李嬌珍，孫正海，蔡起航，丁慕溪，房佳茹，王坤

(1.西南林業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院,云南 昆明 650224;2.云南省面向南亞?wèn)|南亞經(jīng)濟(jì)林全產(chǎn)業(yè)鏈聯(lián)合研發(fā)中心,云南 昆明 650224;3.云南省高效經(jīng)濟(jì)林培育示范型國(guó)際科技合作基地,云南 昆明 650224)

積雪草(Centellaasiatic(L.)Urban)為傘形科積雪草屬多年生草本植物，別名雷公根、馬蹄草、錢(qián)齒草、打的落、十八缺、半邊錢(qián)、崩大碗等，其廣泛分布于南北半球熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國(guó)主要分布在長(zhǎng)江以南的華南、華東、中南及西南地區(qū)[1]。在古代積雪草就已經(jīng)被收載為常用中藥，最早出現(xiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味苦、辛，寒，歸肝、脾、腎經(jīng)，具有清熱利濕、解毒消腫的作用，用于濕熱黃疸、中暑腹瀉、石淋血淋、癰腫瘡毒、跌打損傷等[1-2]。在現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)中研究發(fā)現(xiàn)，積雪草還有抗抑郁、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)以及免疫調(diào)節(jié)作用[3]。積雪草應(yīng)用形式多樣，除作藥用外也廣泛被食用，有國(guó)外學(xué)者利用積雪草的植物提取物開(kāi)發(fā)功能性飲料[4]，在我國(guó)以干燥葉片入茶，多用于涼茶，在東南亞一些國(guó)家新鮮葉可作蔬菜或果汁[5]；此外，基于其抑制瘢痕增生及修復(fù)皮膚損傷的作用，已經(jīng)被大量用于美容，因此逐漸成為重要的商業(yè)產(chǎn)品。

積雪草作為藥食同源植物一直廣受關(guān)注，目前國(guó)內(nèi)外的研究者們對(duì)積雪草的主要化學(xué)成分及提取方法、藥理作用及其作用機(jī)制進(jìn)行廣泛而深入的研究。對(duì)積雪草化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分主要包括三萜類、多炔烯烴類、黃酮類和揮發(fā)油類等[6-7]。近幾年來(lái)相關(guān)學(xué)者關(guān)于積雪草的化學(xué)物質(zhì)有新的發(fā)現(xiàn)，徐曉衛(wèi)等[8]通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜法研究積雪草全草揮發(fā)油的化學(xué)成分共鑒定出 57種化合物；張偉等[9]采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HS-SPME-GC-MS)，從積雪草中鑒定出16種揮發(fā)性成分；馬燦等[10]以積雪草酸結(jié)構(gòu)為母核，經(jīng)乙?；⑺獾确磻?yīng)合成一個(gè)新的未見(jiàn)報(bào)道的積雪草酸所對(duì)應(yīng)的苷酯；Bo Ren等[11]在2021年從積雪草全草中分離得到2種未被描述的烏拉烷型三萜皂苷，分別命名為積雪草苷H 和積雪草苷I；2022年有學(xué)者在探索積雪草全草的生物活性化合物時(shí)，發(fā)現(xiàn)兩種新的黃酮醇衍生物[12]。在化學(xué)物質(zhì)含量方面的研究中張小剛[13]測(cè)定了14種不同居群積雪草主要成分積雪草苷的含量，發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源積雪草之間化學(xué)成分有較大的的差異；王青等[6]在2014年測(cè)定了不同產(chǎn)地積雪草中積雪草苷和羥基積雪草苷，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地含量差別較大；閆凱等[14]在2017年建立超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜( UPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定積雪草中 7 種有效成分的含量；張培培等[15]比較研究中國(guó)和印尼積雪草藥材化學(xué)成分的差異，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于中國(guó)的積雪草藥材中積雪草苷含量較高，而印尼積雪草藥材中積雪草苷含量較低；2020年有國(guó)外學(xué)者對(duì)積雪草葉粉化學(xué)及元素成分進(jìn)行評(píng)價(jià)[16]，目前未見(jiàn)對(duì)積雪草不同部位中的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行報(bào)道。本研究以積雪草的根、莖和葉3個(gè)不同組織部位作為研究對(duì)象，利用非靶向代謝組學(xué)液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)對(duì)積雪草不同部位中的化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)，以期為后續(xù)其藥理學(xué)研究及應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

Vanquish液相色譜儀 (Thermo賽默飛世爾科技公司)，Q Exactive型質(zhì)譜儀(Thermo賽默飛世爾科技公司)，高速冷凍離心機(jī)(H1850-R，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，混勻儀( BE-96，海門(mén)麒麟貝爾實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司)，超聲波清洗機(jī)(KW- 100TDV，昆山舒美實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，組織研磨機(jī)(MB-96，浙江美碧實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，濾膜(0.22 μm PTFE，天津金騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，玻璃珠(G8772-500G，Sigma)。

甲醇(LC-MS級(jí))、乙腈(LC-MS級(jí))購(gòu)自賽默飛世爾科技公司，2-氯-L-苯丙氨酸購(gòu)自上海阿拉丁生化科技公司，甲酸購(gòu)自梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司、甲酸銨購(gòu)自默克公司、H2O使用Milli-Q系統(tǒng)產(chǎn)生超純水(密理博)。

1.1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料積雪草于2021年11月采于云南省楚雄州元謀縣(海拔1 035.1 m，102.41°E、25.54°N)的自然野生種，經(jīng)過(guò)專家鑒定為積雪草。取積雪草的根、莖和葉各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 方法

樣品提取 精確稱量適量樣本于2 mL離心管中，加入600 μL甲醇〔含2-氯-L-苯丙氨酸(4 μmol/L)(-20 ℃保存)〕，渦旋振蕩30 s；加入100 mg玻璃珠，放入組織研磨器中，60 Hz研磨90 s；室溫超聲15 min；12 000 rpm 4 ℃離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm膜過(guò)濾，過(guò)濾液加入到檢測(cè)瓶中，用于LC-MS檢測(cè)。

色譜條件 ThermoVanquish(ThermoFisherScientific,USA)超高效液相系統(tǒng)，使用ACQUITYUPLCHSST3(2.1×150 mm,1.8 μm)(Waters,Milford,MA,USA)色譜柱，0.25 mL/min的流速，40 ℃的柱溫，進(jìn)樣量2 μL。正離子模式，流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈(C)和0.1%甲酸水(D)，梯度洗脫程序?yàn)椋?～1 min，2%C；1～9 min，2%～50%C；9～12 min，50%～98%C；12～13.5 min，98%C；13.5～14 min，98%～2%C；14～20 min，2%C。負(fù)離子模式，流動(dòng)相為乙腈(A)和5 mM甲酸銨水(B)，梯度洗脫程序?yàn)椋?～1 min，2%A；1～9 min，2%～50%A；9～12 min，50%～98%A；12～13.5 min，98%A；13.5～14 min，98%～2%A；14～17 min，2%A。

質(zhì)譜條件 ThermoQExactive質(zhì)譜檢測(cè)器(ThermoFisherScientific,USA)，電噴霧離子源(ESI)，正負(fù)離子模式分別采集數(shù)據(jù)。正離子噴霧電壓為3.50 kV，負(fù)離子噴霧電壓為-2.50 kV，鞘氣30 arb，輔助氣10 arb。毛細(xì)管溫度325 ℃，以分辨率70 000進(jìn)行一級(jí)全掃描，一級(jí)離子掃描范圍81～1 000 m/z，并采用HCD進(jìn)行二級(jí)裂解，碰撞電壓為30%，二級(jí)分辨率為17 500，采集信號(hào)前10離子進(jìn)行碎裂，同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除去除無(wú)必要的MS/MS信息[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 積雪草代謝產(chǎn)物分析

選取積雪草葉片、莖和根3組，設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)共9個(gè)樣品，進(jìn)行代謝組分析，基于LC-MS非靶向檢測(cè)共檢測(cè)出440種代謝物質(zhì)。其中氨基酸及其衍生物、生物堿、類脂化合物、糖與苷類以及萜類等5類代謝產(chǎn)物在積雪草代謝物質(zhì)中所占比例最高，均達(dá)到10%以上，分別有60種、54種、52種、50種和49種，還檢測(cè)到有機(jī)酸21種，甾族化合物15種，黃酮類12種，此外還有極少數(shù)的簡(jiǎn)單苯丙素類、維生素及木質(zhì)素、香豆素和揮發(fā)油類物質(zhì)，不同類型代謝物質(zhì)相對(duì)所占比例見(jiàn)圖1。

圖1 積雪草中不同類型的代謝產(chǎn)物及其相對(duì)占比

對(duì)相同種類代謝產(chǎn)物在積雪草不同部位中的相對(duì)含量分析發(fā)現(xiàn)，萜類和黃酮類物質(zhì)在葉片中含量明顯高于莖部和根部；氨基酸及其衍生物、生物堿類、類脂化合物、糖與苷類、酚類及酚酸類以及有機(jī)酸類物質(zhì)的相對(duì)含量都是根部高于莖部和葉部；揮發(fā)油類物質(zhì)在莖和根中的相對(duì)含量顯著高于葉部；其余代謝物質(zhì)(核苷酸及其衍生物、甾族化合物、簡(jiǎn)單苯丙素類、維生素及木質(zhì)素、香豆素及揮發(fā)油)在葉片、莖部和根部的含量都差別不大(表1)。

表1 積雪草葉片、莖和根中代謝產(chǎn)物具體成分、數(shù)量及含量的平均值

2.2 有效成分分析

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，代謝產(chǎn)物中積雪草有效成分被檢測(cè)出的有α-香樹(shù)脂醇型三萜皂苷類積雪草苷和α-香樹(shù)脂醇型三萜酸類積雪草酸2種物質(zhì)。對(duì)積雪草葉片、莖和根中的相對(duì)含量分析表明，積雪草苷和積雪草酸均在其葉片中含量最高，根中含量最低；其中積雪草苷在葉片中的含量顯著高于莖部和根部，而積雪草酸在葉片和莖中顯著高于其根部；此外由表2可知在積雪草的不同部位中積雪草酸的相對(duì)含量均明顯高于積雪草苷。

表2 積雪草中積雪草苷和積雪草酸不同部位相對(duì)含量

2.3 黃酮類成分分析

在此次LC-MS非靶向檢測(cè)中，從積雪草根、莖和葉中共檢測(cè)出12種黃酮類物質(zhì)(表3)，其中有6種屬于黃酮，3種屬于黃酮醇，還有異黃酮、二氫黃酮以及二氫查爾酮各1種。進(jìn)一步對(duì)12種黃酮類代謝產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)，山奈酚、牡荊素和木犀草素在積雪草葉片中的相對(duì)含量極顯著高于根部和莖部，其中以山奈酚的相對(duì)含量最高，牡荊素次之；橙皮素、黃芩素、根皮苷、黃芪苷在積雪草三個(gè)部位的總體相對(duì)含量較低，其中以黃芩素和根皮苷最低；桔皮素在其莖中相對(duì)含量較高，而根和葉中相對(duì)含量接近，但總體含量也相對(duì)較低；漆樹(shù)黃酮、川陳皮素、槲皮素、染料木素在積雪草根、莖和葉中的相對(duì)含量接近(圖2)。

表3 積雪草中黃酮類成分不同部位相對(duì)含量

圖2 積雪草中黃酮類物質(zhì)在不同部位的相對(duì)含量

3 討論與結(jié)論

積雪草在我國(guó)多個(gè)地區(qū)廣泛分布，其在中草藥應(yīng)用方面全株入藥，因此在采藥時(shí)會(huì)將整株植株挖掉，這是對(duì)植物資源和生態(tài)環(huán)境的極大破壞。本研究采集云南省野生積雪草植株的葉片、莖和根，利用LC-MS對(duì)其進(jìn)行非靶向代謝組檢測(cè)，分析其不同部位代謝物質(zhì)的種類及其相對(duì)含量，并對(duì)積雪草中2種重要的有效成分(積雪草苷及積雪草酸)和黃酮類成分在根、莖和葉中的相對(duì)含量進(jìn)行分析。

積雪草苷和積雪草酸是積雪草中其非常重要的兩種主要成分，它們的主要功效也非常相似，其中積雪草苷能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散，在治療惡性腫瘤方面具有積極治療作用，同時(shí)也因?yàn)槠鋵?duì)于創(chuàng)面愈合有一定作用，可預(yù)防緩解人類的皮膚創(chuàng)傷和潰瘍，更能減少皮膚結(jié)核和麻風(fēng)病發(fā)生[18]；積雪草酸對(duì)皮膚潰瘍、疤痕疙瘩、局限性硬皮病、萎縮性硬化性苔蘚等一些皮膚病具有較好的治療效果[19]，此外還具有降血脂及保護(hù)肝臟的作用[20]。在本研究中積雪草的兩種主要有效成分在3個(gè)不同部位中，積雪草酸的相對(duì)含量都顯著高于積雪草苷，且兩種物質(zhì)都是在其葉片中最高，莖部次之，根部最低。綜上所述，在后續(xù)對(duì)積雪草的應(yīng)用中，若僅需要積雪草苷或積雪草酸時(shí)只需采摘其葉片而將根部保留讓其繼續(xù)生長(zhǎng)，這樣既可以保證積雪草的藥用價(jià)值也可以保護(hù)植物資源和生態(tài)環(huán)境。

積雪草所含化學(xué)成分多樣，其中黃酮類化合物作為植物次級(jí)代謝產(chǎn)物之一，不僅在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用，而且具有顯著的藥理活性，如二氫黃酮類化合物柚皮素(naringenin)具有抗炎、抗癌活性[5]；黃酮醇類化合物山奈酚(kaempferol)具有抗焦慮、抗過(guò)敏活性[21]；異黃酮類化合物染料木素(genistein)對(duì)前列腺癌、乳腺癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用等[22]。在前人的研究中發(fā)現(xiàn)積雪草中含有多種黃酮類物質(zhì)，但是未見(jiàn)有研究者對(duì)其不同部位中的黃酮類化合物進(jìn)行研究，本研究通過(guò)LC-MS在積雪草中檢測(cè)出5類共12種黃酮類化合物，這些黃酮類物質(zhì)的總含量及其在積雪草不同部位中的相對(duì)含量均有所差異，相較于已經(jīng)報(bào)道關(guān)于積雪草化學(xué)物質(zhì)的相關(guān)文獻(xiàn)，本研究弄清黃酮類物質(zhì)在積雪草不同部位的相對(duì)含量，豐富了積雪草中黃酮類化合物的研究，為后續(xù)研究積雪草中黃酮類化合物的藥用價(jià)值和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供參考。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明：在積雪草中各類代謝物質(zhì)的數(shù)量有所差異，并且在不同部位中各類化學(xué)成分的相對(duì)含量也具有一定差異。該結(jié)果與李文芳等[23]對(duì)獨(dú)根草不同部位幾種化學(xué)成分的分析及張少平等[24]在對(duì)馬齒莧根莖葉中類黃酮代謝的研究結(jié)果相似，證明此研究結(jié)果具有一定的科學(xué)性。在不同部位代謝物質(zhì)含量有所差異可能與植物各器官自身的代謝活動(dòng)以及相關(guān)次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)藏存在差異有關(guān)，也可能是因?yàn)楦鞑课坏某跎x產(chǎn)物含量差異較大，導(dǎo)致各類次生代謝產(chǎn)物的相對(duì)含量不同。