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        基于LC-MS積雪草不同部位中化學(xué)成分分析*

        2022-08-23 02:22:22李嬌珍孫正海蔡起航丁慕溪房佳茹王坤
        西部林業(yè)科學(xué) 2022年4期
        關(guān)鍵詞:研究

        李嬌珍,孫正海,蔡起航,丁慕溪,房佳茹,王坤

        (1.西南林業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院,云南 昆明 650224;2.云南省面向南亞?wèn)|南亞經(jīng)濟(jì)林全產(chǎn)業(yè)鏈聯(lián)合研發(fā)中心,云南 昆明 650224;3.云南省高效經(jīng)濟(jì)林培育示范型國(guó)際科技合作基地,云南 昆明 650224)

        積雪草(Centellaasiatic(L.)Urban)為傘形科積雪草屬多年生草本植物,別名雷公根、馬蹄草、錢(qián)齒草、打的落、十八缺、半邊錢(qián)、崩大碗等,其廣泛分布于南北半球熱帶和亞熱帶地區(qū),在我國(guó)主要分布在長(zhǎng)江以南的華南、華東、中南及西南地區(qū)[1]。在古代積雪草就已經(jīng)被收載為常用中藥,最早出現(xiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》,其味苦、辛,寒,歸肝、脾、腎經(jīng),具有清熱利濕、解毒消腫的作用,用于濕熱黃疸、中暑腹瀉、石淋血淋、癰腫瘡毒、跌打損傷等[1-2]。在現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)中研究發(fā)現(xiàn),積雪草還有抗抑郁、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)以及免疫調(diào)節(jié)作用[3]。積雪草應(yīng)用形式多樣,除作藥用外也廣泛被食用,有國(guó)外學(xué)者利用積雪草的植物提取物開(kāi)發(fā)功能性飲料[4],在我國(guó)以干燥葉片入茶,多用于涼茶,在東南亞一些國(guó)家新鮮葉可作蔬菜或果汁[5];此外,基于其抑制瘢痕增生及修復(fù)皮膚損傷的作用,已經(jīng)被大量用于美容,因此逐漸成為重要的商業(yè)產(chǎn)品。

        積雪草作為藥食同源植物一直廣受關(guān)注,目前國(guó)內(nèi)外的研究者們對(duì)積雪草的主要化學(xué)成分及提取方法、藥理作用及其作用機(jī)制進(jìn)行廣泛而深入的研究。對(duì)積雪草化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分主要包括三萜類、多炔烯烴類、黃酮類和揮發(fā)油類等[6-7]。近幾年來(lái)相關(guān)學(xué)者關(guān)于積雪草的化學(xué)物質(zhì)有新的發(fā)現(xiàn),徐曉衛(wèi)等[8]通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜法研究積雪草全草揮發(fā)油的化學(xué)成分共鑒定出 57種化合物;張偉等[9]采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HS-SPME-GC-MS),從積雪草中鑒定出16種揮發(fā)性成分;馬燦等[10]以積雪草酸結(jié)構(gòu)為母核,經(jīng)乙?;⑺獾确磻?yīng)合成一個(gè)新的未見(jiàn)報(bào)道的積雪草酸所對(duì)應(yīng)的苷酯;Bo Ren等[11]在2021年從積雪草全草中分離得到2種未被描述的烏拉烷型三萜皂苷,分別命名為積雪草苷H 和積雪草苷I;2022年有學(xué)者在探索積雪草全草的生物活性化合物時(shí),發(fā)現(xiàn)兩種新的黃酮醇衍生物[12]。在化學(xué)物質(zhì)含量方面的研究中張小剛[13]測(cè)定了14種不同居群積雪草主要成分積雪草苷的含量,發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源積雪草之間化學(xué)成分有較大的的差異;王青等[6]在2014年測(cè)定了不同產(chǎn)地積雪草中積雪草苷和羥基積雪草苷,發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地含量差別較大;閆凱等[14]在2017年建立超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜( UPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定積雪草中 7 種有效成分的含量;張培培等[15]比較研究中國(guó)和印尼積雪草藥材化學(xué)成分的差異,發(fā)現(xiàn)來(lái)源于中國(guó)的積雪草藥材中積雪草苷含量較高,而印尼積雪草藥材中積雪草苷含量較低;2020年有國(guó)外學(xué)者對(duì)積雪草葉粉化學(xué)及元素成分進(jìn)行評(píng)價(jià)[16],目前未見(jiàn)對(duì)積雪草不同部位中的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行報(bào)道。本研究以積雪草的根、莖和葉3個(gè)不同組織部位作為研究對(duì)象,利用非靶向代謝組學(xué)液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)對(duì)積雪草不同部位中的化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè),以期為后續(xù)其藥理學(xué)研究及應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 儀器與試劑

        Vanquish液相色譜儀 (Thermo賽默飛世爾科技公司),Q Exactive型質(zhì)譜儀(Thermo賽默飛世爾科技公司),高速冷凍離心機(jī)(H1850-R,湖南湘儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),混勻儀( BE-96,海門(mén)麒麟貝爾實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司),超聲波清洗機(jī)(KW- 100TDV,昆山舒美實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),組織研磨機(jī)(MB-96,浙江美碧實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),濾膜(0.22 μm PTFE,天津金騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),玻璃珠(G8772-500G,Sigma)。

        甲醇(LC-MS級(jí))、乙腈(LC-MS級(jí))購(gòu)自賽默飛世爾科技公司,2-氯-L-苯丙氨酸購(gòu)自上海阿拉丁生化科技公司,甲酸購(gòu)自梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司、甲酸銨購(gòu)自默克公司、H2O使用Milli-Q系統(tǒng)產(chǎn)生超純水(密理博)。

        1.1.2 試驗(yàn)材料

        試驗(yàn)材料積雪草于2021年11月采于云南省楚雄州元謀縣(海拔1 035.1 m,102.41°E、25.54°N)的自然野生種,經(jīng)過(guò)專家鑒定為積雪草。取積雪草的根、莖和葉各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)用于后續(xù)試驗(yàn)。

        1.2 方法

        樣品提取 精確稱量適量樣本于2 mL離心管中,加入600 μL甲醇〔含2-氯-L-苯丙氨酸(4 μmol/L)(-20 ℃保存)〕,渦旋振蕩30 s;加入100 mg玻璃珠,放入組織研磨器中,60 Hz研磨90 s;室溫超聲15 min;12 000 rpm 4 ℃離心10 min,取上清液過(guò)0.22 μm膜過(guò)濾,過(guò)濾液加入到檢測(cè)瓶中,用于LC-MS檢測(cè)。

        色譜條件 ThermoVanquish(ThermoFisherScientific,USA)超高效液相系統(tǒng),使用ACQUITYUPLCHSST3(2.1×150 mm,1.8 μm)(Waters,Milford,MA,USA)色譜柱,0.25 mL/min的流速,40 ℃的柱溫,進(jìn)樣量2 μL。正離子模式,流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈(C)和0.1%甲酸水(D),梯度洗脫程序?yàn)椋?~1 min,2%C;1~9 min,2%~50%C;9~12 min,50%~98%C;12~13.5 min,98%C;13.5~14 min,98%~2%C;14~20 min,2%C。負(fù)離子模式,流動(dòng)相為乙腈(A)和5 mM甲酸銨水(B),梯度洗脫程序?yàn)椋?~1 min,2%A;1~9 min,2%~50%A;9~12 min,50%~98%A;12~13.5 min,98%A;13.5~14 min,98%~2%A;14~17 min,2%A。

        質(zhì)譜條件 ThermoQExactive質(zhì)譜檢測(cè)器(ThermoFisherScientific,USA),電噴霧離子源(ESI),正負(fù)離子模式分別采集數(shù)據(jù)。正離子噴霧電壓為3.50 kV,負(fù)離子噴霧電壓為-2.50 kV,鞘氣30 arb,輔助氣10 arb。毛細(xì)管溫度325 ℃,以分辨率70 000進(jìn)行一級(jí)全掃描,一級(jí)離子掃描范圍81~1 000 m/z,并采用HCD進(jìn)行二級(jí)裂解,碰撞電壓為30%,二級(jí)分辨率為17 500,采集信號(hào)前10離子進(jìn)行碎裂,同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除去除無(wú)必要的MS/MS信息[17]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 積雪草代謝產(chǎn)物分析

        選取積雪草葉片、莖和根3組,設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)共9個(gè)樣品,進(jìn)行代謝組分析,基于LC-MS非靶向檢測(cè)共檢測(cè)出440種代謝物質(zhì)。其中氨基酸及其衍生物、生物堿、類脂化合物、糖與苷類以及萜類等5類代謝產(chǎn)物在積雪草代謝物質(zhì)中所占比例最高,均達(dá)到10%以上,分別有60種、54種、52種、50種和49種,還檢測(cè)到有機(jī)酸21種,甾族化合物15種,黃酮類12種,此外還有極少數(shù)的簡(jiǎn)單苯丙素類、維生素及木質(zhì)素、香豆素和揮發(fā)油類物質(zhì),不同類型代謝物質(zhì)相對(duì)所占比例見(jiàn)圖1。

        圖1 積雪草中不同類型的代謝產(chǎn)物及其相對(duì)占比

        對(duì)相同種類代謝產(chǎn)物在積雪草不同部位中的相對(duì)含量分析發(fā)現(xiàn),萜類和黃酮類物質(zhì)在葉片中含量明顯高于莖部和根部;氨基酸及其衍生物、生物堿類、類脂化合物、糖與苷類、酚類及酚酸類以及有機(jī)酸類物質(zhì)的相對(duì)含量都是根部高于莖部和葉部;揮發(fā)油類物質(zhì)在莖和根中的相對(duì)含量顯著高于葉部;其余代謝物質(zhì)(核苷酸及其衍生物、甾族化合物、簡(jiǎn)單苯丙素類、維生素及木質(zhì)素、香豆素及揮發(fā)油)在葉片、莖部和根部的含量都差別不大(表1)。

        表1 積雪草葉片、莖和根中代謝產(chǎn)物具體成分、數(shù)量及含量的平均值

        2.2 有效成分分析

        根據(jù)檢測(cè)結(jié)果,代謝產(chǎn)物中積雪草有效成分被檢測(cè)出的有α-香樹(shù)脂醇型三萜皂苷類積雪草苷和α-香樹(shù)脂醇型三萜酸類積雪草酸2種物質(zhì)。對(duì)積雪草葉片、莖和根中的相對(duì)含量分析表明,積雪草苷和積雪草酸均在其葉片中含量最高,根中含量最低;其中積雪草苷在葉片中的含量顯著高于莖部和根部,而積雪草酸在葉片和莖中顯著高于其根部;此外由表2可知在積雪草的不同部位中積雪草酸的相對(duì)含量均明顯高于積雪草苷。

        表2 積雪草中積雪草苷和積雪草酸不同部位相對(duì)含量

        2.3 黃酮類成分分析

        在此次LC-MS非靶向檢測(cè)中,從積雪草根、莖和葉中共檢測(cè)出12種黃酮類物質(zhì)(表3),其中有6種屬于黃酮,3種屬于黃酮醇,還有異黃酮、二氫黃酮以及二氫查爾酮各1種。進(jìn)一步對(duì)12種黃酮類代謝產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn),山奈酚、牡荊素和木犀草素在積雪草葉片中的相對(duì)含量極顯著高于根部和莖部,其中以山奈酚的相對(duì)含量最高,牡荊素次之;橙皮素、黃芩素、根皮苷、黃芪苷在積雪草三個(gè)部位的總體相對(duì)含量較低,其中以黃芩素和根皮苷最低;桔皮素在其莖中相對(duì)含量較高,而根和葉中相對(duì)含量接近,但總體含量也相對(duì)較低;漆樹(shù)黃酮、川陳皮素、槲皮素、染料木素在積雪草根、莖和葉中的相對(duì)含量接近(圖2)。

        表3 積雪草中黃酮類成分不同部位相對(duì)含量

        圖2 積雪草中黃酮類物質(zhì)在不同部位的相對(duì)含量

        3 討論與結(jié)論

        積雪草在我國(guó)多個(gè)地區(qū)廣泛分布,其在中草藥應(yīng)用方面全株入藥,因此在采藥時(shí)會(huì)將整株植株挖掉,這是對(duì)植物資源和生態(tài)環(huán)境的極大破壞。本研究采集云南省野生積雪草植株的葉片、莖和根,利用LC-MS對(duì)其進(jìn)行非靶向代謝組檢測(cè),分析其不同部位代謝物質(zhì)的種類及其相對(duì)含量,并對(duì)積雪草中2種重要的有效成分(積雪草苷及積雪草酸)和黃酮類成分在根、莖和葉中的相對(duì)含量進(jìn)行分析。

        積雪草苷和積雪草酸是積雪草中其非常重要的兩種主要成分,它們的主要功效也非常相似,其中積雪草苷能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散,在治療惡性腫瘤方面具有積極治療作用,同時(shí)也因?yàn)槠鋵?duì)于創(chuàng)面愈合有一定作用,可預(yù)防緩解人類的皮膚創(chuàng)傷和潰瘍,更能減少皮膚結(jié)核和麻風(fēng)病發(fā)生[18];積雪草酸對(duì)皮膚潰瘍、疤痕疙瘩、局限性硬皮病、萎縮性硬化性苔蘚等一些皮膚病具有較好的治療效果[19],此外還具有降血脂及保護(hù)肝臟的作用[20]。在本研究中積雪草的兩種主要有效成分在3個(gè)不同部位中,積雪草酸的相對(duì)含量都顯著高于積雪草苷,且兩種物質(zhì)都是在其葉片中最高,莖部次之,根部最低。綜上所述,在后續(xù)對(duì)積雪草的應(yīng)用中,若僅需要積雪草苷或積雪草酸時(shí)只需采摘其葉片而將根部保留讓其繼續(xù)生長(zhǎng),這樣既可以保證積雪草的藥用價(jià)值也可以保護(hù)植物資源和生態(tài)環(huán)境。

        積雪草所含化學(xué)成分多樣,其中黃酮類化合物作為植物次級(jí)代謝產(chǎn)物之一,不僅在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用,而且具有顯著的藥理活性,如二氫黃酮類化合物柚皮素(naringenin)具有抗炎、抗癌活性[5];黃酮醇類化合物山奈酚(kaempferol)具有抗焦慮、抗過(guò)敏活性[21];異黃酮類化合物染料木素(genistein)對(duì)前列腺癌、乳腺癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用等[22]。在前人的研究中發(fā)現(xiàn)積雪草中含有多種黃酮類物質(zhì),但是未見(jiàn)有研究者對(duì)其不同部位中的黃酮類化合物進(jìn)行研究,本研究通過(guò)LC-MS在積雪草中檢測(cè)出5類共12種黃酮類化合物,這些黃酮類物質(zhì)的總含量及其在積雪草不同部位中的相對(duì)含量均有所差異,相較于已經(jīng)報(bào)道關(guān)于積雪草化學(xué)物質(zhì)的相關(guān)文獻(xiàn),本研究弄清黃酮類物質(zhì)在積雪草不同部位的相對(duì)含量,豐富了積雪草中黃酮類化合物的研究,為后續(xù)研究積雪草中黃酮類化合物的藥用價(jià)值和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供參考。

        本試驗(yàn)研究結(jié)果表明:在積雪草中各類代謝物質(zhì)的數(shù)量有所差異,并且在不同部位中各類化學(xué)成分的相對(duì)含量也具有一定差異。該結(jié)果與李文芳等[23]對(duì)獨(dú)根草不同部位幾種化學(xué)成分的分析及張少平等[24]在對(duì)馬齒莧根莖葉中類黃酮代謝的研究結(jié)果相似,證明此研究結(jié)果具有一定的科學(xué)性。在不同部位代謝物質(zhì)含量有所差異可能與植物各器官自身的代謝活動(dòng)以及相關(guān)次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)藏存在差異有關(guān),也可能是因?yàn)楦鞑课坏某跎x產(chǎn)物含量差異較大,導(dǎo)致各類次生代謝產(chǎn)物的相對(duì)含量不同。

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