王宇琛,田廣原,周雅坪,郭 婷,趙紅梅,孫雅婕,趙逢淼,卞宇晨,于佳梁,郝永清

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，獸醫(yī)微生物學與免疫學實驗室，呼和浩特 010018)

牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3)在世界范圍內(nèi)分布，是引起犢牛和成年牛呼吸道疾病綜合征(BRDC)的主要病原之一[1]。發(fā)病牛精神萎縮，食欲不振，伴隨著嚴重的呼吸道癥狀。一些發(fā)病的牛體溫升高，甚至呼吸困難[2]。感染BPIV3的牛肺臟組織會出現(xiàn)漸進式的損傷，并引起免疫抑制，在不合理的飼養(yǎng)或長途運輸刺激的情況下會導致細菌或支原體的繼發(fā)感染，大大增加牛的死亡率[3]。目前疫苗接種是預防和控制該疾病的重要措施。BPIV3疫苗在中國尚未使用[4]，因此迫切需要開展相關(guān)疫苗研究，以有效預防和控制BPIV3感染。

BPIV3是副黏病毒亞科(Paramyxovirinae)呼吸道病毒屬(Respirovirus)的單分子負鏈RNA病毒，具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶活性，其基因組至少編碼6種蛋白，包括NP、P、M、F、HN和L蛋白[5-6]。其中NP蛋白為核衣殼蛋白，約含515個氨基酸，單體呈螺旋狀結(jié)構(gòu)，大量的NP蛋白構(gòu)成中空管道狀結(jié)構(gòu)，即病毒的核衣殼[7]。病毒被NP蛋白包裹，避免了核酸酶對病毒RNA的降解。NP蛋白含有2個結(jié)構(gòu)域：與RNA結(jié)合的N-端結(jié)構(gòu)域，高度保守；C-端結(jié)構(gòu)域，裸露于核衣殼表面，含有對蛋白酶敏感的磷酸化位點和抗原結(jié)合位點。因此,NP蛋白具有較好的免疫原性，可刺激機體產(chǎn)生相應的免疫應答[8]。

本試驗設計針對NP基因的特異性引物，原核表達BPIV3 NP蛋白并將其與BPIV3滅活疫苗共同免疫新西蘭白兔，以此驗證NP蛋白是否對BPIV3滅活疫苗具有免疫增強作用，以期為研制新型的BPIV3疫苗產(chǎn)品提供依據(jù)，為BPIV3滅活疫苗的免疫方法優(yōu)化提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

BPIV3(病毒滴度為3.162×107TCID50/mL)、pET-32a(+)質(zhì)粒、牛腎細胞MDBK(CSTR:19375.09.3101BOVGNO7)均保存于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院微生物學與免疫學實驗室。2～3月齡2.5 kg健康雄性新西蘭白兔購自呼和浩特周邊養(yǎng)殖場。

AxyPrep總RNA小量制備試劑盒、AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒、AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒(康寧生命科學有限公司)；Ni-IDA蛋白純化試劑盒及BCA法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(增強型)、脫脂乳(生工生物工程(上海)股份有限公司)；EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；T4 DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶(TaKaRa公司)；山羊源BPIV3標準陽性血清(VMRD公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗山羊IgG、HRP標記的山羊抗兔IgG(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 NP蛋白生物信息學分析及引物設計與合成

根據(jù)GenBank公布的BPIV3NP基因組序列(登錄號：KU198929.1),利用DNAStar對BPIV3NP基因的抗原性、親水性及表面可及性進行分析，篩選主要抗原域。根據(jù)生物信息學分析結(jié)果，選擇NP基因優(yōu)勢片段，通過Primer Premier 5.0軟件設計1段針對NP基因抗原優(yōu)勢片段的特異性引物，同時加入EcoRⅠ、XholⅠ酶切位點(下劃線處)及保護性堿基，引物序列為：F：5′-CGGAATTCCGG-TTAGAGGCATTTAGACAAGACG-3′；R：5′-CC-CTCGAGGGTCACGTGCCACTGCTTGACCTAG-TT-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 NP基因擴增及表達載體的構(gòu)建

利用總RNA小量制備試劑盒及EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix提取BPIV3基因組總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴增NP基因。PCR反應體系50 μL：5×Prime STAR Buffer (Mg2+Plus)10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,dNTP Mixture (2.5 mmol/L)4 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μL)0.5 μL，cDNA模板1 μL,ddH2O 32.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共32個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的片段用DNA凝膠回收試劑盒回收后獲得NP基因并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XholⅠ對測序結(jié)果正確的NP基因及pET-32a(+)表達質(zhì)粒進行雙酶切，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳回收后通過T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，然后涂布于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)后通過菌落PCR篩選陽性菌落，擴大培養(yǎng)陽性菌落后提取質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定，對酶切正確的質(zhì)粒進行測序，最后獲得重組質(zhì)粒并命名為pET-32a-NP。

1.4 重組蛋白的誘導表達及可溶性分析

將陽性菌液1∶100接種于含氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至D450 nm值為0.6～0.8時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37 ℃、180 r/min誘導表達4 h；將誘導表達后的菌液8 000 r/min離心10 min，棄上清，用PBS重懸，反復3次。超聲波破碎后，12 000 r/min離心10 min并分離上清和沉淀，將其與pET-32a(+)空質(zhì)粒進行SDS-PAGE，觀察重組蛋白質(zhì)的表達情況并分析其可溶性。

1.5 重組蛋白包涵體溶解

將誘導表達菌液4 ℃、8 000 r/min離心10 min后將菌體沉淀按10∶1的比例用含8 mol/L尿素的Tris-HCl緩沖液重懸，冰上超聲破碎至清亮(250 W，超聲4 s，間歇5 s，功率35%)后4 ℃、12 000×g離心15 min，收集上清，將沉淀用含8 moL/L尿素的Tris-HCl緩沖液重懸，繼續(xù)超聲5 min，4 ℃、12 000×g離心20 min，取上清，獲得裂解的包涵體。

1.6 重組蛋白的純化

將已裂解的重組蛋白包涵體用0.45 μL濾器過濾，按照Ni-IDA蛋白純化試劑盒說明書純化蛋白，用Bingding Buffer平衡Ni層析柱，將過濾后的蛋白加入層析柱，冰上結(jié)合 1 h，用Washing Buffer和Elution Buffer洗層析柱，分別收集洗脫后的液體，進行SDS-PAGE鑒定。

1.7 重組蛋白包涵體的復性

將透析袋在大體積的2% NaHCO3和1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中煮沸10 min，用蒸餾水清洗干凈，然后再將透析袋在1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中煮沸10 min，徹底清洗透析袋。采用梯度透析法將重組蛋白復性。

1.8 重組蛋白Western blotting檢測

純化后的重組蛋白包涵體經(jīng)SDS-PAGE分析后,14 V 30 min轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂乳37 ℃封閉4 h；用TBST緩沖液洗滌5次，每次10 min；加入山羊源BPIV3陽性血清(1∶2 000)作為一抗，4 ℃過夜孵育；用TBST緩沖液洗滌5次，每次10 min；用HRP標記的鼠抗山羊IgG(1∶6 000)作為二抗，在室溫搖床孵育2 h；用TBST緩沖液洗滌5次，每次10 min；用ECL顯色。

1.9 重組蛋白對BPIV3滅活疫苗免疫原性的影響

用BCA法蛋白濃度測定試劑盒測定濃縮后的蛋白。用0.3%甲醛滅活病毒滴度為3.162×107TCID50/mL的BPIV3，制備滅活疫苗。將8只新西蘭白兔分成4組，每組2只，分別為滅活疫苗組、NP蛋白組、滅活疫苗和NP蛋白混合組和弗氏佐劑對照組。各免疫組免疫劑量如表1所示，注射體積均為1 mL,對照組為500 μL PBS與500 μL佐劑混合注射。首免采用弗氏完全佐劑1∶1混合，14 d后進行二免，并更換為弗氏不完全佐劑，免疫途徑為肌內(nèi)注射，免疫前稱量體重保證試驗穩(wěn)定性，從首免前采血后每隔7 d采集血液分離血清。

表1 免疫分組及免疫劑量

1.10 間接ELISA方法測特異性抗體滴度

將BPIV3 NP蛋白稀釋到4 μg/mL后包被于96孔酶標板上，每孔100 μL，4 ℃過夜包被，棄液，洗滌5次，每次2 min；將1% BSA溶液作為封閉液加入到96孔板中，每孔100 μL，37 ℃放置2 h，洗滌，烘干；將制備好的免疫前血清和免疫后7、14、21和28 d的血清從1∶2開始倍比稀釋到1∶224,同時設立稀釋度為1∶100的陽性和陰性對照，每孔100 μL，37 ℃反應1 h，洗滌；加100 μL 1∶5 000稀釋的酶標二抗，于37 ℃反應1 h，洗滌；每孔加入100 μL 20% TMB顯色液，避光反應10 min后加入50 μL終止液，用酶標儀測定D450 nm值。

1.11 血清中和試驗測中和抗體滴度

將采集的血液樣品于4 ℃靜置過夜，3 000×g離心5 min，吸取上清即為待檢血清。將血清2倍倍比稀釋到2-8，放置于56 ℃水浴鍋滅活30 min。將病毒稀釋到100 TCID50/200 μL，病毒稀釋液與血清稀釋液按1∶1等量混合均勻，37 ℃培養(yǎng)1 h，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每個稀釋度的血清樣品接4孔，每孔200 μL，設立只接毒的陽性對照和陰性對照。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，逐日觀察細胞病變。

2 結(jié) 果

2.1 NP基因主要抗原域

用DNAStar軟件中的Protean篩選出基因編碼靠近C-端的193-368位氨基酸序列為主要抗原域，含有抗原結(jié)合位點，平均抗原指數(shù)在0.4～1.7之間，親水指數(shù)為0～1.5，親水性和表面可及性較高(圖1)。

圖1 BPIV3 NP 基因主要抗原域分析Fig.1 Analysis of major antigenic domains of BPIV3 NP gene

2.2 NP基因擴增

提取BPIV3基因組總RNA，對NP基因抗原區(qū)片段進行RT-PCR擴增，獲得大小為525 bp的目的片段(圖2)，與試驗預期相符。

M，Trans2K DNA Marker；1～4，NP基因；5，陰性對照M，Trans2K DNA Marker；1-4，NP gene；5，Negative control圖2 BPIV3 NP基因RT-PCR擴增結(jié)果Fig.2 Results of RT-PCR amplification of BPIV3 NP gene

2.3 NP基因重組表達載體的構(gòu)建及鑒定

將鑒定為陽性的pET-32a-NP重組質(zhì)粒進行雙酶切，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小約為5 900和525 bp的2條片段(圖3)，符合預測結(jié)果，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M1，Trans2K DNA Marker;1，pET-32a-NP;M2，DL5000 DNA Marker圖3 重組質(zhì)粒pET-32a-NP雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pET-32a-NP by double digestion

2.4 重組質(zhì)粒的誘導表達及可溶性分析

SDS-PAGE結(jié)果顯示，與pET-32a(+)空質(zhì)粒對照相比，重組質(zhì)粒誘導表達沉淀在約50 ku處出現(xiàn)條帶(圖4)，大小與預期相符，說明該蛋白以包涵體形式表達。

M，Blue Plus Protein Marker;1，誘導前pET-32a(+)空質(zhì)粒；2，誘導后pET-32a(+)空質(zhì)粒；3，誘導前重組質(zhì)粒上清；4，誘導前重組質(zhì)粒沉淀；5，重組質(zhì)粒誘導表達上清；6，重組質(zhì)粒誘導表達沉淀M，Blue Plus Protein Marker;1，pET-32a(+)empty plasmid before induction;2，Induced expression of pET-32a(+)empty plasmid;3，Recombinant plasmid supernatant before induction;4，Recombinant plasmid precipitation before induction；5，Induced expression supernatant of recombinant plasmid;6，Induced expression precipitation of recombinant plasmid圖4 重組蛋白表達鑒定結(jié)果Fig.4 Expression and identification results of recombinant protein

2.5 重組蛋白的純化

SDS-PAGE結(jié)果顯示，蛋白在經(jīng)過4次50 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫后在第1次Elution Buffer洗脫時的目的蛋白量最大且純度較高，蛋白分子質(zhì)量大小約為50 ku(圖5)，證明重組蛋白純化成功。

M,Blue Plus Protein Marker;1,流穿液；2～5,Washing Buffer第1～4次洗脫；6～9,Elution Buffer第1～4次洗脫M,Blue Plus Protein Marker;1,Flow through liquid;2-5,The 1st to the 4th elution of Washing Buffer,respectively;6-9,The 1st to the 4th elution of Elution Buffer,respectively圖5 重組蛋白純化SDS-PAGE 分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant protein purification

2.6 重組蛋白Western blotting鑒定

用純化后的重組蛋白進行Western blotting鑒定，在約50 ku處出現(xiàn)特異性條帶(圖6)，證明重組蛋白與山羊源BPIV3陽性血清發(fā)生反應，具有反應原性。

圖6 Western blotting檢測重組蛋白反應原性Fig.6 Detection of reactogenicity of recombinant protein by Western blotting

2.7 重組蛋白的蛋白定量

用BCA法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(增強型)測得純化濃縮后的蛋白濃度為400 μg/mL。

2.8 間接ELISA方法測抗體滴度

由圖7可知，新西蘭白兔血清抗體效價在首免后7 d達到第一次高峰，免疫組抗體效價在1∶27到1∶29之間，在二免前，NP蛋白組的抗體效價最高，達到1∶212；從二免開始，抗體效價持續(xù)升高，在首免后28 d時，滅活疫苗和NP蛋白混合組抗體效價超過NP蛋白組(1∶217)，達到1∶218,滅活疫苗組抗體效價為1∶211,對照組均無變化。

圖7 新西蘭白兔血清抗體滴度變化Fig.7 Changes of serum antibody titer of New Zealand White rabbits

2.9 血清中和試驗測中和抗體滴度

由圖8可知，免疫組的中和抗體效價持續(xù)增高，對照組無變化，在首免后28 d時，滅活疫苗組、滅活疫苗和NP蛋白混合組及NP蛋白組的中和抗體效價分別為1∶23.32、1∶24.98和1∶24.48，混合疫苗組的中和抗體效價高于其他免疫組。

圖8 新西蘭白兔血清中和抗體滴度變化Fig.8 Changes of serum neutralizing antibody titer in New Zealand White rabbits

3 討 論

自1959年Reisinger等[9]從美國犢牛腎臟首次分離到BPIV3后，英國、法國、加拿大、澳大利亞也都相繼有BPIV3感染的報道[10]，目前BPIV3已呈世界性分布。研究表明，BPIV3已在中國內(nèi)蒙古、山西、山東、黑龍江等地存在[11]，說明BPIV3在國內(nèi)的流行非常普遍并且很嚴重[12]。但目前國內(nèi)對BPIV3的研究還相對較少，因此亟需開展相關(guān)研究以便對BPIV3感染實施有效防控。BPIV3在第一次被發(fā)現(xiàn)后就有相關(guān)學者開始研究相關(guān)疫苗[13]，20世紀60～70年代研制出了滅活疫苗，免疫后牛表現(xiàn)出全身性的或局部性的體液免疫[13-15]，在20世紀60年代也研制出了弱毒疫苗，但有毒力返強等安全性問題，之后通過改進，弱毒疫苗的安全性大大提高[16-17]，在國外針對BPIV3的滅活疫苗和弱毒苗已逐漸商品化[18]。也有人利用復制缺陷型的痘病毒作為表達載體來表達BPIV3的糖蛋白，肌內(nèi)注射或滴鼻都可誘導產(chǎn)生中和抗體[19]。

NP蛋白是BPIV3中含量最高的蛋白，同時是BPIV3的主要抗原成分，具有很好的反應原性和免疫原性，與F和HN蛋白相比，NP蛋白高度保守同時與抗原的生成和蛋白酶磷酸化等具有重要的關(guān)系[8]，因此,本試驗選擇NP蛋白作為BPIV3滅活疫苗的輔助蛋白，同時NP蛋白的成功表達也為以NP蛋白為抗原建立間接ELISA方法檢測未知抗體打下堅實的基礎。

本研究采用大腸桿菌表達系統(tǒng)，其具有操作簡單、成本低、周期短、表達量高等優(yōu)點，是獲得外源表達蛋白的首選方案[20]。但研究發(fā)現(xiàn)當外源基因在大腸桿菌中高效表達時，有時會導致二硫鍵不能正確進行配對，過多蛋白間的非特異結(jié)合從而導致形成不可溶的包涵體[21]。為獲得有活性的目的蛋白，則需使用變性劑對包涵體進行變性溶解再進行復性操作，最后經(jīng)透析去除變性劑[22]，得到目的蛋白。本試驗中NP蛋白呈包涵體形式表達，可能是在設計引物時，部分序列的親水性不高，導致整個蛋白呈包涵體形式表達，同時NP蛋白純化過程也是試驗的一個難點，不同濃度咪唑的洗脫液對NP蛋白的洗脫效率都不高，50 mmol/L咪唑的洗脫液雖能有效將雜蛋白洗脫，但NP蛋白也損失嚴重，因此，NP蛋白的可溶性表達及純化的條件還需進一步研究。

正黏病毒科與副黏病毒科的區(qū)分是以其核酸是否分節(jié)為標準，查閱相關(guān)資料后發(fā)現(xiàn)有人通過表達屬于正黏病毒科的流感病毒的NP蛋白，將其免疫小鼠后，并沒有降低受感染小鼠的病毒初始復制率，也沒有檢測到中和抗體，但其啟動了對A型流感病毒的交叉反應性細胞毒性T細胞反應(CTL)，NP蛋白對機體的保護作用可能由交叉反應性CTL介導[23]；也有免疫研究表明，同為副黏病毒科呼吸道病毒屬的仙臺病毒，其NP蛋白刺激機體產(chǎn)生的IgG抗體遠高于HN和F蛋白，可誘導保護性免疫，特別是在攻毒感染后期[24]。因本次試驗并未做攻毒試驗，因此暫不能確定單獨免疫NP蛋白是否可有效保護機體免受病毒侵襲，以及NP蛋白進入機體后具體介導體液免疫反應，還是通過激活宿主體內(nèi)T細胞產(chǎn)生細胞免疫而保護機體。

為驗證免疫組之間抗體水平差異是否為NP蛋白輔助BPIV3滅活疫苗產(chǎn)生，本試驗通過BPIV3的不同疫苗對新西蘭白兔進行免疫，運用間接ELISA和血清中和試驗來測定血清中的抗體，試驗結(jié)果表明新西蘭白兔在免疫28 d后各免疫組都能產(chǎn)生特異性抗體和中和抗體。滅活疫苗組、NP蛋白組及滅活疫苗和NP蛋白混合組的特異性抗體效價分別達到1∶211、1∶217和1∶218，中和抗體滴度分別達到1∶23.32、1∶24.48和1∶24.98。滅活疫苗和NP蛋白混合組的特異性結(jié)合抗體和中和抗體效價雖然在二免前不如NP蛋白組，但二免14 d后抗體效價在3組中都是最高的。綜上表明，少量NP蛋白的加入便可增強BPIV3滅活疫苗的免疫水平，相關(guān)文獻如E2蛋白也可增強牛病毒性腹瀉(BVDV)滅活疫苗的免疫效果[25]。因此,在滅活疫苗中加入保護性抗原很可能是提高滅活疫苗免疫效果的一種新方式，為BPIV3及伴隨的BRDC的防控提供新的方法策略。

4 結(jié) 論

本試驗成功表達了純度較高的BPIV3 NP蛋白，將其與BPIV3滅活疫苗共同免疫新西蘭白兔，結(jié)果證明NP蛋白的加入可大幅提高BPIV3滅活疫苗的免疫水平。