付永智，馬曉君，王茂晗，李 哲，陳芝媛，權 偉，趙 涵，蘇詠梅，吳建華，朱文進

(河北科技師范學院動物科技學院，秦皇島 066004)

肌生長抑制素(myostatin,MSTN)又稱GDF-8，屬于轉化生長因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)超家族，是對動物骨骼肌生長起負調(diào)控作用的基因之一，由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，且CDS序列在不同物種中高度保守[1]。MSTN基因的作用機制是通過抑制細胞周期進展和終端肌細胞增殖，從而抑制肌肉的生長，其突變是肌肉肥大、增生的重要條件[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，MSTN基因多態(tài)性與豬、牛、羊和家禽的生長性狀均呈顯著相關[4-9]。MSTN基因突變可能對其編碼蛋白的功能及表達水平造成影響。McPherron等[10]研究發(fā)現(xiàn)，皮埃蒙特牛MSTN基因第3外顯子中的1個錯義突變使蛋白質(zhì)成熟區(qū)中的半胱氨酸被酪氨酸取代，蛋白質(zhì)功能發(fā)生改變，導致肌肉肥大。Mosher等[11]研究發(fā)現(xiàn)，惠比特犬MSTN基因第3外顯子中2 bp的缺失導致蛋白翻譯過程提前終止，相比正常表達水平減少20%。MSTN基因的表達水平能夠影響動物的肌肉質(zhì)量，表達量降低會造成骨骼肌增生、肥大，形成雙肌現(xiàn)象，過表達則會減少肌肉重量[12]，因此，MSTN基因是動物肌肉生長過程中的重要影響因子。目前，有關家驢MSTN基因的研究只有Liu等[13]報道的在中國13個家驢品種中檢測到4個SNPs位點(g.65 T→C、g.872 A→G、g.2017 G→A和g.2395 C→G)，而對家驢MSTN基因生物信息學分析和組織表達的研究鮮見報道。陽原驢是河北省優(yōu)良地方品種，其突出優(yōu)點是凈肉率高[14]。本研究以陽原驢為研究對象，通過PCR技術擴增陽原驢MSTN基因CDS序列，并對其編碼的蛋白序列進行生物信息學分析，利用實時熒光定量PCR技術檢測MSTN基因在不同月齡陽原驢肌肉組織和18月齡不同組織中的表達水平，以期為MSTN基因在陽原驢肌肉生長發(fā)育方面的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集 選擇6、12、18、24月齡的健康陽原母驢各3頭，采集頸靜脈血樣，-20 ℃保存?zhèn)溆?。屠宰后，采集背最長肌、腿肌、心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟的組織樣本，用無RNA酶的凍存管裝好后放入液氮冷凍，帶回實驗室后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 動物總RNA快速提取試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；SureScriptTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit、BlazeTaqSYBR Green qPCR Mix 2.0均購自廣州復能基因有限公司；2×ExTaqMasterMix(Dye)、DNA MarkerⅠ均購自康為世紀生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)GenBank中公布的馬(登錄號：NC_009161.3)、牛(登錄號：NC_037329.1)和山羊(登錄號：NC_030809.1)MSTN基因序列，設計3對引物擴增陽原驢MSTN基因CDS序列，參照馬MSTN基因mRNA序列(登錄號：XM_008516515.1)設計1對定量引物，內(nèi)參基因為GAPDH，引物信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 基因組DNA、總RNA提取及cDNA合成 基因組DNA采用酚-仿法從血樣中抽提；總RNA快速提取法參照上海捷瑞生物工程有限公司試劑盒說明書操作。用核酸濃度測試儀檢測基因組DNA和總RNA濃度，合格后使用SureScriptTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit將RNA反轉錄為cDNA。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物信息

1.2.3 PCR擴增及測序 PCR擴增體系20 μL：基因組DNA 1.5 μL，上、下游混合引物1.5 μL，2×ExTaqMasterMix(Dye) 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性40 s，退火(退火溫度見表1)40 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.6%瓊脂糖凝膠電泳鑒定合格后送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.4 序列相似性比對和系統(tǒng)進化樹構建 將測序結果用DNAMAN軟件拼接，拼接后的序列使用DNAStar軟件與馬(登錄號：XM_008516515.1)、野豬(NM_214435.2)、獼猴(登錄號：XM_012647928.1)、人(登錄號：NM_005259.3)、牛(登錄號：NM_001001525.3)、綿羊(登錄號：NM_001009428.3)、山羊(登錄號：NM_001285737.1)及駱駝(登錄號：XM_006189223 3)的序列進行多重比對。用Mega 7.0軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 生物信息學分析 利用生物信息學分析工具對陽原驢MSTN基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、親/疏水性、信號肽、結構域及高級結構等進行預測，具體軟件信息見表2。

表2 生物信息學分析工具

1.2.6 實時熒光定量PCR 以6、12、18、24月齡陽原驢背最長肌和腿肌組織以及18月齡心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，每個樣本設置3個重復。PCR反應體系20 μL：模板cDNA 2 μL，上、下游混合引物4 μL，5×BlazeTaqSYBR Green qPCR Mix 4 μL，ROX Reference Dye(30 μmol/L) 0.1 μL，ddH2O 9.9 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 使用2-△△Ct法計算各個組織中MSTN基因的相對表達量，并用SAS 9.4軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，結果用平均值±標準差表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結 果

2.1 陽原驢MSTN基因PCR擴增

由圖1可知，陽原驢MSTN基因不同引物擴增片段大小分別為600、566和507 bp，且條帶專一，均符合預期，可直接進行測序。測序結果顯示無重疊和非目的片段。

2.2 不同物種MSTN基因相似性比對及系統(tǒng)進化樹構建

對PCR產(chǎn)物測序結果進行拼接發(fā)現(xiàn)，陽原驢MSTN基因CDS序列長1 128 bp，編碼375個氨基酸，其與馬、野豬、駱駝、獼猴、人、綿羊、牛和山羊的核苷酸序列相似性分別為99.9%、97.3%、96.8%、96.3%、95.9%、93.8%、93.7%和93.7%(圖2)；氨基酸序列相似性分別為99.7%、98.3%、98.1%、97.8%、97.5%、94.7%、94.7%和94.7%(圖3)。系統(tǒng)進化樹結果顯示，陽原驢與同屬的馬聚為一類，與山羊和綿羊的親緣關系最遠(圖4)。

M，DL600 DNA Marker；1～3，引物S1、S2、S3的PCR擴增產(chǎn)物M,DL600 DNA Marker;1-3，PCR amplification products of S1,S2 and S3 primers，respectively圖1 陽原驢MSTN基因PCR擴增電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification of MSTN gene in Yangyuan donkeys

圖2 陽原驢與其他物種MSTN基因核苷酸序列的相似性比對Fig.2 Similarity alignment of nucleotide sequences of MSTN gene between Yangyuan donkeys and other species

2.3 生物信息學分析

2.3.1 理化性質(zhì)和親/疏水性分析 陽原驢MSTN蛋白的分子式為C1911H3015N513O562S21，帶負電荷的氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)為47個，帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)為48個(表3)。預計半衰期為30 h，脂肪指數(shù)為83.95，不穩(wěn)定指數(shù)為42.79，為不穩(wěn)定蛋白。由圖5可知，第14氨基酸處(纈氨酸)疏水性最高，為3.100；第28位氨基酸處(谷氨酸)親水性最低，為-3.244，親水性總平均值(GRAVY)為-0.406，屬于親水性蛋白。

圖4 MSTN基因系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of MSTN gene

表3 陽原驢MSTN蛋白氨基酸組成

2.3.2 跨膜結構、信號肽和亞細胞單位預測 陽原驢MSTN蛋白不存在跨膜區(qū)，存在信號肽區(qū)域，序列為：MQKLQIYVYIYLFVLILA，位于序列85-102位氨基酸處，101-102位氨基酸處可能存在切割位點(圖6)。亞細胞定位結果顯示，MSTN蛋白在細胞核、線粒體、細胞質(zhì)、細胞膜、膜外、高爾基體、囊泡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中占比分別為39.1%、17.4%、17.4%、8.7%、4.3%、4.3%、4.3%和4.3%。

圖5 陽原驢MSTN蛋白的親/疏水性預測Fig.5 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction of MSTN protein in Yangyuan donkeys

圖6 陽原驢MSTN蛋白信號肽預測Fig.6 Signal peptide prediction of MSTN protein in Yangyuan donkeys

2.3.3 糖基化及磷酸化位點預測 糖基化及磷酸化位點預測結果顯示，陽原驢MSTN蛋白共有34個磷酸化位點，分別為16個絲氨酸、14個蘇氨酸和4個酪氨酸位點(圖7)；6個O-糖基化位點分別位于第50、73、114、123、258和264位氨基酸處，1個N-糖基化位點位于第71位氨基酸處(圖8)。

圖7 陽原驢MSTN蛋白磷酸化位點預測Fig.7 Phosphorylation site prediction of MSTN protein in Yangyuan donkeys

圖8 陽原驢MSTN蛋白糖基化位點預測Fig.8 Glycosylation site prediction of MSTN protein in Yangyuan donkeys

2.3.4 二級結構及三級結構預測 陽原驢MSTN蛋白的二級結構中α-螺旋、β-轉角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈占比分別為21.60%、3.73%、50.93%和23.73%(圖9)。陽原驢MSTN蛋白三級結構主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈組成(圖10)，與二級結構預測結果一致。

c，無規(guī)則卷曲；t，β-轉角；h，α-螺旋；e，延伸鏈c，Random coil；t，Beta turn；h，Alpha helix；e，Extended chain圖9 陽原驢MSTN蛋白二級結構預測Fig.9 Secondary structure prediction of MSTN protein in Yangyuan donkeys

圖10 陽原驢MSTN蛋白三級結構預測Fig.10 Tertiary structure prediction of MSTN protein in Yangyuan donkeys

2.3.5 保守結構域預測 陽原驢MSTN蛋白的保守結構域預測結果顯示，第145―747位氨基酸區(qū)域為TGF-β前肽，又稱潛伏期相關肽，其二硫鍵與TGF-β蛋白緊密相連。第802―1 125位氨基酸區(qū)域?qū)儆赥GF-β結構域(圖11)。

圖11 陽原驢MSTN蛋白保守結構域預測Fig.11 Conserved domain prediction of MSTN protein in Yangyuan donkeys

2.4 MSTN基因在不同月齡陽原驢肌肉中及18月齡不同組織中的表達水平

MSTN基因在不同月齡陽原驢背最長肌和腿肌中的表達水平見圖12。由圖12可知，18月齡陽原驢MSTN基因在背最長肌和腿肌中表達水平顯著高于6、12、24月齡(P<0.05)，6和24月齡的表達水平顯著低于12月齡(P<0.05)。

相同組織不同月齡間，肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)In the same tissues and different months,values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05);And with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖12 MSTN基因在不同月齡陽原驢背最長肌和腿肌中的表達水平Fig.12 Expression of MSTN gene in longissimus dorsi muscle and leg muscle of Yangyuan donkeys at different months

鑒于MSTN基因在18月齡陽原驢肌肉組織中表達水平最高，進一步分析MSTN基因在不同組織中的相對表達量，結果見圖13。由圖13可知，MSTN基因在不同組織中均都有表達，其中在背最長肌中的表達水平顯著高于其他組織(P<0.05)；在腿肌中的表達水平顯著高于內(nèi)臟組織(P<0.05)；肺臟、脾臟和腎臟中的表達水平無顯著差異(P>0.05)，但均顯著高于肝臟和心臟(P<0.05)。不同組織中表達水平依次為背最長肌>腿肌>肺臟>脾臟>腎臟>肝臟>心臟，由此可見MSTN基因主要在肌肉中表達。

肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05);And with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖13 MSTN基因在18月齡陽原驢不同組織中的表達水平Fig.13 Expression of MSTN gene in different tissues of 18 months old Yangyuan donkeys

3 討 論

MSTN基因是調(diào)控骨骼肌的主效基因之一，由McPherron等[15]于1997年在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，目前已在多個物種上被克隆和分析。本研究成功擴增出陽原驢MSTN基因完整CDS序列，長1 128 bp，編碼375個氨基酸，與馬的相似性最高，達99.9%，符合傳統(tǒng)的生物學分類。陽原驢MSTN基因編碼蛋白中亮氨酸含量為9.1%，占比最高；組氨酸和色氨酸含量均為1.6%，占比最低。此外，可以維持蛋白活性的甲硫氨酸和半胱氨酸含量分別為2.1%和3.5%，甲硫氨酸和半胱氨酸可以促進二硫鍵形成，在細胞內(nèi)同源二聚化，這是MSTN基因翻譯后修飾的重要步驟，此后其編碼蛋白才具有生物學活性[16-17]。糖基化和磷酸化是蛋白修飾的2種方式，磷酸化修飾會影響蛋白活性，而糖基化修飾在細胞黏附和信號轉導等方面具有重要作用[18]。本研究結果顯示，陽原驢MSTN蛋白包含6個O-糖基化位點、1個N-糖基化位點和34個磷酸化位點，為其作用機制的進一步研究提供了參考。

陽原驢MSTN蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白。蛋白的親水性殘基位于結構的表面，內(nèi)部為疏水性的氨基酸，說明MSTN蛋白屬于可溶性蛋白。蛋白穩(wěn)定與否與二級結構中無規(guī)則卷曲占比有關，該結構為活性部位，容易受側鏈影響。陽原驢MSTN蛋白二級結構和三級結構中無規(guī)則卷曲占比最高，與郭勇等[19]分析的江香豬MSTN蛋白二級結構中無規(guī)則卷曲占比最高的結果一致，說明蛋白不穩(wěn)定的特性在種間高度保守。MSTN蛋白不存在跨膜區(qū)，有信號肽剪切位點，蛋白可以進行細胞間的信號交流，說明其屬于分泌性蛋白；亞細胞結構定位主要在細胞核中，這可能與MSTN基因是以潛在復合體形式分泌的方式有關[16]。保守結構區(qū)預測結果顯示，MSTN蛋白氨基酸序列第145―747位氨基酸區(qū)域為TGF-β的前肽區(qū)域，而C-末端的802―1 125位氨基酸區(qū)域為成熟區(qū)，其在不同物種之間高度保守。

MSTN基因在動物不同生長發(fā)育時期的肌肉組織中表達水平不同。毛亮等[20]研究結果顯示，MSTN基因在藏雞腿肌和胸肌中的表達水平最高，其次為心臟；姜懿軒等[21]對新西蘭兔MSTN基因組織表達譜研究結果發(fā)現(xiàn)，MSTN基因在腿肌中的表達水平最高，其次為腎臟，肝臟最低；梁婧嫻等[22]研究表明，MSTN基因在3～12月齡藏系綿羊腿肌中表達呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中6和12月齡的表達水平最高，與江炎庭等[23]研究MSTN基因在3、6、9、12月齡云上黑山羊腰肌、腿肌和背最長肌中表達水平的結果基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)，陽原驢MSTN基因在6～24月齡背最長肌和腿肌中也是呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，且以18月齡表達水平最高，進一步分析該基因在18月齡不同組織中的表達水平，結果顯示，陽原驢MSTN基因在不同組織中均有表達，但以背最長肌和腿肌中的表達水平較高，與以上研究結果基本一致，說明MSTN基因主要在肌肉中表達，而在其他不同組織中的表達水平較低，且不同組織間有一定的差異。

4 結 論

本研究成功擴增出陽原驢MSTN基因CDS區(qū)，其在不同物種之間具有高保守性。MSTN基因在18月齡陽原驢背最長肌和腿肌中的表達水平均最高，且在18月齡陽原驢不同組織中仍以背最長肌和腿肌表達水平較高，說明MSTN基因表達水平對陽原驢骨骼肌的生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。