曲 孟， 張 露， 齊 欣， 崔承弼

(延邊大學 農學院，吉林 延吉 133002)

糖尿病作為臨床常見的慢性疾病之一，會引起一系列的并發(fā)癥[1]，在發(fā)達國家已成為危害人們健康的3大疾病之一[2]。我國糖尿病患者的數(shù)量位居世界第1[3],全球約有4.24億人患病，預計到2030年將增加到5.52億[4]。糖尿病可累及各年齡和種族的人，臨床診斷靠癥狀和空腹或隨機血糖 (有時需做葡萄糖耐量試驗)判斷，有3種主要類型——胰島素依賴型(1型)、非胰島素依賴性型(2型)和妊娠糖尿病。

1型糖尿病又稱胰島素依賴型糖尿病[5]，而且大部分認為是2種因素彼此長時間作用的結果，這2種分別是遺傳因素和環(huán)境因素。其發(fā)病特點有3種，在兒童和青少年時期發(fā)病頻繁、發(fā)病急、必須要使用胰島素[6]。長期使用不僅有依賴性，而且也具有不小的副作用，因此，依賴性低、安全性高、不良反應少的植物多糖和微生物多糖已成為許多糖尿病飲食治療研究者的研究方向[7]。有研究表明[8]，總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和糖化血紅蛋白(GHb)[9]指標的下降能顯著改善糖尿病小鼠脂代謝紊亂。α-葡萄糖苷酶(α-GC)是一類通過帶有α-糖苷鍵底物中的非還原端進行催化水解一種叫做α-葡萄糖基的酶的總稱[10]。它起著很重要的作用，與糖尿病有著密切聯(lián)系[11]。

紅參為人參的根部蒸干所制[12]。紅參中有許多活性成分，其中有一項很主要的成分那就是紅參多糖，而且其在紅參中所含有的成分較多[13]。最近幾年，植物多糖越來越被人們看重，經藥理研究表明[14]，多糖具有較好的抗病毒、降血糖、抗腫瘤、免疫調節(jié)和抗炎等方面的生物活性[15-16]，而且它的毒副作用相對較小[17]。紅參多糖作為紅參中主要成分之一[18]，其生物活性也是多種多樣的。

很多關于植物多糖降血糖的文獻報道，隨著藥物中多糖濃度的增加或其他復合配方成分的添加，其降血糖效果也隨之增加，而目前關于紅參多糖的研究甚少，故該試驗采用紅參多糖對糖尿病小鼠進行治療，研究對比不同劑量的紅參多糖對患糖尿病小鼠的降血糖效果，以及對其糖耐量(OGTT)、GHb、TC、TG、α-GC、臟器系數(shù)等相關指標是否具有影響，目的在于探索紅參多糖的降血糖作用，為治療糖尿病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

1) 材料：用5年生人工種植的人參制作紅參，延邊韓工坊健康制品有限公司。

2) 試劑：NaCl注射液(0.9%)，于吉林康乃爾藥業(yè)有限公司購入；檸檬酸、檸檬酸鈉，AR級，于天津東華試劑廠購入；鹽酸二甲雙胍片，純度以C2H22N5·HCL記0.5 g/片，于天方藥業(yè)有限公司購入；鏈脲佐菌素(STZ)，純度≥98%(HPLC)，于美國SIGMA公司購入；葡萄糖粉劑，購于廣西梧州制藥有限公司。

3) 試劑盒：糖化血紅蛋白(GHb)試劑盒、總膽固醇(TC)試劑盒、α-葡萄糖苷酶(α-GC)活性檢測試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒，于南京市建成生物研究所購入。

1.1.2 動物

雄性昆明小鼠40只，體重為18～20 g左右，在恒溫溫度大約為20～25 ℃、 相對濕度為(55±10)%的食品研究中心動物室內進行適應性喂養(yǎng)7 d,自由攝食和飲水,多籠飼養(yǎng)。 喂養(yǎng)所用的飼料、墊料等一些基礎用品由延邊大學實驗動物中心提供。

1.1.3 儀器

水浴鍋：OSB-2100-CE型，于東京理化器械株式會社購入；離心機：TG16A-WS型，于上海盧湘儀器有限公司購入；實驗型冷凍干燥機：LyoQuest -55型，于西班牙Telstar集團購入；血糖儀：AG-605型，于天津市九安醫(yī)療公司購入；真空泵：DTC-22B型，于日本Uluac Kiko公司購入；落地式連續(xù)投料粉碎機：DF-35型，于溫嶺市林大機械有限公司購入；冷凝器：CCA-1111-CE型，于東京理化器械株式會社購入；渦旋混勻器：MS 3 basic型，于德國IKA集團購入；1次性無菌注射器：規(guī)格為1 mL，于上海金塔醫(yī)用器材有限公司購入。

1.2 方法

1.2.1 紅參的預處理、紅參多糖的提取及測定

1) 預處理：將粉碎處理后的紅參，過60目篩，進而得到紅參粉末，隨即進行稱量。

2) 紅參多糖的提取：利用熱水浸提法[19]，按照料液比1∶15(g∶mL)，放置水浴鍋中浸提，溫度為100 ℃、浸提時間為4 h，取出靜置冷卻至室溫后將濾液3 500 r/min離心10 min，將得到的上清液進行過濾，把得到的濾液蒸發(fā)濃縮，然后將制得的紅參多糖濃縮液放入-80 ℃冰箱中進行冷凍，再進行冷凍干燥的操作，將凍干之后所得到的提取物粉末密封并儲存，以備后續(xù)實驗。

3) 葡萄糖標準曲線的繪制：采用105 ℃干燥至恒重的D-葡萄糖作為對照品，并精密的稱取25 mg，然后加入適量水溶解D-葡萄糖，并將其定容到25 mL容量瓶中，然后翻轉搖勻，就會得到葡萄糖儲備液，濃度含量1 mg/mL。精密量取所得到的葡萄糖儲備，分別量取6種含量的葡萄糖液置于25 mL容量瓶中，采用了0.3、0.6、0.9、1.2、1.5和1.8 mg這6種含量，用蒸餾水稀釋到刻度，然后得到了不同濃度(12、24、36、48、60、72 μg/mL)的葡萄糖標準溶液。將各濃度的葡萄糖標準溶液都進行精密量取，各量取2 mL，然后加入1 mL的質量分數(shù)為5%的苯酚溶液，搖晃均勻之后立刻加入5 mL的濃硫酸，搖勻，在沸水浴中加熱20 min進行顯色反應，在最大吸收波長490 nm處測定吸光度，用蒸餾水做空白對照，制圖，求得標準曲線及回歸方程。

4) 苯酚-硫酸法測定紅參多糖：用分析天平精密的稱取人參多糖粉末純品10 mg，放在10 mL容量瓶中用蒸餾水定容。量取紅參多糖提取液約2.0 mL，稱取配置好的5%苯酚溶液1 mL倒入其中，搖晃將兩者混勻，快速的加入濃硫酸5 mL后渦旋至混合溶液澄清不渾濁，在沸水浴中進行加熱顯色反應持續(xù)20 min，然后將其靜置在室內冷卻至室溫。在最大吸收波長490 nm處測定吸光度(OD值)，用蒸餾水做空白對照，帶入標準曲線求得濃度C[20]。

1.2.2 糖尿病小鼠模型的構建

1) 鏈脲佐菌素(STZ)配置：量取STZ分裝在離心管中，采用1.5 mL規(guī)格的離心管，每管放12 mg的STZ，用錫紙將分裝后的離心管包裹起來。 將按照比例配置好的檸檬酸和檸檬酸鈉緩沖溶液(0.1 mol/L，pH值4.3～4.4) 溶解STZ， 配置成12 mg/mL注射液，將兩者充分搖晃達到混勻的效果，在避光的條件下放置在冰浴儲存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2) 小鼠造模：對小鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，對所有的小鼠正常飲水禁食12 h，進食過夜，測量小鼠體重以及空腹血糖水平，依據(jù)體重進行一次性大劑量腹腔注射12 mg/mL的STZ(劑量為120 mg/kg·BW)，建立1型糖尿病模型，將檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液同時注射給空白組所有小鼠進行假性處理。每組需在30 min內完成注射，注射結束后1 h恢復各組小鼠的進食[21]。

在造模后的第4天將所有小鼠進行禁食，之后測量小鼠的體重和空腹血糖值，11.1 mmol/mL 是血糖限值，超過11.1 mmol/mL即為高血糖，所以造模成功就是指所測得的空腹血糖值高于11.1 mmol/mL。成功即為1型糖尿病小鼠，同時將血糖值低于11.1 mmoL/mL的造模未成功的小鼠剔除[22]。

1.2.3 糖尿病小鼠分組

小鼠造模成功后，將小鼠按體重隨機分為6組，每組5只，每日按不同濃度灌胃給藥1次，按照小鼠體重的變化適當調節(jié)藥的劑量，空白組和陰性組不給藥，灌胃給蒸餾水。在為期30 d的灌胃期間每天都要記錄小鼠的體重、食物和水的攝入量。參考相關試驗[23]后對紅參多糖濃度的設置和小鼠每日允許攝入量進行設計(表1)。

表1 小鼠分組及灌胃劑量

1.2.4 動物實驗流程

小鼠造模成功后，每天都要進行灌胃給藥以及測量體重、攝食量和飲水量，每周需要定期進行空腹血糖的測量，4周后，最后1次測量小鼠的空腹血糖值，并且進行口服葡萄糖耐量試驗，然后對小鼠進行眼球取血，將血液收集在1.5 mL的離心管中，放置在冰上，降低溫度放置凝固，隨即脫頸處死，解剖，取其腎、脾、肝、心臟用0.9%的NaCl溶液沖洗臟器表面并測濕重。將收集的血液進行離心處理，將離心所得到的血漿和血細胞分開保存留用之后進行各項指標的測定。

1.2.5 指標測定

1) 灌胃期間小鼠的飲水量、攝食量和體重的測定：在灌胃的30 d期間，每天連續(xù)不斷測量小鼠的體重、攝食量、飲水量變化并記錄。其中食物效價計算方法：

食物效價=小鼠體重增加量/小鼠攝食量

2) 小鼠空腹血糖的測定：對小鼠進行12 h的隔夜禁食之后，將各組小鼠的尾巴剪去末端一小段，用血糖儀蘸取血液進行取血，測量其空腹血糖值然后將血糖值細心記錄,要求放棄尾端冒出的第1滴血，以第2滴血液所測得的血糖值為準。

3) 口服葡萄糖耐量的測定：最后1次灌胃后隔夜禁食12 h，經口按照劑量為2 g/kg·BW 1次性大劑量葡萄糖溶液灌胃后，每30 min測量1次血糖值持續(xù)觀察2 h，并記錄。

4) 臟器系數(shù)的測定：解剖小鼠取其腎、脾、肝、心臟并測濕重。其重量即為小鼠的臟器系數(shù)。

5) 生化指標的測定：將冰浴保存的血液和肝臟取出，按照試劑盒的使用方法進行操作，測定吸光值，求得TC、TG、GHb和α-GC含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果與分析

2.1 紅參水提多糖的提取率及純度

紅參粉末經水提后得到的紅參多糖，提取率為41.24%。

吸光值(OD值)為0.445 7，帶入葡萄糖標準曲線y=0.631 6 x+0.142 6得到紅參多糖含量為47.99%。

2.2 紅參多糖對小鼠基礎指標的影響

試驗期間通過對比各組觀察發(fā)現(xiàn)，空白組所用墊料干燥，小鼠毛發(fā)健康，體重迅速增長，體重最重，顯著高于注射STZ的各組小鼠(P<0.05)；陰性組小鼠的攝食量和飲水量顯著高于其他各組。所用物料嚴重浸濕，小鼠毛發(fā)枯黃粗糙，身材瘦??；各組狀態(tài)隨給藥次數(shù)的增加而有所改善。

由表2可知，空白組小鼠體重最重，食物利用率最高，陰性組食物利用率最低，其余給藥組隨著灌胃給藥次數(shù)的增加食物利用率逐漸提高。

表2 試驗期間對各組小鼠體重及攝食飲水的影響(n=5)

2.3 紅參多糖對小鼠血液指標的影響

2.3.1 對小鼠空腹血糖的影響

由圖1可知，造模之前，各組小鼠空腹血糖無明顯差異，造模成功后，未給藥時，各組小鼠空腹血糖值均高于11.1 mol/L。灌胃給藥后，陽性組和紅參多糖高中低劑量組血糖值均有所下降，且隨給藥次數(shù)的增加血糖值逐漸降低，空白組血糖仍保持較低，陰性組血糖值逐漸升高。其中，紅參多糖高劑量組對糖尿病小鼠的降血糖效果顯著，與鹽酸二甲雙胍的降血糖效果相近，因為效果相近就可以證明紅參多糖高劑量組對糖尿病小鼠的降血糖效果較好，說明對糖尿病小鼠降血糖可以起輔助的作用。

注：標有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，標有不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3.2 對小鼠糖耐量的影響

由圖2可知，在30～60 min各組小鼠血糖水平均迅速上升，陽性組和空白組在60 min時達到了峰值，60～90 min時，陰性組和紅參多糖高中低劑量組持續(xù)緩慢上升，在90 min時達到峰值，60～120 min時，空白組和陽性組呈下降趨勢，90～120 min時，紅參多糖高中低劑量組下降趨勢與陽性組呈下降趨勢相似。由此得出紅參多糖高劑量組對小鼠糖耐量的改善效果較好。

注：標有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，標有不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3.3 對小鼠TC、TG、GHb、α-GC的影響

紅參多糖對小鼠TC、TG、GHb和α-GC的影響見表3?？瞻捉M的TC、TG和GHb的含量最低，相反陰性組的最高。紅參多糖低劑量組、中劑量組和高劑量組因給藥的濃度依次上升，TC、TG和GHb的含量逐漸下降，紅參多糖高劑量組和陽性對照組的TC、TG和GHb值均無顯著性差異(P>0.05)，但是紅參多糖高劑量組與陰性對照組均具有顯著性差異(P<0.05)。

表3 紅參多糖對TC、TG、GHb及α-GC的影響

α-葡萄糖苷酶活性在空白組中最低，陰性組中最高，紅參多糖低劑量組、中劑量組和高劑量組隨著給藥的濃度上升，α-葡萄糖苷酶活性逐漸下降，其中，給藥組與陰性組均差異顯著(P<0.05)。因此，不同濃度紅參多糖在一定程度上能夠抑制α-葡萄糖苷酶活性，從而達到降低血糖值的作用。

2.4 紅參多糖對小鼠臟器系數(shù)的影響

紅參多糖對小鼠臟器系數(shù)的影響見表4。紅參多糖給藥各組心臟臟器系數(shù)和脾臟臟器系數(shù)與陽性組均無顯著性差異(P>0.05)。肝臟臟器和腎臟臟器系數(shù)均在造模后顯著增加(P<0.05)，由此得出，紅參多糖對小鼠的心臟和脾臟影響不大。此外，陰性組的腎臟和肝臟系數(shù)明顯最高，顯著高于其他組(P<0.05)，紅參多糖高劑量組能夠顯著降低腎臟系數(shù)和肝臟系數(shù)(P<0.05)，因此，紅參多糖可有效緩解糖尿病小鼠的肝腎腫大現(xiàn)象，不同濃度劑量中，紅參多糖高劑量組的效果最好。

表4 對各組小鼠臟器系數(shù)的影響

3 討論與結論

到目前為止，紅參多糖的提取方法有很多，研究紅參多糖提取方法的也有很多，比如常規(guī)法、超聲波提取法[24]、微波萃取法等[25]。有研究比較了水提法、酸提法、堿提法對紅參多糖的提取效果，結果表明酸堿對紅糖存在破壞作用，還是水提法效果比較顯著[26]。該試驗采用的是水提法，以浸提溫度100 ℃，浸提時間4 h，液料比15∶1(mL∶g)對紅參粉末進行試驗提取紅參多糖。于雷等[23]研究了紅參多糖降血糖血脂的作用，測定小鼠的血糖值和血脂4項，結果表明，紅參多糖各劑量組與對照組相比，具有降血糖降血脂作用。該實驗則更專注于對糖尿病小鼠的降血糖作用，通過測得空腹血糖值、TC、TG、GHb、α-葡萄糖苷酶活性、臟器系數(shù)以及觀察墊料和小鼠毛發(fā)情況可以得出，紅參多糖具有對糖尿病小鼠的降血糖作用；李瑞剛等[27]對紅參和人參皂苷協(xié)同降血糖作用進行了研究，結果表明，協(xié)同給藥時，人參皂苷Rb1降血糖和降血脂的作用會隨著紅參多糖劑量的增加而有所增強。該試驗將目標單獨放在了紅參多糖的降血糖活性并得出隨著紅參多糖劑量的增加，降血糖作用也顯著增強。

有研究驗證肝腎系數(shù)降低表示對肝腎有保護作用[28]，在該試驗中臟器系數(shù)結果表明，紅參多糖可有效緩解糖尿病小鼠的肝腎腫大現(xiàn)象，并對心臟和脾臟影響不大?？崭寡侵?、TC、TG、GHb和α-葡萄糖苷酶活性均為驗證降血糖作用的指標[29]，α-葡萄糖苷酶是食物中碳水化合物水解的關鍵酶，其活性降低有利于減少碳水化合物轉化為糖[30]。該試驗結果顯示上述指標均顯著下降，并且隨著紅參多糖濃度的增加降血糖效果更為顯著，證實了紅參多糖具有降血糖作用，該結果與前人研究一致。綜上所述，紅參多糖具有降血糖的作用，但其具體的作用機制還需進一步探究。