王凡，卞曉春，劉陳瑋，徐仁超，吳春芳

（江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇如皋 226541）

植物需要一定的外界條件誘導(dǎo)，才能由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L(zhǎng)，外界條件有溫、光、水、氣等，其中溫度是一個(gè)重要環(huán)境因素。大多一年生或二年生的冬性植物，必須在種子萌發(fā)期或營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)初期經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的低溫處理才能開花，這種低溫處理一段時(shí)間從而促進(jìn)植物開花的現(xiàn)象，稱為春化作用[1]。

春化作用通常具有如下特征：①春化作用是緩慢的量變積累過(guò)程，在低溫下經(jīng)歷的時(shí)間越短，對(duì)開花的促進(jìn)作用越弱，而在低溫下經(jīng)歷的時(shí)間越長(zhǎng)，植物的開花時(shí)間越短，直至達(dá)到飽和狀態(tài)；②春化作用不會(huì)改變植物內(nèi)在的基因，不具有遺傳性，其產(chǎn)生的效應(yīng)只能通過(guò)有絲分裂的方式穩(wěn)定維持在當(dāng)代植株中，并不能通過(guò)有性繁殖傳遞給后代；③有分裂活性的細(xì)胞才能對(duì)春化作用做出反應(yīng)，所以春化作用的感受位點(diǎn)通常在植物的根尖和莖尖；④春化作用不能直接導(dǎo)致植物開花，其僅在很大程度上促進(jìn)了開花的進(jìn)程。

1 春化作用概述

植物春化主要有2 種類型：一種是種子春化型植物，即種子處在萌發(fā)狀態(tài)，就可以通過(guò)胚感受到低溫誘導(dǎo)，如小麥、大白菜、菠菜和蘿卜；另一種是綠體春化型植物，即幼苗生長(zhǎng)到一定階段，才能通過(guò)其莖尖分生組織感受外界低溫誘導(dǎo)，如洋蔥、大蒜、甘藍(lán)和芹菜[2]。不同物種因生長(zhǎng)環(huán)境不同和生長(zhǎng)狀態(tài)不同，所需的最適春化條件也有所不同。大多數(shù)植物所需的最適低溫為1～7℃，但某些溫帶植物要求10℃以上，某些谷類作物要求-6℃。同時(shí)完成春化所需的時(shí)間也從幾天到幾個(gè)月不等。

在微觀世界中，微型藻類也存在和高等植物相似的春化作用。植物通過(guò)開花結(jié)果的方式繁殖，而銅綠微囊藻通過(guò)細(xì)胞分裂一分為二的方式繁殖，低溫加速植物開花結(jié)果與低溫加速藻細(xì)胞分裂的本質(zhì)均是繁殖。因此，可以將低溫加速藻增長(zhǎng)的現(xiàn)象稱為藻春化作用，植物春化作用屬于狹義的春化作用，藻類春化作用屬于廣義的春化作用[3]。

溫度、光照、其他環(huán)境條件（水分、氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)）均與植物春化作用相關(guān)。溫度是直接影響春化作用的一個(gè)關(guān)鍵因子，花芽分化與低溫之間并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是積累關(guān)系，每個(gè)春化植物都能找到一個(gè)最適宜的低溫來(lái)促進(jìn)花芽分化。在滿足春化所需的低溫后，光照成為了最關(guān)鍵的影響因子，低溫春化和光周期兩者之間能夠相互替代和影響，如菠菜是不需要經(jīng)過(guò)低溫環(huán)境就能開花的長(zhǎng)日照植物，但經(jīng)過(guò)低溫處理后，其在短日照下也能開花。水分、氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是除了低溫和光照2 個(gè)因素外春化的必須條件。干燥的種子不能完成花芽分化，一般情況下，種子含水量要在40%以上才能春化。離體胚必須在有氧、水分和糖類的條件下才會(huì)進(jìn)行春化。外源物質(zhì)的處理對(duì)春化也有一定影響，已知的五大生長(zhǎng)類激素都與春化過(guò)程以及成花過(guò)程存在某些聯(lián)系[4]。

2 春化作用分子機(jī)制

生理研究表明，春化作用會(huì)引起植物體內(nèi)核酸代謝、可溶性蛋白含量、內(nèi)源激素代謝、碳氮代謝等生理方面的變化[5]，這使人們初步認(rèn)識(shí)了春化作用，但沒有從根本上揭示春化作用的分子機(jī)理。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，人們更加透徹地認(rèn)識(shí)了春化作用的分子機(jī)理，已經(jīng)分離鑒定了一系列春化相關(guān)基因，并對(duì)其如何調(diào)控植物的開花展開了大量研究。例如，春化作用能夠調(diào)控FLC 等關(guān)鍵基因的表達(dá)，并引起DNA 甲基化、組蛋白修飾等一系列變化來(lái)影響植物的成花轉(zhuǎn)變[6]。春化作用已在模式植物擬南芥和單子葉植物中得到廣泛研究（圖1）。

圖1 春化介導(dǎo)開花的分子機(jī)制

在擬南芥中，寒冷前（秋季）FLC 表達(dá)量較高，并抑制FT。在冬季，長(zhǎng)時(shí)間的冷暴露，導(dǎo)致FLC 水平降低。春季后期，長(zhǎng)日照誘導(dǎo)FT 表達(dá)，并促進(jìn)開花。在溫帶谷物中，VRN2 在寒冷前抑制FT。在冬季，冷暴露誘導(dǎo)VRN1 的表達(dá)，并抑制VRN2。春季VRN1 保持較高水平，并允許誘導(dǎo)VRN3 促進(jìn)開花。

2.1 擬南芥中春化作用的分子機(jī)制

在擬南芥中，2 個(gè)關(guān)鍵基因賦予了春化要求：FRI和FLC。FRI 編碼一種植物特異性的支架蛋白，且是FLC 激活轉(zhuǎn)錄所必須的。FRI 通過(guò)由SUF4、FRL1 和FES1 組成的大蛋白復(fù)合體調(diào)控FLC 的轉(zhuǎn)錄。該蛋白復(fù)合體進(jìn)一步募集轉(zhuǎn)錄激活因子和染色質(zhì)修飾蛋白用于FLC 的上調(diào)。FLC 編碼一個(gè)MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子，作為開花的抑制因子。高水平的FLC 抑制開花整合基因，如FT、FD 和SOC1 的表達(dá)，導(dǎo)致開花延遲。FLC 結(jié)合FT 的第一個(gè)內(nèi)含子及FD 和SOC1 的啟動(dòng)子，以發(fā)揮抑制因子的功能。

在擬南芥中，F(xiàn)LC 的抑制是有絲分裂穩(wěn)定的，許多基因參與了FLC 的穩(wěn)定抑制和組蛋白修飾，如AtVRN1、AtVRN2、VIN3 和VRN5。AtVRN1 編碼一個(gè)含DNA 結(jié)合域和PEST 區(qū)域的蛋白，其參與了FLC 的穩(wěn)定抑制，其通常會(huì)以低水平的方式存在，而給予持續(xù)低溫后表達(dá)量會(huì)驟然上升。AtVRN2 編碼一個(gè)鋅指核蛋白，類似果蠅中的SU（Z）12、植物中的FIS1 和EMF2。AtVRN2 是POLYCOMB GROUP 抑制復(fù)合物2（PRC2）的一部分，在恢復(fù)溫暖條件后，F(xiàn)LC 抑制在穩(wěn)定維持中起重要作用。VIN3 編碼一個(gè)染色質(zhì)重塑植物同源域指（PHD）蛋白，并被春化激活。VIN3 的激活通過(guò)募集PRC2 復(fù)合物催化FLC 染色質(zhì)的H3K27me3 修飾，導(dǎo)致FLC 被抑制。VRN5 也編碼PHD 蛋白，在春化過(guò)程中，VIN3 和VRN5 形成異源二聚體，維持FLC 穩(wěn)定沉默所需的組蛋白修飾。VRN1、VRN2 和VRN5 無(wú)論春化與否都會(huì)表達(dá)，而VIN3 只有在感受一段時(shí)間的低溫后表達(dá)，當(dāng)溫度轉(zhuǎn)暖，其表達(dá)會(huì)迅速下降。VIN3作為FLC 表觀遺傳沉默的熱傳感器元件，在更溫暖和更可變的溫度下，影響春化響應(yīng)方面具有關(guān)鍵和復(fù)雜的作用[7-8]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）在植物的整個(gè)生命過(guò)程中參與不同的生物學(xué)功能，具有顯著的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，2 種不同 類型的lncRNA，COOLAIR 和COLDAIR 在FLC 調(diào)控過(guò)程中具有表觀遺傳調(diào)控的作用[9]。COOLAIR 是天然存在的FLC 反向轉(zhuǎn)錄本，根據(jù)剪切方式的不同，又分為近端轉(zhuǎn)錄本和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)錄本，遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)錄本的外顯子區(qū)域，可以觸及到FLC 正向轉(zhuǎn)錄本的第一個(gè)外顯子和啟動(dòng)子區(qū)域，春化作用使其表達(dá)豐度迅速積累，與FLC 序列反向互補(bǔ)，以轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的方式干擾其表達(dá)[10]。COLDAIR 由FLC 第一個(gè)內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄出來(lái)，春化過(guò)程中與PRC2 的組分催化亞基CLF 相互作用，促進(jìn)PRC2 與FLC 結(jié)合，參與FLC 的抑制作用，溫度升高，COLDAIR 與CLF 的結(jié)合度降低，對(duì)FLC的抑制下降，促進(jìn)開花。此外，存在另一種形式lncRNA COLDWRAP，是從受抑制的FLC 啟動(dòng)子區(qū)域分離出來(lái)，春化使COLDWRAP 與COLDAIR 在FLC 位點(diǎn)形成一個(gè)基因內(nèi)部的抑制性染色質(zhì)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，對(duì)FLC 的穩(wěn)定抑制起重要作用[11]。

2.2 谷物中春化作用的分子機(jī)制

春化作用在單子葉谷物中也得到了廣泛研究。在谷物中，春化主要受2 個(gè)基因調(diào)控：VRN1 和VRN2，這2 個(gè)基因進(jìn)一步調(diào)控開花整合基因VRN3。VRN1 和VRN2 與擬南芥VRN 基因不同，表明春化途徑可能在溫帶谷物中獨(dú)立進(jìn)化。VRN1 起開花啟動(dòng)子的作用，且是調(diào)節(jié)春化反應(yīng)的核心。它編碼一個(gè)MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子，并與擬南芥花分生組織決定基因AP1 和FUL 相關(guān)。在小麥和大麥的冬季品種中，VRN1 的表達(dá)受冷處理誘導(dǎo)。然而，在春季品種中，即使沒有冷處理，VRN1仍會(huì)表達(dá)，這減少甚至消除了它們對(duì)春化的需求。與擬南芥中FLC 下調(diào)受到表觀遺傳調(diào)控相似，VRN1 上調(diào)也受到表觀遺傳調(diào)控。VRN1 的上調(diào)與H3K27me3（抑制染色質(zhì)標(biāo)記）的抑制和H3K4me3（活性染色質(zhì)標(biāo)記）的誘導(dǎo)相關(guān)。VRN1 啟動(dòng)子區(qū)域和第一內(nèi)含子在維持春化反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。VRN1 的啟動(dòng)子區(qū)域和第一個(gè)內(nèi)含子的缺失與春小麥品種相關(guān)。長(zhǎng)期冷處理后，VRN1 的持續(xù)上調(diào)導(dǎo)致開花抑制子VRN2 的低表達(dá)。然而，也有報(bào)道稱，VRN1 的表達(dá)不是寒冷期間開花或VRN2 下調(diào)所必須的，表明春化后可能有其他基因參與VRN2 的下調(diào)。VRN2 編碼一個(gè)鋅指CCT結(jié)構(gòu)域蛋白，且在擬南芥中未發(fā)現(xiàn)其同系物。CCT 結(jié)構(gòu)域?qū)τ谡{(diào)節(jié)春化要求非常重要，CCT 結(jié)構(gòu)域的突變會(huì)導(dǎo)致春化需求的消除。在小麥和大麥中，秋季長(zhǎng)日照誘導(dǎo)VRN2，進(jìn)一步抑制VRN3，抑制開花。VRN1 的表達(dá)受春化調(diào)控，不受光周期影響，相反，VRN2 的表達(dá)受光周期調(diào)控，表明光周期在谷物的春化誘導(dǎo)開花中也有重要作用。在小麥和大麥中，較高環(huán)境溫度下，VRN1的調(diào)控控制著小穗數(shù)、小花數(shù)和開花時(shí)間。最終，VRN2的下調(diào)釋放了VRN3。VRN3 是FT 的同系物，在春化后并響應(yīng)最佳光周期誘導(dǎo)開花。類似于擬南芥中的FT，VRN3 的開花啟動(dòng)子活性被長(zhǎng)日照激活。VRN3 通過(guò)正反饋回路刺激葉片中VRN1 的表達(dá)。VRN3 通過(guò)與另一種VRN1 啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子（FDL2）溝通來(lái)增加VRN1 的表達(dá)[8,12]。

另一個(gè)MADS-box 基因VRT2 可能也參與了谷物的成花轉(zhuǎn)變過(guò)程，其與VRN2 基因有相似的響應(yīng)春化模式。研究VRN1、VRN2 及VRT2 基因及其產(chǎn)物之間的作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)VRT2 是VRN1 的轉(zhuǎn)錄抑制因子，VRT2 與VRN1 基因啟動(dòng)子區(qū)域的CArG-box 區(qū)結(jié)合，從而抑制了VRN1 的表達(dá)活性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，VRN2 并不與VRN1 的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，也不直接影響其表達(dá)活性，但VRN2 能夠增強(qiáng)VRT2 的轉(zhuǎn)錄抑制作用，表明他們形成了一個(gè)調(diào)控復(fù)合體，該復(fù)合體影響了VRN1 的表達(dá)[13]。

VER2 基因，編碼一種類植物凝集素蛋白，也參與了谷物的成花轉(zhuǎn)變。在春化處理的小麥中，VER2 主要在莖尖以及周圍幼葉中表達(dá)，去春化處理能抑制VER2 基因的表達(dá)。分析VER2 蛋白的凝集素活性和糖結(jié)合特性，表明其能夠?qū)Ｒ恍缘亟Y(jié)合N-乙酰氨基葡萄糖和半乳糖，推測(cè)該蛋白參與了細(xì)胞內(nèi)O-Glc-NAc 信號(hào)的傳遞；春化過(guò)程中，VER2 主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，去春化處理后，VER2 定位于細(xì)胞質(zhì)；2-D 電泳結(jié)合western blot 表明，春化處理后，VER2 蛋白的等電點(diǎn)發(fā)生改變，并且磷酸化處理加快了這種改變，表明VER2 蛋白在春化過(guò)程中發(fā)生了磷酸化修飾[14]。

2.3 其它植物中春化作用的分子機(jī)制

隨著大白菜全基因組測(cè)序的完成及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，白菜春化作用的相關(guān)研究已從生理水平逐漸轉(zhuǎn)向分子水平。白菜類作物與擬南芥同屬十字花科植物，因此，研究者們可借助擬南芥的春化分子機(jī)制，研究白菜類作物的春化機(jī)制，為白菜類作物春化育種提供理論依據(jù)。目前，已在白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜中克隆出多個(gè)FLC 同源基因，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因等方法驗(yàn)證了白菜類作物中的BrFLCs 基因與擬南芥的AtFLC 基因作用相似[15]。除FLC外，白菜類作物中與春化相關(guān)的其它開花基因也有少量報(bào)道，如BrFRI、BrSOC1、BrVIN3、BrFT 等。盡管國(guó)內(nèi)外關(guān)于白菜類作物開花基因的研究已有一定進(jìn)展，但研究?jī)?nèi)容不夠深入，如果能更深入地研究其春化機(jī)理，克隆分析出更多的白菜開花基因，對(duì)于其育種研究將會(huì)產(chǎn)生巨大幫助。

在甜菜中，主要有3 種基因在春化反應(yīng)中起作用，BvBTC1、BvFT1 和BvFT2。BvFT2 是甜菜中的功能性FT 直向同源物，其過(guò)表達(dá)在沒有春化的情況下促進(jìn)開花，干擾表達(dá)不開花。但BvFT1 是一種開花抑制子，過(guò)表達(dá)BvFT1 導(dǎo)致BvFT2 表達(dá)的抑制和開花推遲，春化導(dǎo)致BvFT1 下調(diào)，即使在恢復(fù)溫暖條件后，春化誘導(dǎo)的BvFT1 抑制也能穩(wěn)定保持，表明BvFT1 的功能與擬南芥中FLC 的功能相似。甜菜中的春化主要通過(guò)BvBTC1 對(duì)BvFT1 和BvFT2 的調(diào)節(jié)來(lái)滿足，春化處理將BvBTC1 逐漸激活至足，以抑制BvFT1 并激活BvFT2 的水平[16]。

蠶豆是豆科的一員，是糧食、蔬菜、飼料和綠肥兼用作物。蠶豆分冬性、春性和中間型品種，其中冬性蠶豆需經(jīng)過(guò)春化作用才能誘導(dǎo)其開花結(jié)莢。蠶豆人工春化促早栽培，主要通過(guò)對(duì)蠶豆芽苗進(jìn)行人工春化技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)元旦采收鮮莢，顯著提高效益。對(duì)蠶豆春化分子機(jī)理的研究甚少，目前僅限于轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析。對(duì)蠶豆品種‘通鮮2 號(hào)’進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析春化和未春化蠶豆幼苗轉(zhuǎn)錄組的差異，結(jié)果表明春化處理的蠶豆光合作用和碳代謝受到強(qiáng)烈抑制，而響應(yīng)脅迫相關(guān)基因顯著上調(diào)表達(dá)。此外，還鑒定到22 個(gè)春化誘導(dǎo)的花粉-雌蕊相互作用基因和一些特異表達(dá)的蛋白激酶[17]。對(duì)‘通鮮2 號(hào)’進(jìn)行蛋白組測(cè)序，結(jié)果表明，在春化處理的蠶豆芽苗中有91 個(gè)來(lái)自不同功能類別的蛋白質(zhì)特異表達(dá)。春化處理后，光合作用和植酸代謝在內(nèi)的幾種生物學(xué)過(guò)程或代謝途徑相關(guān)蛋白表達(dá)量與對(duì)照相比有顯著差異。另外，還發(fā)現(xiàn)富含甘氨酸的RNA結(jié)合因子蛋白家族在春化幼苗中積累，表明在春化反應(yīng)中轉(zhuǎn)錄本豐度受到選擇性剪接的額外調(diào)控[18]。

草莓的花芽分化也受低溫誘導(dǎo)。在野生草莓中發(fā)現(xiàn)，在低溫下無(wú)論光周期如何都會(huì)開花。目前多從生理和栽培角度闡述外界因素如何影響草莓花芽分化，但對(duì)其成花的分子調(diào)控機(jī)理了解甚少。前期研究主要集中在利用QTL 作圖來(lái)進(jìn)行成花性狀相關(guān)基因的定位[19]。后來(lái)，基于森林草莓EST 序列，并結(jié)合生物信息學(xué)分析，對(duì)參與二倍體草莓成花調(diào)控的基因進(jìn)行了較深入的研究，結(jié)果表明，在二倍體草莓中，可找到許多與擬南芥成花途徑中基因?qū)?yīng)的同源基因，擬南芥成花分子機(jī)理的研究，可為草莓中相關(guān)的研究提供借鑒，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，二倍體草莓中存在著不同于擬南芥的調(diào)節(jié)機(jī)制[20]。近些年來(lái)，與成花有關(guān)的同源基因AP1、LFY、TFL1、FT、CO 等從栽培草莓中被克隆分離出來(lái)，并通過(guò)定量PCR 驗(yàn)證了這些基因在不同組織、不同花器官及不同花發(fā)育階段的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)它們都很可能參與了草莓的成花調(diào)控[21]。

3 結(jié)語(yǔ)

植物的春化作用對(duì)發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義，迄今為止，春化技術(shù)已應(yīng)用在各種蔬菜、花卉上，并取得一定進(jìn)展，如烏塌菜、蠶豆、百合等。但春化作用分子機(jī)制的研究主要集中在擬南芥和小麥上，對(duì)于其他植物的研究甚少，且種子春化型和綠體春化型植物的春化作用機(jī)制是否一致，有待進(jìn)一步研究。植物春化特性是由多基因控制，基因之間存在復(fù)雜的作用關(guān)系，要多角度、多層次認(rèn)識(shí)春化機(jī)理的本質(zhì)，將生理、生化、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物信息學(xué)等學(xué)科有機(jī)結(jié)合，以取得新的突破。