。

圖1 感病的黃連植株

1.2 試驗(yàn)儀器

PDA固體培養(yǎng)基(馬鈴薯(200 g)煮提液，葡萄糖20 g，瓊脂粉15～20 g，水1000 mL)；光學(xué)顯微鏡；植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)。

1.3 病原菌的分離

1.3.1 病樣處理

用滅菌剪刀將黃連地上部分剪去，根系以上留下約1 cm。將切下的黃連根系倒置于塑料杯中，根部朝上，并在杯底部加入無菌水，無菌水不宜漫到根部組織，用保鮮膜封上杯口。

圖2 感病的黃連根系

圖3 感病植株根系密閉培養(yǎng)

1.3.2 病樣組織塊初步培養(yǎng)

采用組織分離法[5]對(duì)黃連病葉及根部的病健交界處進(jìn)行分離，用無菌手術(shù)刀切取0.5～1 cm大小的組織塊，用15%雙氧水清洗15 s，75%酒精清洗30 s，再用無菌水清洗3次，用滅菌濾紙吸干組織塊表面的水分，病部朝上置于PDA培養(yǎng)基中。于室溫下平放培養(yǎng)1 d，待表面生長出菌絲后再倒置培養(yǎng)2～3 d。

1.3.3 病樣菌絲及菌絲團(tuán)初步培養(yǎng)

待密閉培養(yǎng)的黃連根部長出菌絲后，用滅菌牙簽挑取不同部位的菌絲，接種到PDA培養(yǎng)基中。于室溫下平放培養(yǎng)1 d，待表面生長出菌絲后再倒置培養(yǎng)2～3 d。

1.4 分離菌的純化

用滅菌牙簽挑取疑似病原菌進(jìn)行純化培養(yǎng)。選取菌落外圍的菌絲，接種于PDA培養(yǎng)基中。于室溫下倒置培養(yǎng)3～5 d，置于4℃保存。

1.5 分子學(xué)鑒定

按照植物基因組DNA提取試劑盒說明書提取病原菌DNA，使用2×PCR Master Mix試劑盒對(duì)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。選用通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[6]進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行1.0%瓊脂凝膠電泳檢驗(yàn)。PCR產(chǎn)物送公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 致病性測(cè)定

選取健康的黃連植株，每組5株，將根部沖洗干凈后，在無菌操作臺(tái)上對(duì)其進(jìn)行滅菌，用75%酒精清洗2～3 s，再用無菌水清洗2～3次，用濾紙吸干表面水分，在濃度為106ofu/mL的孢子懸浮液中浸根30 min，對(duì)照組用無菌水浸根。將浸根后的植株栽培在滅菌的培養(yǎng)基質(zhì)中，10 d后觀察黃連的發(fā)病情況，并對(duì)發(fā)病的黃連根部再次進(jìn)行病原分離和鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病癥狀鑒別

黃連健康植株根系發(fā)達(dá)，須根亮褐色，葉部嫩綠[7]。黃連根腐病主要危害根部，發(fā)病時(shí)須根變?yōu)楹诤稚?，干枯。葉面初期從葉尖、葉緣變紫紅色不規(guī)則病斑，逐漸變暗紫紅色。葉背面由黃綠色變紫紅色。受害葉呈萎蔫狀，后期干枯致死，病株很容易從土中拔起[8]。病樣根部有黑褐色部位，葉片紫紅色，與黃連根腐病癥狀相符。

2.2 菌落形態(tài)學(xué)鑒別

如圖4所示，純化的單菌落菌絲為白色，呈現(xiàn)放射狀分布，菌絲后期變?yōu)榧t褐色。培養(yǎng)期間PDA無變色現(xiàn)象。菌落形態(tài)學(xué)與鐮刀菌相符。

圖4 分離出的單菌落

2.3 病原菌分子學(xué)鑒別

提取的病原DNA，經(jīng)ITS序列分析，結(jié)果為鐮刀菌(Fusarium)。

2.4 致病性測(cè)定

用孢子懸浮液浸根的黃連植株上的發(fā)病癥狀與田間一致，頂端新葉黃化，須根變黑。對(duì)照的無菌水接種則沒有出現(xiàn)發(fā)病癥狀。對(duì)接種發(fā)病的黃連根系再次分離，均能純化出相同的病原菌。

3 結(jié)論

近年來，隨著人工種植面積擴(kuò)大以及連作現(xiàn)象增加，病害的發(fā)生已經(jīng)成為危害黃連產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素。目前黃連主要病害有根腐病、白絹病、紫紋羽病、葉斑病、白粉病、炭疽病等，以根腐病為害尤甚。四川、湖北等地的調(diào)查結(jié)果表明，根腐病的常年發(fā)病率在40%左右[9]。本研究通過真菌ITS序列分析鑒定病原菌，并結(jié)合發(fā)病癥狀、病原菌形態(tài)學(xué)及致病性測(cè)定，確定樣品病害為黃連根腐病，其病原菌為鐮刀菌(Fusarium)，這為在生產(chǎn)中防治黃連病害提供了理論依據(jù)，之后可在此基礎(chǔ)上，開展黃連根腐病的致病機(jī)理、病原生物學(xué)以及防治等方面的研究。