李學(xué)峰， 孫浩丁， 吳曉晗， 范明智， 廉美蘭， 樸炫春

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002)

貫葉連翹(HypericumperforatumL.)為藤黃科，金絲桃屬，多年生草本植物[1]。主要分布于我國(guó)甘肅、四川和江蘇等低海拔區(qū)域[2]。貫葉連翹味苦、澀、性平，地上部皆可入藥，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥用植物，貫葉連翹的有效成分有金絲桃素、偽金絲桃素和黃酮類化合物，金絲桃素和偽金絲桃素具有抗菌、止血、退熱和治療灼傷、外傷出血等作用，是很多人熟悉的民間藥草[3-4]。因貫葉連翹的廣泛應(yīng)用前景，近些年來它的需求量急劇增加，但其野生資源由于人為的過度采挖受到了破壞，并且人工栽培的貫葉連翹產(chǎn)量和質(zhì)量滿足不了市場(chǎng)要求，因此，不定根培養(yǎng)就成為獲取植物材料的另一途徑[5]。目前，已有許多貫葉連翹不定根培養(yǎng)方面的研究報(bào)道[6-8]，但是對(duì)不定根提取工藝及后續(xù)的生物活性等方面的研究相對(duì)較少，使不定根的應(yīng)用受到影響。

閃式提取技術(shù)是一種用于植物組織破碎的新型提取技術(shù)。它是靠高速機(jī)械剪切力和超動(dòng)分子滲濾技術(shù)，在數(shù)秒鐘內(nèi)把植物材料破碎至細(xì)微顆粒，并使有效成分迅速達(dá)到組織內(nèi)外平衡，通過過濾達(dá)到提取目的[9]。這種提取方法能最大限度保留植物有效成分，不會(huì)受熱破壞、溶劑用量少、提取時(shí)間短的影響，效率高，且刀具耐磨，結(jié)構(gòu)緊湊，使用安全可靠[10]。閃式提取技術(shù)的應(yīng)用可加速中藥現(xiàn)代化的進(jìn)程，目前已應(yīng)用于許多植物的提取,董科等[11]通過使用閃式提取高效地提取了植物多酚物質(zhì)；莫一凡等[12]對(duì)無花果總黃酮進(jìn)行閃式提取，對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化；王夢(mèng)茹等[13]發(fā)現(xiàn)閃式提取法可有效地對(duì)黃芪中有效物質(zhì)進(jìn)行提取。然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)閃式提取法應(yīng)用于貫葉連翹的提取中。

因此，該試驗(yàn)對(duì)貫葉連翹不定根總黃酮進(jìn)行了閃式提取，研究了提取溶劑、提取時(shí)間、提取溶劑濃度及液料比對(duì)黃酮得率的影響，在此基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)閃式提取工藝進(jìn)行了提取工藝優(yōu)化，為今后相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

參照于曉坤[14]的方法對(duì)貫葉連翹不定根進(jìn)行生物反應(yīng)器培養(yǎng)。不定根收獲在45 ℃下烘干，將干燥的不定根用作提取的試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 閃式提取方法

閃式提取儀(上海釩幟精密設(shè)備有限公司)的電壓調(diào)節(jié)為220 V，轉(zhuǎn)數(shù)調(diào)節(jié)為5 000 r/min后進(jìn)行提取。將提取的勻漿液過300目篩后，收集濾液，減壓濃縮至膏狀，烘干即得提取物。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1) 提取溶劑的篩選：取不定根干品10 g于閃式提取儀的提取容器，分別加入甲醇(80%)、乙醇(80%)和水3種溶劑，設(shè)置液料比為60∶1 (mL∶g)，提取時(shí)間為60 s進(jìn)行提取，以黃酮得率為指標(biāo)篩選提取溶劑。黃酮得率根據(jù)下式計(jì)算(下同)：

黃酮得率/%=黃酮含量/%×提取物提取率/%×100;

2) 提取時(shí)間篩選：取不定根干品10 g于閃式提取儀的提取容器，根據(jù)提取溶劑篩選試驗(yàn)結(jié)果，以80%的甲醇為提取溶劑，液料比為60∶1 (mL∶g)，將提取時(shí)間設(shè)置為30，40，50，60，70 s進(jìn)行提取，以黃酮得率為指標(biāo)篩選提取時(shí)間。

3) 溶劑濃度篩選：取不定根干品10 g于閃式提取儀的提取容器，根據(jù)提取時(shí)間篩選選定提取時(shí)間為60 s，液料比為60∶ 1 (mL∶g)，以甲醇為溶劑，將其濃度設(shè)置為20%，40%，60%，80%和100%后進(jìn)行提取，以黃酮得率為指標(biāo)篩選提取溶劑濃度。

4) 提取液料比篩選：取不定根干品10 g于閃式提取儀的提取容器，根據(jù)溶劑濃度篩選試驗(yàn)結(jié)果，以80%甲醇為溶劑，提取時(shí)間為60 s，將液料比分別設(shè)置為20，30，40，50和60 (mL∶g)后進(jìn)行提取，以黃酮得率為指標(biāo)篩選液料比。

1.2.3 閃式提取工藝的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間(A)，溶劑濃度(B)，液料比(C)3個(gè)因素為自變量，利用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行3因素3水平的組合(表1)以甲醇為溶劑，根據(jù)各組合的條件進(jìn)行閃式提取，根據(jù)提取物中黃酮得率(響應(yīng)值)，確定最佳條件。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

1.3 提取方法比較

以甲醇為提取溶劑，分別用閃式提取、超聲提取和熱水浸提法進(jìn)行提取，比較了用不同提取方法對(duì)黃酮得率的影響。3種提取法的具體條件為：

1) 閃式提取：溶劑濃度為77.5%，提取時(shí)間為65 s，液料比為52∶1(mL∶g)。

2) 超聲提?。喝軇舛葹?0%，提取時(shí)間為40 min，液料比為10∶1(mL∶g)；提取溫度為50 ℃，超聲頻率為40 kHz。

3) 熱水提取：溶劑濃度為50%，溫度為60 ℃，提取時(shí)間為60 min，液料比為10∶1(mL∶g)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用 SPSS 22.0中的方差分析程序分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行比較，顯著水平為0.05，每個(gè)處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑種類、提取時(shí)間、提取溶劑濃度及液料比對(duì)黃酮得率的影響

提取條件對(duì)黃酮得率的影響見表2。

表2 提取條件對(duì)黃酮得率的影響

由表2可知，當(dāng)提取溶劑為甲醇時(shí)，黃酮得率明顯高于乙醇和水溶劑，因此，選用甲醇作為提取溶劑。不同提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響很大，提取時(shí)間為30～60 s時(shí)，隨提取時(shí)間的增加黃酮得率呈上升趨勢(shì)，在60 s達(dá)到最高(9.15%)，但當(dāng)提取時(shí)間超過60 s時(shí)黃酮得率減少。提取溶劑(甲醇)濃度為20%～80%時(shí)，黃酮得率隨甲醇濃度的增加而增加，用80%甲醇溶劑提取時(shí)，黃酮得率最高(9.86%)，但甲醇濃度超過80% 時(shí)，黃酮得率反而降低。液料比對(duì)黃酮得率也有很大影響，液料比從20∶1 (mL∶g)增加到50∶1 (mL∶g)時(shí)，黃酮得率呈上升趨勢(shì)，在50∶1 (mL∶g)的液料比中黃酮得率最高(9.94%)，當(dāng)液料比繼續(xù)提高到60∶1 (mL∶g)時(shí)，黃酮得率反而降低。因此，選用提取時(shí)間為60 s，甲醇濃度為80%和料液比為50∶1 (mL∶g)的提取條件進(jìn)行進(jìn)一步的提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 提取工藝優(yōu)化研究

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用甲醇作為溶劑，對(duì)提取時(shí)間、提取溶劑濃度及料液比進(jìn)行了響應(yīng)面設(shè)計(jì)，結(jié)果表明，不同試驗(yàn)組提取物的黃酮得率有很大差異(表3)。對(duì)建立的響應(yīng)面設(shè)計(jì)模型，進(jìn)行多元擬合回歸分析，得到了二次回歸模型方程：

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與黃酮得率

Y=10.1+1.05A-0.7B+0.4C-0.05AB+0.4AC-0.15BC-1.05A2-3B2-1.5C2。

式中，Y為黃酮得率的預(yù)測(cè)值，A、B、C分別代表提取時(shí)間、提取溶劑濃度、液料比。

圖1 預(yù)測(cè)值分析結(jié)果

從表4還可見，A、B、C的P值均小于0.05，說明提取時(shí)間、溶劑濃度和液料比對(duì)黃酮得率均具有顯著的影響。3種因素的F 值從大到小的順序?yàn)椋篈>B>C，表明對(duì)黃酮得率影響最大的是提取時(shí)間，其次是溶劑濃度，液料比的影響最小。另外，每?jī)蓚€(gè)因素間(A×B、A×C、B×C)交互作用均無顯著性。

表4 方差分析結(jié)果

響應(yīng)面分析法中，用試驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制多元二次回歸方程，進(jìn)而預(yù)測(cè)最優(yōu)工藝參數(shù)[17-19]。該研究結(jié)果的回歸模型充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，因此，用此模型分析結(jié)果可用于提取工藝的優(yōu)化。從回歸模型給出的最佳提取工藝，即提取時(shí)間為 65.44 s，甲醇濃度為 77.46%，液料比 52.13∶ 1 (mL∶g)，得到預(yù)測(cè)的響應(yīng)值(黃酮得率)為 10.6%。為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確性，該研究通過3次獨(dú)立試驗(yàn)根據(jù)模型優(yōu)化工藝進(jìn)行了提取。3次重復(fù)試驗(yàn)的黃酮得率為10.41%、10.71%和10.59%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 0.36%，表明3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，且與預(yù)測(cè)值(10.6%)基本吻合。因此，該研究中響應(yīng)面分析所預(yù)測(cè)的最優(yōu)組合可用于實(shí)際提取工藝中。

2.3 閃式提取法與熱水浸提法和超聲波輔助提取法的比較

該研究將閃式提取法與超聲提取法和熱水回流法進(jìn)行了比較。閃式提取法黃酮得率(10.57%)高于熱水浸提法和超聲波輔助提取法2種常規(guī)提取法(表5)，同時(shí)，閃式提取法與熱水浸提法和超聲波輔助提取法相比，在提取時(shí)間、提取溶劑和提取工作量上都相對(duì)較低，可在日后植物有效物質(zhì)提取中進(jìn)行推廣與應(yīng)用。

表5 不同提取方法對(duì)黃酮得率的影響

3 討論與結(jié)論

目前，閃式提取法已應(yīng)用于許多植物的提取中，但依據(jù)植物種類、提取的目標(biāo)產(chǎn)物及提取部位，最佳提取條件有很大差異。如，張迪[20]用響應(yīng)面法優(yōu)化馬鞭草中總黃酮閃式提取工藝的結(jié)果是提取溶劑乙醇濃度為50%，液料比為 35：1 (mL∶g)，提取時(shí)間為 1.5 min，提取次數(shù)為 2 次，在此條件下，總黃酮含量達(dá)到8.2 mg/g；王茜等[21]用響應(yīng)面法和正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化黃蜀葵總黃酮閃提工藝的最佳條件為提取溶劑乙醇濃度為 75.01%，提取時(shí)間為93.56 s，提取次數(shù)為2次；邱相坡等[22]基于響應(yīng)面法對(duì)連翹果實(shí)總黃酮進(jìn)行閃式提取的優(yōu)化工藝為液料比27∶1 (mL∶g)、閃式提取時(shí)間80 s和閃式提取電壓109 V。此條件下總黃酮提取率達(dá)到了18.256%。

該試驗(yàn)對(duì)貫葉連翹不定根進(jìn)行總黃酮閃式提取的最佳條件為65.44 s，提取溶劑(甲醇)濃度77.46%，液料比52.13 (mL∶g)。該研究在優(yōu)化貫葉連翹不定根提取工藝時(shí)，黃酮得率達(dá)到10.57%，提取效果優(yōu)于傳統(tǒng)的超聲波輔助提取和熱水浸提法，是一種快速高效的提取方法。