李祥佩，王屹然，王軍生，許琳，蔣菁蕊，魏虹

胃癌患者預(yù)后與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移情況及分化程度密切相關(guān)[1]，因此了解胃癌發(fā)生及演進(jìn)機(jī)制，為臨床綜合靶向治療及預(yù)后預(yù)測提供指導(dǎo)尤為重要。凋亡蛋白酶活化因子(apoptotic protease activating factor 1 ，Apaf-1)屬于抑癌基因參與線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑[2-3]。文獻(xiàn)報(bào)道，胃癌細(xì)胞存在多種凋亡細(xì)胞異常，通過誘導(dǎo)失活及凋亡抑制來達(dá)到抑制基因過表達(dá)作用[4]。單純LIM結(jié)構(gòu)域(LIM domain only，LMO)是由1個(gè)或多個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域組成的蛋白家族，而LMO1是LMO家族中的一員，可與其他蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合體，調(diào)節(jié)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄活性，參與細(xì)胞分化增殖過程[5-6]。胃癌進(jìn)展是癌細(xì)胞不斷增殖分化的過程，故結(jié)合上述2指標(biāo)作用機(jī)制，考慮胃癌組織中Apaf-1、LMO1的表達(dá)可能與胃癌患者預(yù)后存在一定關(guān)系。鑒于此，本研究觀察胃癌組織中Apaf-1、LMO1的表達(dá)及其與臨床預(yù)后關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年2月—2019年2月徐州市腫瘤醫(yī)院消化內(nèi)科接受手術(shù)治療且術(shù)后完成隨訪胃癌患者80例臨床資料，其中男52例，女28例，年齡46～76(54.93±5.46)歲；發(fā)病部位：胃體27例，胃竇33例，賁門20例。隨訪時(shí)間7～36(21.58±8.23)個(gè)月，因腫瘤病死22例(27.50%，病死組)，存活58例(72.50%，存活組)。2組患者性別、年齡、發(fā)病部位、誘發(fā)因素、基礎(chǔ)疾病比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；病死組胃癌Ⅳ期比例、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例、低分化程度比例均高于存活組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 存活組與病死組胃癌患者臨床資料比較

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①初診原發(fā)性胃癌，且行手術(shù)治療，經(jīng)病理明確診斷為胃癌；②術(shù)前均未接受放化療及靶向治療；③病歷資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后病理檢查提示為其他部位的轉(zhuǎn)移性癌；②合并其他惡性腫瘤疾病者；③合并嚴(yán)重心、腎等嚴(yán)重障礙性疾病者；④合并急慢性感染性疾病者；⑤合并免疫功能缺陷疾病者；⑥家族遺傳史。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 胃癌三項(xiàng)檢測：患者入院次日清晨抽取空腹肘靜脈血5 ml，離心留取血清，置于-70℃低溫冰箱中保存待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清胃泌素-17(gastrin-17，G-17)、血清胃蛋白酶原Ⅰ(proteasogen Ⅰ，PGⅠ)、PGⅡ水平，檢測試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供。

1.3.2 血清腫瘤標(biāo)志物檢測：采用美國貝克曼庫爾特有限公司的UniCel DxI800全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀，以電化學(xué)發(fā)光法檢測癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、癌抗原19-9(cancer antigen 19-9 ，CA19-9)、CA724，檢測試劑盒均由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供。

1.3.3 胃癌組織中Apaf-1、LMO1檢測：采用免疫組化法檢測，取胃癌組織標(biāo)本甲醛固定后進(jìn)行常規(guī)脫水、浸蠟、包埋等處理，連續(xù)切片(厚度4 μm)，切片經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)、加一抗二抗孵育等步驟后，進(jìn)行DAB顯色，蘇木精復(fù)染后使用中性樹膠封片，在顯微鏡(澳浦光電 XSP-C204型)下觀察并攝片。顯微鏡下觀察Apaf-1、LMO1出現(xiàn)黃色、棕色或棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞。Apaf-1陽性細(xì)胞數(shù)所占比例≥26%則判定為陽性；LMO1陽性細(xì)胞數(shù)所占比例≥20%則判定為陽性。

1.3.4 隨訪情況：患者均以術(shù)后出院當(dāng)天作為隨訪起點(diǎn)，通過門診復(fù)查及電話形式進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間為3年(或至患者因胃癌病死)，隨訪截至2022年3月。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清胃癌三項(xiàng)比較 2組患者血清G-17、PGⅠ、PGⅡ比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 存活組與病死組患者血清胃癌三項(xiàng)比較

2.2 2組血清腫瘤標(biāo)志物比較 病死組患者血清CEA、CA19-9和CA724水平均高于存活組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表3 存活組與病死組血清腫瘤標(biāo)志物比較

2.3 胃癌組織Apaf-1、LMO1表達(dá)比較 80例胃癌患者中Apaf-1陽性表達(dá)50例(62.50%)，陰性表達(dá)30例(37.50%)；LMO1陽性表達(dá)53例(66.25%)，陰性27例(33.75%)，見圖1、2。病死組Apaf-1陽性表達(dá)率低于存活組，LMO1陽性表達(dá)率高于存活組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

圖1 Apaf-1在胃癌組織中表達(dá)(SP染色，×400)

圖2 LMO1在胃癌組織中表達(dá)(SP染色，×400)

表4 2組胃癌組織中Apaf-1、LMO1陽性表達(dá)比較 [例(%)]

2.4 Apaf-1、LMO1陽性表達(dá)與胃癌標(biāo)志物相關(guān)性分析 Apaf-1、LMO1陽性表達(dá)與G-17、PGⅠ、PGⅡ均無相關(guān)性(P>0.05)；Apaf-1陽性表達(dá)與CEA、CA19-9、CA724均呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)；LMO1陽性表達(dá)與CEA、CA19-9、CA724均呈正相關(guān)(P<0.01)，見表5。

表5 Apaf-1、LMO1陽性表達(dá)與胃癌標(biāo)志物相關(guān)性分析

2.5 胃癌組織中Apaf-1、LMO1表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 將胃癌患者生存情況作為因變量(1=病死，0=存活)，胃癌組織中Apaf-1、LMO1表達(dá)作為自變量(0=陰性表達(dá)，1=陽性表達(dá))，經(jīng)多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，Apaf-1陽性表達(dá)是胃癌患者臨床預(yù)后的保護(hù)因素(P<0.01)；LMO1陽性表達(dá)是胃癌患者臨床預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表6。

表6 胃癌組織中Apaf-1、LMO1表達(dá)對胃癌患者預(yù)后影響的Logistic回歸分析

3 討 論

胃癌病情進(jìn)展迅速易發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移，治療難度大，預(yù)后較差。本研究結(jié)果顯示，80例胃癌患者術(shù)后3年病死率27.50%，與吳春松等[7]收集173例胃癌患者隨訪3年病死率27.17%相一致，提示胃癌患者短期內(nèi)仍具有較高的病死率?？紤]可能與患者自身體質(zhì)、腫瘤分期、腫瘤惡性程度及侵襲等因素相關(guān)。因此對胃癌的發(fā)生進(jìn)展機(jī)制進(jìn)行深入研究有利于臨床治療方案的制定及胃癌患者預(yù)后的改善。胃癌進(jìn)展是多基因、多細(xì)胞因子參與的過程，而抑癌基因失活、原癌基因激活及其介導(dǎo)基因信號(hào)傳導(dǎo)貫穿癌細(xì)胞生長、增殖、擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移全程，促使細(xì)胞增殖和凋亡之間平衡被打破，導(dǎo)致胃癌細(xì)胞發(fā)生惡性生長及轉(zhuǎn)化，故胃癌細(xì)胞的凋亡與增殖平衡是胃癌發(fā)生及進(jìn)展的重要機(jī)制[8-9]。

腫瘤細(xì)胞凋亡是通過內(nèi)源性線粒體途徑及外源性細(xì)胞表面死亡受體途徑誘發(fā)，其中線粒體參與多種凋亡信號(hào)通路，被稱為凋亡通路的“門衛(wèi)”[10]。而Apaf-1是線粒體依賴途徑的關(guān)鍵蛋白酶之一，是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)，分子量為130 kD，在人體內(nèi)廣泛表達(dá)，見于多種器官及細(xì)胞內(nèi)，包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域：氨基末端有一個(gè)半胱氨酸蛋白酶募集域(CARD)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)及多個(gè)WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域的C端，其中CARD可與半胱天冬氨酸激酶9(Caspase-9)結(jié)合形成凋亡復(fù)合體，NOD可與ATP或dATP結(jié)合成核苷酸結(jié)合區(qū)域，而WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)的C端與細(xì)胞色素C束結(jié)合[11-12]。Apaf-1在細(xì)胞中常呈現(xiàn)一種自發(fā)性的抑制狀態(tài)，但其活化需要依賴于dATP和細(xì)胞色素C束，當(dāng)機(jī)體細(xì)胞受到外界刺激、染色體損傷或細(xì)胞缺氧等一系列凋亡刺激后，則促使Apaf-1被激活，繼而觸發(fā)及激活線粒體介導(dǎo)的凋亡途經(jīng)[13-14]。本研究結(jié)果顯示，Apaf-1在多數(shù)胃癌患者中均有高表達(dá)，但在預(yù)后較差的胃癌患者中Apaf-1表達(dá)下調(diào)，提示Apaf-1表達(dá)下調(diào)可能參與胃癌患者不良預(yù)后的發(fā)生，進(jìn)一步經(jīng)Logistic回歸分析結(jié)果顯示，胃癌組織中Apaf-1表達(dá)與胃癌患者臨床預(yù)后密切相關(guān)，是重要的調(diào)節(jié)因子。分析其原因?yàn)?，Apaf-1高表達(dá)可促使線粒體內(nèi)膜間隙釋放細(xì)胞色素C束進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，與Apaf-1中的WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域的C端結(jié)合、募集及活化Apaf-1。而Apaf-1的激活則通過CARD區(qū)域與Caspase-9結(jié)合形成凋亡體，發(fā)揮促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡作用[15]。此外寡聚化的Apaf-1與活化的Caspase-9可活化下游的Caspase-3及Caspase-7等一系列半胱天冬氨酸激酶原及細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使受累的癌細(xì)胞經(jīng)歷凋亡過程，最終滅亡，起到控制胃癌疾病進(jìn)展，延長患者生存期，改善預(yù)后的作用[16]。而Apaf-1表達(dá)下調(diào)，則以Apaf-1為主要依賴途徑的線粒體凋亡途徑受到抑制，使癌細(xì)胞凋亡受到抑制，突變的胃癌細(xì)胞得以生存與增殖，最終導(dǎo)致胃癌細(xì)胞生長，發(fā)生轉(zhuǎn)移與浸潤，加重病情，最終導(dǎo)致胃癌患者病死[17]。

LMO1是一種鋅指蛋白，含有2個(gè)LIM基元蛋白，主要分布于細(xì)胞核內(nèi)，目前LMO1在機(jī)體內(nèi)的功能尚未完全闡明，但認(rèn)為其可能通過LIM與其他轉(zhuǎn)錄因子作用直接或間接影響細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞分化及發(fā)育調(diào)控作用[18-19]。文獻(xiàn)報(bào)道，LMO蛋白家族成員與腫瘤發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，而LMO1作為LMO家族中一員，在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)可明顯增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)腫瘤生長[20-21]。因此考慮LMO1可能參與調(diào)控胃癌的進(jìn)展過程，與胃癌患者預(yù)后相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，LMO1上調(diào)也可能參與胃癌患者不良預(yù)后的發(fā)生。進(jìn)一步經(jīng)Logistic回歸分析結(jié)果顯示，LMO1陽性表達(dá)是胃癌患者臨床預(yù)后的危險(xiǎn)因素，證實(shí)LMO1表達(dá)上調(diào)參與胃癌不良預(yù)后的發(fā)生。胃癌組織中LMO1表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)胃癌組織細(xì)胞增殖、分化、浸潤及轉(zhuǎn)移，加重胃癌患者病情，導(dǎo)致病死。分析其原因?yàn)椋?1)LMO1表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)AKT總磷酸化水平，而AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)的經(jīng)典信號(hào)通路，因此LMO1表達(dá)可通過調(diào)節(jié)AKT/PI3K信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖分化，促使胃癌細(xì)胞生長、遷移和侵襲，促進(jìn)胃癌進(jìn)展，影響患者生存，增加病死率[22-24]。(2)文獻(xiàn)報(bào)道，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換參與90%以上原發(fā)性上皮腫瘤進(jìn)展過程，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換可促使鄰近細(xì)胞黏附緊密的上皮細(xì)胞獲得較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移及侵襲能力[25]。而轉(zhuǎn)錄生長因子在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換中起到重要調(diào)節(jié)作用，可通過抑制E鈣黏素表達(dá)，增強(qiáng)間質(zhì)細(xì)胞特性，產(chǎn)生大量金屬蛋白激酶、基質(zhì)蛋白及細(xì)胞生長因子，繼而促進(jìn)癌組織生長，促進(jìn)癌細(xì)胞遷移[26]。孫云等[27]研究結(jié)果顯示，LMO1可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄生長因子間接或直接經(jīng)過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換影響胃癌組織的增殖分化、侵襲及轉(zhuǎn)移能力，促進(jìn)胃癌進(jìn)展，導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后較差。這一結(jié)論也得到了本研究結(jié)果的證實(shí)。

綜上所述，Apaf-1高表達(dá)是胃癌不良預(yù)后的保護(hù)因素，而LMO1高表達(dá)則是胃癌不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素，兩者均與胃癌患者預(yù)后相關(guān)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

李祥佩：課題設(shè)計(jì)，實(shí)施研究過程，論文撰寫；王屹然：提出研究思路，論文審核；王軍生、蔣菁蕊：實(shí)施研究過程，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；許琳、魏虹：實(shí)施研究過程，數(shù)據(jù)收集