王宇琛,田廣原,周雅坪,郭 婷,趙紅梅,孫雅婕,趙逢淼,卞宇晨,于佳梁,郝永清

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，獸醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3)在世界范圍內(nèi)分布，是引起犢牛和成年牛呼吸道疾病綜合征(BRDC)的主要病原之一[1]。發(fā)病牛精神萎縮，食欲不振，伴隨著嚴(yán)重的呼吸道癥狀。一些發(fā)病的牛體溫升高，甚至呼吸困難[2]。感染BPIV3的牛肺臟組織會出現(xiàn)漸進(jìn)式的損傷，并引起免疫抑制，在不合理的飼養(yǎng)或長途運(yùn)輸刺激的情況下會導(dǎo)致細(xì)菌或支原體的繼發(fā)感染，大大增加牛的死亡率[3]。目前疫苗接種是預(yù)防和控制該疾病的重要措施。BPIV3疫苗在中國尚未使用[4]，因此迫切需要開展相關(guān)疫苗研究，以有效預(yù)防和控制BPIV3感染。

BPIV3是副黏病毒亞科(Paramyxovirinae)呼吸道病毒屬(Respirovirus)的單分子負(fù)鏈RNA病毒，具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶活性，其基因組至少編碼6種蛋白，包括NP、P、M、F、HN和L蛋白[5-6]。其中NP蛋白為核衣殼蛋白，約含515個(gè)氨基酸，單體呈螺旋狀結(jié)構(gòu)，大量的NP蛋白構(gòu)成中空管道狀結(jié)構(gòu)，即病毒的核衣殼[7]。病毒被NP蛋白包裹，避免了核酸酶對病毒RNA的降解。NP蛋白含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域：與RNA結(jié)合的N-端結(jié)構(gòu)域，高度保守；C-端結(jié)構(gòu)域，裸露于核衣殼表面，含有對蛋白酶敏感的磷酸化位點(diǎn)和抗原結(jié)合位點(diǎn)。因此,NP蛋白具有較好的免疫原性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答[8]。

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)針對NP基因的特異性引物，原核表達(dá)BPIV3 NP蛋白并將其與BPIV3滅活疫苗共同免疫新西蘭白兔，以此驗(yàn)證NP蛋白是否對BPIV3滅活疫苗具有免疫增強(qiáng)作用，以期為研制新型的BPIV3疫苗產(chǎn)品提供依據(jù)，為BPIV3滅活疫苗的免疫方法優(yōu)化提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

BPIV3(病毒滴度為3.162×107TCID50/mL)、pET-32a(+)質(zhì)粒、牛腎細(xì)胞MDBK(CSTR:19375.09.3101BOVGNO7)均保存于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室。2～3月齡2.5 kg健康雄性新西蘭白兔購自呼和浩特周邊養(yǎng)殖場。

AxyPrep總RNA小量制備試劑盒、AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒、AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒(康寧生命科學(xué)有限公司)；Ni-IDA蛋白純化試劑盒及BCA法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)、脫脂乳(生工生物工程(上海)股份有限公司)；EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；T4 DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶(TaKaRa公司)；山羊源BPIV3標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(VMRD公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗山羊IgG、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 NP蛋白生物信息學(xué)分析及引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank公布的BPIV3NP基因組序列(登錄號：KU198929.1),利用DNAStar對BPIV3NP基因的抗原性、親水性及表面可及性進(jìn)行分析，篩選主要抗原域。根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，選擇NP基因優(yōu)勢片段，通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1段針對NP基因抗原優(yōu)勢片段的特異性引物，同時(shí)加入EcoRⅠ、XholⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線處)及保護(hù)性堿基，引物序列為：F：5′-CGGAATTCCGG-TTAGAGGCATTTAGACAAGACG-3′；R：5′-CC-CTCGAGGGTCACGTGCCACTGCTTGACCTAG-TT-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 NP基因擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建

利用總RNA小量制備試劑盒及EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix提取BPIV3基因組總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增NP基因。PCR反應(yīng)體系50 μL：5×Prime STAR Buffer (Mg2+Plus)10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,dNTP Mixture (2.5 mmol/L)4 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μL)0.5 μL，cDNA模板1 μL,ddH2O 32.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的片段用DNA凝膠回收試劑盒回收后獲得NP基因并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XholⅠ對測序結(jié)果正確的NP基因及pET-32a(+)表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳回收后通過T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布于氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)后通過菌落PCR篩選陽性菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)陽性菌落后提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，對酶切正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序，最后獲得重組質(zhì)粒并命名為pET-32a-NP。

1.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

將陽性菌液1∶100接種于含氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至D450 nm值為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37 ℃、180 r/min誘導(dǎo)表達(dá)4 h；將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液8 000 r/min離心10 min，棄上清，用PBS重懸，反復(fù)3次。超聲波破碎后，12 000 r/min離心10 min并分離上清和沉淀，將其與pET-32a(+)空質(zhì)粒進(jìn)行SDS-PAGE，觀察重組蛋白質(zhì)的表達(dá)情況并分析其可溶性。

1.5 重組蛋白包涵體溶解

將誘導(dǎo)表達(dá)菌液4 ℃、8 000 r/min離心10 min后將菌體沉淀按10∶1的比例用含8 mol/L尿素的Tris-HCl緩沖液重懸，冰上超聲破碎至清亮(250 W，超聲4 s，間歇5 s，功率35%)后4 ℃、12 000×g離心15 min，收集上清，將沉淀用含8 moL/L尿素的Tris-HCl緩沖液重懸，繼續(xù)超聲5 min，4 ℃、12 000×g離心20 min，取上清，獲得裂解的包涵體。

1.6 重組蛋白的純化

將已裂解的重組蛋白包涵體用0.45 μL濾器過濾，按照Ni-IDA蛋白純化試劑盒說明書純化蛋白，用Bingding Buffer平衡Ni層析柱，將過濾后的蛋白加入層析柱，冰上結(jié)合 1 h，用Washing Buffer和Elution Buffer洗層析柱，分別收集洗脫后的液體，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.7 重組蛋白包涵體的復(fù)性

將透析袋在大體積的2% NaHCO3和1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中煮沸10 min，用蒸餾水清洗干凈，然后再將透析袋在1 mmol/L EDTA(pH 8.0)中煮沸10 min，徹底清洗透析袋。采用梯度透析法將重組蛋白復(fù)性。

1.8 重組蛋白Western blotting檢測

純化后的重組蛋白包涵體經(jīng)SDS-PAGE分析后,14 V 30 min轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂乳37 ℃封閉4 h；用TBST緩沖液洗滌5次，每次10 min；加入山羊源BPIV3陽性血清(1∶2 000)作為一抗，4 ℃過夜孵育；用TBST緩沖液洗滌5次，每次10 min；用HRP標(biāo)記的鼠抗山羊IgG(1∶6 000)作為二抗，在室溫?fù)u床孵育2 h；用TBST緩沖液洗滌5次，每次10 min；用ECL顯色。

1.9 重組蛋白對BPIV3滅活疫苗免疫原性的影響

用BCA法蛋白濃度測定試劑盒測定濃縮后的蛋白。用0.3%甲醛滅活病毒滴度為3.162×107TCID50/mL的BPIV3，制備滅活疫苗。將8只新西蘭白兔分成4組，每組2只，分別為滅活疫苗組、NP蛋白組、滅活疫苗和NP蛋白混合組和弗氏佐劑對照組。各免疫組免疫劑量如表1所示，注射體積均為1 mL,對照組為500 μL PBS與500 μL佐劑混合注射。首免采用弗氏完全佐劑1∶1混合，14 d后進(jìn)行二免，并更換為弗氏不完全佐劑，免疫途徑為肌內(nèi)注射，免疫前稱量體重保證試驗(yàn)穩(wěn)定性，從首免前采血后每隔7 d采集血液分離血清。

表1 免疫分組及免疫劑量

1.10 間接ELISA方法測特異性抗體滴度

將BPIV3 NP蛋白稀釋到4 μg/mL后包被于96孔酶標(biāo)板上，每孔100 μL，4 ℃過夜包被，棄液，洗滌5次，每次2 min；將1% BSA溶液作為封閉液加入到96孔板中，每孔100 μL，37 ℃放置2 h，洗滌，烘干；將制備好的免疫前血清和免疫后7、14、21和28 d的血清從1∶2開始倍比稀釋到1∶224,同時(shí)設(shè)立稀釋度為1∶100的陽性和陰性對照，每孔100 μL，37 ℃反應(yīng)1 h，洗滌；加100 μL 1∶5 000稀釋的酶標(biāo)二抗，于37 ℃反應(yīng)1 h，洗滌；每孔加入100 μL 20% TMB顯色液，避光反應(yīng)10 min后加入50 μL終止液，用酶標(biāo)儀測定D450 nm值。

1.11 血清中和試驗(yàn)測中和抗體滴度

將采集的血液樣品于4 ℃靜置過夜，3 000×g離心5 min，吸取上清即為待檢血清。將血清2倍倍比稀釋到2-8，放置于56 ℃水浴鍋滅活30 min。將病毒稀釋到100 TCID50/200 μL，病毒稀釋液與血清稀釋液按1∶1等量混合均勻，37 ℃培養(yǎng)1 h，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度的血清樣品接4孔，每孔200 μL，設(shè)立只接毒的陽性對照和陰性對照。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，逐日觀察細(xì)胞病變。

2 結(jié) 果

2.1 NP基因主要抗原域

用DNAStar軟件中的Protean篩選出基因編碼靠近C-端的193-368位氨基酸序列為主要抗原域，含有抗原結(jié)合位點(diǎn)，平均抗原指數(shù)在0.4～1.7之間，親水指數(shù)為0～1.5，親水性和表面可及性較高(圖1)。

圖1 BPIV3 NP 基因主要抗原域分析Fig.1 Analysis of major antigenic domains of BPIV3 NP gene

2.2 NP基因擴(kuò)增

提取BPIV3基因組總RNA，對NP基因抗原區(qū)片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得大小為525 bp的目的片段(圖2)，與試驗(yàn)預(yù)期相符。

M，Trans2K DNA Marker；1～4，NP基因；5，陰性對照M，Trans2K DNA Marker；1-4，NP gene；5，Negative control圖2 BPIV3 NP基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results of RT-PCR amplification of BPIV3 NP gene

2.3 NP基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將鑒定為陽性的pET-32a-NP重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小約為5 900和525 bp的2條片段(圖3)，符合預(yù)測結(jié)果，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M1，Trans2K DNA Marker;1，pET-32a-NP;M2，DL5000 DNA Marker圖3 重組質(zhì)粒pET-32a-NP雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pET-32a-NP by double digestion

2.4 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

SDS-PAGE結(jié)果顯示，與pET-32a(+)空質(zhì)粒對照相比，重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)沉淀在約50 ku處出現(xiàn)條帶(圖4)，大小與預(yù)期相符，說明該蛋白以包涵體形式表達(dá)。

M，Blue Plus Protein Marker;1，誘導(dǎo)前pET-32a(+)空質(zhì)粒；2，誘導(dǎo)后pET-32a(+)空質(zhì)粒；3，誘導(dǎo)前重組質(zhì)粒上清；4，誘導(dǎo)前重組質(zhì)粒沉淀；5，重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)上清；6，重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)沉淀M，Blue Plus Protein Marker;1，pET-32a(+)empty plasmid before induction;2，Induced expression of pET-32a(+)empty plasmid;3，Recombinant plasmid supernatant before induction;4，Recombinant plasmid precipitation before induction；5，Induced expression supernatant of recombinant plasmid;6，Induced expression precipitation of recombinant plasmid圖4 重組蛋白表達(dá)鑒定結(jié)果Fig.4 Expression and identification results of recombinant protein

2.5 重組蛋白的純化

SDS-PAGE結(jié)果顯示，蛋白在經(jīng)過4次50 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫后在第1次Elution Buffer洗脫時(shí)的目的蛋白量最大且純度較高，蛋白分子質(zhì)量大小約為50 ku(圖5)，證明重組蛋白純化成功。

M,Blue Plus Protein Marker;1,流穿液；2～5,Washing Buffer第1～4次洗脫；6～9,Elution Buffer第1～4次洗脫M,Blue Plus Protein Marker;1,Flow through liquid;2-5,The 1st to the 4th elution of Washing Buffer,respectively;6-9,The 1st to the 4th elution of Elution Buffer,respectively圖5 重組蛋白純化SDS-PAGE 分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant protein purification

2.6 重組蛋白Western blotting鑒定

用純化后的重組蛋白進(jìn)行Western blotting鑒定，在約50 ku處出現(xiàn)特異性條帶(圖6)，證明重組蛋白與山羊源BPIV3陽性血清發(fā)生反應(yīng)，具有反應(yīng)原性。

圖6 Western blotting檢測重組蛋白反應(yīng)原性Fig.6 Detection of reactogenicity of recombinant protein by Western blotting

2.7 重組蛋白的蛋白定量

用BCA法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)測得純化濃縮后的蛋白濃度為400 μg/mL。

2.8 間接ELISA方法測抗體滴度

由圖7可知，新西蘭白兔血清抗體效價(jià)在首免后7 d達(dá)到第一次高峰，免疫組抗體效價(jià)在1∶27到1∶29之間，在二免前，NP蛋白組的抗體效價(jià)最高，達(dá)到1∶212；從二免開始，抗體效價(jià)持續(xù)升高，在首免后28 d時(shí)，滅活疫苗和NP蛋白混合組抗體效價(jià)超過NP蛋白組(1∶217)，達(dá)到1∶218,滅活疫苗組抗體效價(jià)為1∶211,對照組均無變化。

圖7 新西蘭白兔血清抗體滴度變化Fig.7 Changes of serum antibody titer of New Zealand White rabbits

2.9 血清中和試驗(yàn)測中和抗體滴度

由圖8可知，免疫組的中和抗體效價(jià)持續(xù)增高，對照組無變化，在首免后28 d時(shí)，滅活疫苗組、滅活疫苗和NP蛋白混合組及NP蛋白組的中和抗體效價(jià)分別為1∶23.32、1∶24.98和1∶24.48，混合疫苗組的中和抗體效價(jià)高于其他免疫組。

圖8 新西蘭白兔血清中和抗體滴度變化Fig.8 Changes of serum neutralizing antibody titer in New Zealand White rabbits

3 討 論

自1959年Reisinger等[9]從美國犢牛腎臟首次分離到BPIV3后，英國、法國、加拿大、澳大利亞也都相繼有BPIV3感染的報(bào)道[10]，目前BPIV3已呈世界性分布。研究表明，BPIV3已在中國內(nèi)蒙古、山西、山東、黑龍江等地存在[11]，說明BPIV3在國內(nèi)的流行非常普遍并且很嚴(yán)重[12]。但目前國內(nèi)對BPIV3的研究還相對較少，因此亟需開展相關(guān)研究以便對BPIV3感染實(shí)施有效防控。BPIV3在第一次被發(fā)現(xiàn)后就有相關(guān)學(xué)者開始研究相關(guān)疫苗[13]，20世紀(jì)60～70年代研制出了滅活疫苗，免疫后牛表現(xiàn)出全身性的或局部性的體液免疫[13-15]，在20世紀(jì)60年代也研制出了弱毒疫苗，但有毒力返強(qiáng)等安全性問題，之后通過改進(jìn)，弱毒疫苗的安全性大大提高[16-17]，在國外針對BPIV3的滅活疫苗和弱毒苗已逐漸商品化[18]。也有人利用復(fù)制缺陷型的痘病毒作為表達(dá)載體來表達(dá)BPIV3的糖蛋白，肌內(nèi)注射或滴鼻都可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體[19]。

NP蛋白是BPIV3中含量最高的蛋白，同時(shí)是BPIV3的主要抗原成分，具有很好的反應(yīng)原性和免疫原性，與F和HN蛋白相比，NP蛋白高度保守同時(shí)與抗原的生成和蛋白酶磷酸化等具有重要的關(guān)系[8]，因此,本試驗(yàn)選擇NP蛋白作為BPIV3滅活疫苗的輔助蛋白，同時(shí)NP蛋白的成功表達(dá)也為以NP蛋白為抗原建立間接ELISA方法檢測未知抗體打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

本研究采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，其具有操作簡單、成本低、周期短、表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，是獲得外源表達(dá)蛋白的首選方案[20]。但研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)時(shí)，有時(shí)會導(dǎo)致二硫鍵不能正確進(jìn)行配對，過多蛋白間的非特異結(jié)合從而導(dǎo)致形成不可溶的包涵體[21]。為獲得有活性的目的蛋白，則需使用變性劑對包涵體進(jìn)行變性溶解再進(jìn)行復(fù)性操作，最后經(jīng)透析去除變性劑[22]，得到目的蛋白。本試驗(yàn)中NP蛋白呈包涵體形式表達(dá)，可能是在設(shè)計(jì)引物時(shí)，部分序列的親水性不高，導(dǎo)致整個(gè)蛋白呈包涵體形式表達(dá)，同時(shí)NP蛋白純化過程也是試驗(yàn)的一個(gè)難點(diǎn)，不同濃度咪唑的洗脫液對NP蛋白的洗脫效率都不高，50 mmol/L咪唑的洗脫液雖能有效將雜蛋白洗脫，但NP蛋白也損失嚴(yán)重，因此，NP蛋白的可溶性表達(dá)及純化的條件還需進(jìn)一步研究。

正黏病毒科與副黏病毒科的區(qū)分是以其核酸是否分節(jié)為標(biāo)準(zhǔn)，查閱相關(guān)資料后發(fā)現(xiàn)有人通過表達(dá)屬于正黏病毒科的流感病毒的NP蛋白，將其免疫小鼠后，并沒有降低受感染小鼠的病毒初始復(fù)制率，也沒有檢測到中和抗體，但其啟動了對A型流感病毒的交叉反應(yīng)性細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)(CTL)，NP蛋白對機(jī)體的保護(hù)作用可能由交叉反應(yīng)性CTL介導(dǎo)[23]；也有免疫研究表明，同為副黏病毒科呼吸道病毒屬的仙臺病毒，其NP蛋白刺激機(jī)體產(chǎn)生的IgG抗體遠(yuǎn)高于HN和F蛋白，可誘導(dǎo)保護(hù)性免疫，特別是在攻毒感染后期[24]。因本次試驗(yàn)并未做攻毒試驗(yàn)，因此暫不能確定單獨(dú)免疫NP蛋白是否可有效保護(hù)機(jī)體免受病毒侵襲，以及NP蛋白進(jìn)入機(jī)體后具體介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，還是通過激活宿主體內(nèi)T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞免疫而保護(hù)機(jī)體。

為驗(yàn)證免疫組之間抗體水平差異是否為NP蛋白輔助BPIV3滅活疫苗產(chǎn)生，本試驗(yàn)通過BPIV3的不同疫苗對新西蘭白兔進(jìn)行免疫，運(yùn)用間接ELISA和血清中和試驗(yàn)來測定血清中的抗體，試驗(yàn)結(jié)果表明新西蘭白兔在免疫28 d后各免疫組都能產(chǎn)生特異性抗體和中和抗體。滅活疫苗組、NP蛋白組及滅活疫苗和NP蛋白混合組的特異性抗體效價(jià)分別達(dá)到1∶211、1∶217和1∶218，中和抗體滴度分別達(dá)到1∶23.32、1∶24.48和1∶24.98。滅活疫苗和NP蛋白混合組的特異性結(jié)合抗體和中和抗體效價(jià)雖然在二免前不如NP蛋白組，但二免14 d后抗體效價(jià)在3組中都是最高的。綜上表明，少量NP蛋白的加入便可增強(qiáng)BPIV3滅活疫苗的免疫水平，相關(guān)文獻(xiàn)如E2蛋白也可增強(qiáng)牛病毒性腹瀉(BVDV)滅活疫苗的免疫效果[25]。因此,在滅活疫苗中加入保護(hù)性抗原很可能是提高滅活疫苗免疫效果的一種新方式，為BPIV3及伴隨的BRDC的防控提供新的方法策略。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功表達(dá)了純度較高的BPIV3 NP蛋白，將其與BPIV3滅活疫苗共同免疫新西蘭白兔，結(jié)果證明NP蛋白的加入可大幅提高BPIV3滅活疫苗的免疫水平。