王志亮 盛楷迪 林毅 張秋業(yè) 張麗娟 常紅

（1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院兒童腎臟風(fēng)濕免疫科，山東青島 266003；2.青島大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院，山東青島 266003；3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)中心，山東青島 266003）

過敏性紫癜（Henoch-Sch?nlein purpura，HSP）是一種常見的、由IgA為主的免疫復(fù)合物所介導(dǎo)的系統(tǒng)性血管炎［1］。該病在任何年齡均可發(fā)病，多見于兒童。其典型臨床特征是非充血性可觸性皮疹（紫癜樣皮疹），伴關(guān)節(jié)腫痛、腹痛或腎臟受累［2］。研究表明HSP和紫癜性腎炎（Henoch-Sch?nlein purpura nephritis，HSPN）患者血清IgA1分子存在糖基化異常，其具體部位位于IgA1分子鉸鏈區(qū)的連接O-聚糖，表現(xiàn)為唾液酸基與半乳糖基減少。異常IgA1分子無法及時清除，并誘發(fā)自身免疫、產(chǎn)生抗異常IgA1抗體，形成免疫復(fù)合物，沉積于靶器官引起炎性反應(yīng)［3-5］。糖基化是糖鏈基團(tuán)在糖基化酶的控制下對蛋白的重要修飾，異常糖基化與糖鏈基團(tuán)的變化密不可分，而血清中降解單糖的含量變化在一定程度上是糖鏈基團(tuán)數(shù)量和聚糖結(jié)構(gòu)變化的反映［6］。青島大學(xué)附屬醫(yī)院系統(tǒng)生物學(xué)張麗娟實(shí)驗(yàn)室利用高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC），即PCR儀輔助酸解法分析血清多糖的單糖組成［7］，申請了檢測血液中單糖組分（游離單糖或降解單糖 ） 的 專 利 技 術(shù) （CN20140211976.3，CN201710394424.4，CN201810298226），這一技術(shù)被稱為“糖指紋”，意為每一種不同疾病都有自己獨(dú)特的血清單糖濃度變化。將復(fù)雜的糖鏈基團(tuán)結(jié)構(gòu)降解為單糖組分，簡單快捷地測定血清中單糖含量，完成成分的定性和定量測定，結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定。張麗娟實(shí)驗(yàn)室利用糖指紋技術(shù)發(fā)現(xiàn)血清單糖組分在結(jié)直腸癌中的變化及意義［8］。目前尚無應(yīng)用糖指紋技術(shù)探索單糖組分在HSP患兒中臨床意義的研究報道。

本研究采用HPLC分析HSP患兒血清降解單糖濃度，探討血清降解單糖與HSP的聯(lián)系，尋找潛在的糖類生物標(biāo)志物，并分析降解單糖對HSP診斷的價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

前瞻性選取2019年9月至2022年1月就診于青島大學(xué)附屬醫(yī)院兒童腎臟風(fēng)濕免疫科的132例HSP患兒為研究對象，所有患兒均符合兒童HSP的診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］。另選取在我院體檢的健康兒童132例為對照組。2組患兒性別、年齡、體重指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。該研究通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批（QYFYWZLL26176）。

表1 HSP組與對照組基礎(chǔ)資料比較

1.2 樣本采集

采集HSP患兒及健康體檢兒童空腹（餐后6 h）外周靜脈血4 mL于無菌促凝管，離心后取200μL上清液移于-80°C冰箱統(tǒng)一保存?zhèn)錂z。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

高效液相色譜儀（Agilent1260）購自美國Agilent公司。標(biāo)準(zhǔn)品：鼠李糖（l-rhamnose monohydrate，Rha）、葡萄糖（glucose，Glc）、甘露糖（mannose，Man）、氨基半乳糖（galactosamine，GalN）、氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）、N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcUA）、半乳糖（galactose，Gal）、木糖（xylose，Xyl）、巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（5-methyl-2-phenyl-1,2-dihydropyrazol-3-one，PMP）、氯仿購于美國SIGMA-ALDRICH公司。乙腈、甲醇為色譜純，氫氧化鈉溶液、鹽酸溶液、乙酸銨、冰醋酸為分析純。

1.4 PCR儀輔助酸解法分析血清多糖的單糖組成實(shí)驗(yàn)方法

5μL血清加入5μL（1 mg/mL）Rha、10μL（6 mol/L）鹽酸溶液，運(yùn)行PCR酸解程序（90 s內(nèi)升溫至100℃，保持10 min后于120 s內(nèi)冷卻至4℃），加入20μL（3 mol/L）氫氧化鈉溶液、20μL（0.5 mol/L）PMP后放入PCR儀中運(yùn)行PCR衍生程序（70℃保持40 min后冷卻至4℃保持10 min），加入20μL乙酸銨緩沖溶液、100μL氯仿萃取后放入離心機(jī)（13 300 r/min，15 min），取50μL上清液待HPLC分析。

1.5 HPLC檢測條件

檢測波長254 nm，帶寬4 nm，參比波長350 nm，帶寬100 nm，柱溫37℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣體積20μL。流動相：100%乙腈和乙酸銨緩沖溶液（pH=5.5）。梯度模式：時間梯度：0?10?15?20 min；乙腈的濃度梯度：15%?22%?24%?15%；乙酸銨緩沖溶液（pH=5.5）的濃度梯度85%?78%?76%?85%。

1.6 單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程式

標(biāo)準(zhǔn)單糖混合溶液等梯度濃度稀釋為10個梯度。將不同濃度梯度的單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合液通過HPLC分析得到單糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖（圖1）。將單糖標(biāo)準(zhǔn)品的濃度作為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積作為縱坐標(biāo)，得到對應(yīng)的單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及相應(yīng)的方程式（表2）。血清樣品通過HPLC分析得到HPLC色譜圖，因此得到HSP組和對照組兒童血清降解得到的9種單糖濃度（圖2）。因未檢測到血清GlcUA、GlcNAc、Glc、Xyl、Fuc的濃度在HSP組與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以本研究主要討論HSP患兒血清中Man、GlcN、GalN和Gal與疾病的關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)品血清內(nèi)加入濃度一致的Rha，用于監(jiān)測血清中有無其他內(nèi)源性物質(zhì)干擾單糖的測定。

圖1 10種單糖標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖 ［PMP］1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮；［Man］甘露糖；［GlcN］氨基葡萄糖；［Rha］鼠李糖；［GalN］氨基半乳糖；［GlcUA］葡萄糖醛酸；［GlcNAc］N-乙酰氨基葡萄糖；［Glc］葡萄糖；［Gal］半乳糖；［Xyl］木糖；［Fuc］巖藻糖。a為衍生試劑峰；b為單糖內(nèi)標(biāo)試劑峰。

表2 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程式

圖2 血清樣品降解單糖HPLC色譜圖 ［PMP］1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮；［Man］甘露糖；［GlcN］氨基葡萄糖；［Rha］鼠李糖；［GalN］氨基半乳糖；［GlcUA］葡萄糖醛酸；［GlcNAc］N-乙酰氨基葡萄糖；［Glc］葡萄糖；［Gal］半乳糖；［Xyl］木糖；［Fuc］巖藻糖。a為衍生試劑峰；b為單糖內(nèi)標(biāo)試劑峰。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析Man、GlcN、GalN和Gal對HSP的診斷價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組血清4種單糖水平分析

HSP組患兒血清Man、GlcN、GalN和Gal濃度高于對照組（P<0.001），見表3。

表3 HSP組與對照組單糖水平比較（±s，μmol/L）

表3 HSP組與對照組單糖水平比較（±s，μmol/L）

注：［Man］甘露糖；［GlcN］氨基葡萄糖；［GalN］氨基半乳糖；［Gal］半乳糖；［HSP］過敏性紫癜。

組別對照組HSP組t值P值例數(shù)132 132 Man 2.78±0.35 3.56±0.58 13.27<0.001 GlcN 2.28±0.34 3.02±0.54 13.28<0.001 GalN 1.05±0.19 1.33±0.22 10.94<0.001 Gal 2.11±0.27 2.83±0.51 14.50<0.001

2.2 4種單糖的ROC曲線分析

ROC曲線分析顯示，HSP患兒除GalN的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.823外，Man、GlcN和Gal的AUC均>0.9，三者均對HSP有較好的診斷價值（P<0.001），見圖3、表4。

圖3 血清4種單糖ROC曲線 ［Man］甘露糖；［GlcN］氨基葡萄糖；［GalN］氨基半乳糖；［Gal］半乳糖。

表4 血清單糖水平診斷HSP的ROC曲線分析

3 討論

糖蛋白在機(jī)體內(nèi)承擔(dān)著重要功能，如結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)運(yùn)、酶促反應(yīng)等，特別是在免疫系統(tǒng)。免疫球蛋白都屬于糖蛋白，而糖基化修飾對于蛋白發(fā)揮正常功能具有重要意義。糖鏈基團(tuán)是一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且龐大的多糖，由多種結(jié)構(gòu)相同或不同的單糖通過糖苷鍵結(jié)合而成［10］。糖組學(xué)是當(dāng)前生物學(xué)領(lǐng)域的新興學(xué)科，主要研究多糖在生物體內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能。近年來隨著糖組學(xué)和糖蛋白組學(xué)的發(fā)展，糖鏈基團(tuán)在免疫及免疫系統(tǒng)疾病中的功能機(jī)制及作用逐漸成為免疫學(xué)的研究熱點(diǎn)［11］。但是與核糖核酸和蛋白質(zhì)不同的是，糖鏈基團(tuán)的合成沒有模板，且易受環(huán)境的影響；目前對糖鏈基團(tuán)的多糖結(jié)構(gòu)的解析需要昂貴的儀器和復(fù)雜的多糖制備程序，這使得糖鏈基團(tuán)的基礎(chǔ)研究結(jié)果在現(xiàn)階段難以轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。

單糖是糖基化蛋白中糖鏈基團(tuán)的最小組成單位，與異常糖基化密切相關(guān)，單糖濃度在一定情況下可以反映糖鏈基團(tuán)異常改變的程度。將復(fù)雜的糖鏈基團(tuán)的多糖結(jié)構(gòu)降解為單糖，分析復(fù)雜糖鏈基團(tuán)的單糖組成可能會是一種新的臨床應(yīng)用方向。糖鏈基團(tuán)的多糖結(jié)構(gòu)降解后由以下11種單糖組成，即Man、GlcUA、GlcNAc、Glc、Xyl、Fuc、GlcN、GalN、Gal、艾杜糖醛酸和唾液酸［7-8］。本研究采用的HPLC分析HSP患兒血清單糖水平，相比較于質(zhì)譜法，HPLC僅需5μL患兒血清20 min即可完成樣品檢測，一次性可得到9種單糖濃度，且結(jié)果可重復(fù)性好。

HSP可有皮膚、關(guān)節(jié)、胃腸道、腎臟等多個器官及系統(tǒng)受累，腎臟損害是影響HSP預(yù)后的關(guān)鍵因素［12］。有研究表明HSP、HSPN患者血清中半乳糖 缺 陷IgA1（galactose-deficient IgA1，Gd-IgA1）水平顯著升高，而Gd-IgA1誘發(fā)自身免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體可與Gd-IgA1結(jié)合并形成免疫復(fù)合物，目前公認(rèn)這是HSP及HSPN發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制［13］。人類血清免疫球蛋白IgA有2個亞型：IgA1和IgA2，其中IgA1鉸鏈區(qū)的N-聚糖是由N-乙酰氨基葡糖的β-碳原子與天冬酰胺的酰胺基結(jié)合，而IgA1分子不僅有4條N-聚糖，而且還有多達(dá)10條的O-聚糖，其基本結(jié)構(gòu)是由N-乙酰氨基半乳糖與鉸鏈區(qū)多肽骨架上的蘇氨酸或者絲氨酸的羥基結(jié)合形成，而Gal可通過形成β1,3鍵連接至N-乙酰氨基半乳糖上，構(gòu)成Galβ1,3GalNAc，從而使糖鏈延長。因種種因素，HSP與HSPN患者血清中IgA1糖鏈基團(tuán)脫中半乳糖豐度顯著下降，而此種Gd-IgA1可使IgA1免疫原性發(fā)生改變，從而誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗自身多糖抗體，導(dǎo)致循環(huán)免疫復(fù)合物的形成，循環(huán)免疫復(fù)合物可沉積于系膜區(qū)，從而引起HSP患兒腎損傷。健康人群血清中IgA1亦含有少量半乳糖缺陷的O-聚糖；而HSPN患者Gd-IgA1比例顯著增高［14］。

因血清GlcUA、GlcNAc、Glc、Xyl、Fuc的濃度在HSP組與對照組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以本研究主要討論血清中Man、GlcN、GalN和Gal與HSP的關(guān)系。已有的研究顯示HSP患兒Gd-IgA1比例增高［14］，本研究測得HSP患兒血清Gal濃度高于對照組，可能與HSP患兒異常糖基化有關(guān)；本研究也顯示HSP患兒的血清Man、GlcN、GalN濃度高于對照組，這提示Man、GlcN、GalN相關(guān)的異常糖基化可能參與了HSP的發(fā)生發(fā)展。ROC曲線分析顯示HSP患兒血清Man、GlcN、GalN和Gal的曲線下面積分別為0.919、0.913、0.832和0.932，提示患兒血清Man、GlcN、GalN和Gal可能是診斷及作為監(jiān)測HSP發(fā)生發(fā)展的靈敏指標(biāo)。因PCR儀輔助酸解法分析血清多糖的單糖組成的實(shí)驗(yàn)方法降解到的血清單糖為血清中幾乎所有糖蛋白糖鏈的單糖，所以我們暫時不能確定HSP患兒血清中Gal濃度的升高是否完全來源于Gd-IgA1；同樣HSP患兒血清Man、GlcN、GalN的濃度升高原因暫時不明，需進(jìn)一步的研究證實(shí)。且本研究為單中心的研究，只針對HSP患兒和對照組兒童的血清單糖濃度進(jìn)行檢測，并無其他疾病兒童對照，如IgA腎病兒童，血清Man、GlcN、GalN、Gal是否可作為HSP獨(dú)有的血清標(biāo)志物仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，HSP患兒血清Man、GlcN、GalN、Gal濃度顯著高于健康兒童，可能與HSP患兒血清異常糖基化有關(guān)，提示HSP患兒降解單糖的水平對疾病的診斷可能具有重要價值，但是否可以成為臨床診斷及檢測HSP發(fā)生發(fā)展的獨(dú)特標(biāo)志物尚需進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明無利益沖突。