唐麗亞，瞿啟睿，吳 霞，龍軼映，許 明，張 泓，劉 瓊，艾 坤*，周 璐*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410219；3.郴州市第一人民醫(yī)院，湖南 郴州 423000）

神經(jīng)源性膀胱（neurogenic bladder, NB）是脊髓損傷后常見(jiàn)的并發(fā)癥之一[1]。 膀胱正常的排尿反射由脊髓的交感神經(jīng)區(qū)（T10～L2 脊髓節(jié)段）、副交感神經(jīng)區(qū)（S2～S4 脊髓節(jié)段）和腦橋等高級(jí)中樞共同控制。脊髓損傷后由于炎癥反應(yīng)、膠質(zhì)細(xì)胞增生和氧化應(yīng)激等繼發(fā)性損傷，導(dǎo)致神經(jīng)組織損傷范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，出現(xiàn)膠質(zhì)瘢痕增生和軸突再生障礙。T10 及以上脊髓損傷后，支配膀胱的交感神經(jīng)失去腦橋等高級(jí)排尿中樞的控制而出現(xiàn)過(guò)度興奮，其支配的膀胱括約?。ò螂最i）過(guò)度收縮，最終導(dǎo)致膀胱頸梗阻和膀胱排尿障礙[2]，繼而引起尿液反流和腎功能損傷等一系列泌尿系統(tǒng)問(wèn)題[3-4]。

因此，減輕脊髓損傷后的繼發(fā)性損傷，保護(hù)神經(jīng)組織，抑制T10～L2 脊髓節(jié)段交感神經(jīng)區(qū)過(guò)度興奮是治療脊髓損傷后膀胱頸功能障礙（bladder neck dysfunction, BND）的重要思路之一。 目前，臨床上主要通過(guò)膀胱頸切開(kāi)術(shù)和注射α 受體阻滯劑來(lái)治療BND，雖然取得一定療效，但依然存在術(shù)后并發(fā)癥、藥物毒副作用等缺陷[5-6]。 因此，從T10～L2 脊髓節(jié)段尋找其他潛在的干預(yù)靶點(diǎn)來(lái)指導(dǎo)治療脊髓損傷后BND，其臨床意義尤為重要。

TMT 標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)能更全面地檢測(cè)出組織中表達(dá)的蛋白質(zhì)，這也為蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)高靈敏度和高深度的蛋白質(zhì)組覆蓋[7]。通過(guò)篩選目標(biāo)組織中的差異表達(dá)蛋白（differentially expressed proteins, DEPs），并對(duì)DEPs 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，重點(diǎn)探討潛在的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白，能從多個(gè)角度探討疾病的病理機(jī)制[8]，有助于挖掘出疾病潛在的臨床干預(yù)靶點(diǎn)。

本研究通過(guò)橫斷T10 脊髓節(jié)段制備脊髓損傷后BND 模型[9]，使用TMT 標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)T10～L2 脊髓節(jié)段的DEPs，再對(duì)這些DEPs 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從而尋找新的生物標(biāo)志物來(lái)指導(dǎo)治療脊髓損傷后BND。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康成年雌性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量250～280 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證編號(hào)：1107271911006889。標(biāo)準(zhǔn)條件下（溫度24～26 ℃，濕度50%～70%）分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。 40 只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（12 只）和造模組（28 只），造模組大鼠采用Hassan Shaker 脊髓橫斷法[9]制備T10 脊髓損傷模型，脊髓休克期過(guò)后共存活25 只，其中13 只模型組大鼠出現(xiàn)尿潴留，采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取12只納入模型組。

1.2 主要試劑與儀器

水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20131031）；青霉素鈉（哈藥集團(tuán)有限公司，80 萬(wàn)U/支，批號(hào)：H23021600）；胰蛋白酶（上海嶸崴達(dá)科技公司，批號(hào)：11047841001）；蛋白酶抑制劑（上海嶸崴達(dá)科技公司，批號(hào)：10109878001）；BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒（美國(guó)Thermo Scientific 公司，批號(hào)：QB214754）；TMT10plexTM同量異序質(zhì)量標(biāo)簽試劑盒（美國(guó)Thermo Scientific 公司，批號(hào)：90113CH）；碘乙酰胺（美國(guó)SIGMA-ALDRICH 公司，批號(hào)：I1149）；無(wú)水乙腈（美國(guó)SIGMA-ALDRICH 公司，批號(hào)：271004）。

MP-150 多通道生理記錄儀（美國(guó)BIOPAC 公司，型號(hào)：MP150-WSW）；微量注射泵（浙江史密斯醫(yī)學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：WZ-50C6）；Q Exactive 質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Scientific 公司，型號(hào)：0726090）；加熱混合器（美國(guó)Thermo Scientific 公司，型號(hào)：13687711）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Scientific 公司，型號(hào)：1425955）。

1.3 動(dòng)物造模

大鼠造模前2 h 腹腔注射青霉素鈉20 萬(wàn)U/只以抗炎。 用10%水合氯醛按30 mg/kg 腹腔麻醉，大鼠俯臥固定在鼠板上，以T13 椎體作為骨性標(biāo)志，往上數(shù)至T8～T9 椎體處備皮、消毒，做2～3 cm的縱向切口，切開(kāi)皮下組織，鈍性分離兩側(cè)豎脊肌和棘突旁肌肉，暴露T8 和T9 的棘突和相鄰椎弓。 用顯微咬骨器咬除T8 椎板和兩側(cè)椎弓根，暴露脊髓，牙科彎鉤勾出脊髓，11 號(hào)手術(shù)刀片橫斷，多次切斷確保脊髓完全橫斷。 縫合肌肉，用5%聚維酮碘消毒切口及周圍，縫合皮膚。

術(shù)后將大鼠放置恒溫電熱毯上直至蘇醒，單籠飼養(yǎng)；術(shù)后1 周早晚各1 次腹腔注射青霉素鈉（20萬(wàn)U/只）；每天早、中、晚定時(shí)采用Crede 手法[10]輔助排尿；出現(xiàn)壓瘡、自殘現(xiàn)象者用5%聚維酮碘消毒并在對(duì)應(yīng)部位撒上青霉素粉。

對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估（后肢不能參與行走，在前肢行走時(shí)處于拖動(dòng)狀態(tài)，BBB 評(píng)分[11]為0 分）和膀胱排尿功能評(píng)估（在脊髓休克期過(guò)后，膀胱持續(xù)處于尿潴留狀態(tài)，膀胱脹大明顯，不能自主排尿），同時(shí)符合這兩個(gè)條件則造模成功。

假手術(shù)組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)直至尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，期間不做其他處理。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

造模后第19 天行尿流動(dòng)力學(xué)檢查[12]，而后斷頭處死大鼠，取T10～L2 脊髓組織和膀胱頸備檢，取3只大鼠的T10～L2 脊髓組織液氮冷凍用于TMT 蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)，剩余的膀胱頸組織和T10～L2 脊髓組織用于HE 染色。

1.4.1 尿流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 大鼠麻醉后進(jìn)行膀胱灌注實(shí)驗(yàn)，導(dǎo)尿管插入膀胱頂后與膀胱水平放置，設(shè)置MP150 主機(jī)壓力基線為零。 將F3 導(dǎo)尿管、MP150-WSW 型16 通道生理記錄儀與WZ-50C6 微量注射泵通過(guò)三通管相連接。打開(kāi)微量注射泵，灌注速度為6 mL/h，灌注的生理鹽水溫度為25～35 ℃。 觀察并記錄膀胱壓力曲線的變化和漏尿情況：觀察有無(wú)尿液從尿道口溢出，大鼠首次出現(xiàn)尿液溢出，此時(shí)記錄的膀胱壓力即為漏尿壓（leak point pressure, LPP）；最大膀胱容量（maximum cystometric capacity, MCC）則為從開(kāi)始灌注生理鹽水到尿液漏出尿道口所灌注液體的體積。 繼續(xù)灌注出現(xiàn)穩(wěn)定波形。

1.4.2 HE 染色 大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后剪開(kāi)右心耳，用生理鹽水從左心室快速灌注直至流出液體變清透后用4%多聚甲醛固定，取T10～L2脊髓組織和膀胱頸用4%多聚甲醛48 h 固定、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、蘇木精和伊紅染色、脫水和中性樹(shù)膠封片后，光學(xué)顯微鏡下觀察T10～L2 脊髓和膀胱頸的組織學(xué)變化。

1.5 TMT 蛋白組學(xué)分析

1.5.1 蛋白質(zhì)樣品制備 在10%水合氯醛麻醉下，提取大鼠T10～L2 脊髓組織。樣品中各加入1000 μL 工作液（RIPA 裂解液與蛋白酶抑制劑混合，置于冰上預(yù)冷，得到工作液）充分混勻，冰浴超聲5 min，充分溶解；14 000 r/min、4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)移上清至新的EP 管中；使用BCA 蛋白測(cè)定試劑盒按照說(shuō)明書(shū)要求定量測(cè)定蛋白濃度。

1.5.2 TMT 定量標(biāo)記 每個(gè)樣品取100 μL 上清液進(jìn)行還原、烷基化、丙酮沉淀和蛋白重溶，得到相應(yīng)樣品的多肽，吸取20 μL 不同的TMT 溶液至對(duì)應(yīng)樣品中，混勻并離心，室溫孵育1 h 后加入羥氨至100 mmol/L，室溫孵育15 min 終止反應(yīng)；將各組標(biāo)記樣品等量混合；去除脫氧膽酸鈉（sodium deoxy cholate, SDC）后取上清至新EP 管，得到標(biāo)記的多肽樣品；經(jīng)過(guò)多肽脫鹽和RP-RP 分級(jí)和真空干燥后-80 ℃凍存，用于LC-MS/MS 分析。

1.5.3 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析 經(jīng)過(guò)LC-MS/MS 分析后得到的原始數(shù)據(jù)使用MaxQuant（version1.6.1.0）進(jìn)行搜庫(kù)和TMT 定量分析，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)為uniprot_rattus_20190711_iso，多肽和蛋白水平FDR＜0.01。 隨后對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使各組樣品總蛋白或中位數(shù)一致。將差異倍數(shù)（fold change, FC）＞1.2 或＜1/1.2，P＜0.05，unique peptide≥2 的蛋白定義為DEPs，并對(duì)DEPs進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū) （Kyoto encyclope dia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction,PPI）分析。

1.6 DEPs 的生物信息學(xué)分析

將DEPs 對(duì)應(yīng)的基因名導(dǎo)入kobass 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://kobas.c bi.pku.edu.cn/）[13]， 選擇物種 Rattus.norvegicus，P＜0.05 對(duì)DEPs 進(jìn)行KEGG 分析。 利用STRING(https://string-db.org/)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，下載tsv格式的分析結(jié)果并導(dǎo)入到Cytoscape 軟件[14]，對(duì)PPI做進(jìn)一步可視化分析。 利用cytoHubba 插件[15]并根據(jù)DEPs 的度（Degree）值篩選出排名前35 位的關(guān)鍵DEPs，并通過(guò)GluGO 插件[16]對(duì)35 個(gè)關(guān)鍵DEPs 參與的生物過(guò)程進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以“±s”表示，滿足正態(tài)性和方差齊性用t 檢驗(yàn)，不滿足則用Wilcoxon 檢驗(yàn)。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

假手術(shù)組一般情況良好。 模型組大鼠脊髓休克期后后肢隨意運(yùn)動(dòng)消失，爬行時(shí)處于拖動(dòng)狀態(tài)；膀胱脹大，可在下腹部觸摸到“橄欖型”膀胱；大鼠下腹部和籠內(nèi)墊料輕度潮濕，手法排尿時(shí)可感覺(jué)到尿道口有阻力。

2.2 尿流動(dòng)力學(xué)結(jié)果

與假手術(shù)組相比，模型組LPP 和MCC 均明顯增高（P＜0.01）。 詳見(jiàn)表1。

表1 大鼠膀胱LPP、MCC 比較（±s）

表1 大鼠膀胱LPP、MCC 比較（±s）

注：與假手術(shù)組相比，**P＜0.01。

MCC/mL 0.36±0.08 4.68±0.44**組別假手術(shù)組模型組n 12 12 LPP/mmHg 18.05±1.64 49.78±2.68**

2.3 HE 染色結(jié)果

HE 染色顯示，假手術(shù)組大鼠膀胱頸組織層次清晰，排列整齊緊密，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分區(qū)域有水腫改變；模型組膀胱頸組織中可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)、彈性纖維減少，肌層可見(jiàn)肌纖維增粗、平滑肌壁增厚，詳見(jiàn)圖1。假手術(shù)組大鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，未見(jiàn)壞死神經(jīng)元；模型組脊髓組織結(jié)構(gòu)破壞、排列紊亂，有神經(jīng)元崩解現(xiàn)象，壞死后空洞增多，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生，詳見(jiàn)圖2。

圖1 各組大鼠膀胱頸組織病理形態(tài)學(xué)比較（HE 染色）

圖2 各組大鼠T10～L2 脊髓組織病理形態(tài)學(xué)比較（HE 染色）

2.4 脊髓的TMT 定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析

采用TMT 定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)共檢測(cè)到47 947個(gè)多肽，6684 個(gè)蛋白質(zhì)，其中有3439 個(gè)可量化的蛋白質(zhì)。 根據(jù)fc＞1.2 或fc＜1/1.2、P＜0.05、unique peptide≥2 篩選出模型組與假手術(shù)組中T10～L2 脊髓組織的151 個(gè)DEPs，其中84 個(gè)表達(dá)升高、67 個(gè)表達(dá)下降，詳見(jiàn)圖3A。聚類分析直觀地展示了DEPs 在假手術(shù)組和模型組之間的表達(dá)，詳見(jiàn)圖3B。

圖3 151 個(gè)差異蛋白表達(dá)譜的火山圖（A）和聚類分析結(jié)果圖（B）

2.5 DEPs 的生物信息分析

2.5.1 DEPs 的KEGG 分析 使用KOBAS 3.0 對(duì)151 個(gè)DEPs 行KEGG 通路富集分析，設(shè)置P＜0.01共篩選出前16 條KEGG 通路：肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、趨化因子信號(hào)通路、NOD-樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡、多巴胺能神經(jīng)突觸和谷氨酸能突觸等。 詳見(jiàn)圖4、表2。

表2 151 個(gè)DEPs 的KEGG 通路分析結(jié)果

圖4 151 個(gè)DEPs 的KEGG 通路分析結(jié)果

2.5.2 DEPs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選 采用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)合Cytoscape 軟件構(gòu)建151 個(gè)DEPs 的PPI 圖。圖中每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)DEPs，去除無(wú)相互作用的DEPs，PPI 圖中共有108 個(gè)節(jié)點(diǎn)和332 條邊，詳見(jiàn)圖5。 使用cytoHubba 插件根據(jù)DEPs的Degree 值篩選出前35 位的關(guān)鍵DEPs， 詳見(jiàn)圖6A、表3。使用ClueGO 對(duì)35 個(gè)關(guān)鍵DEPs 參與的生物過(guò)程進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)35 個(gè)關(guān)鍵DEPs 主要參與了突觸修剪、樹(shù)突細(xì)胞分化、5-羥色胺運(yùn)輸、巨噬細(xì)胞活化、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活、小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、神經(jīng)炎癥反應(yīng)和活性氧代謝過(guò)程的正調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程，詳見(jiàn)圖6B。

圖6 35 個(gè)關(guān)鍵DEPs 的PPI 圖（A）和參與的生物學(xué)過(guò)程（B）

表3 35 個(gè)關(guān)鍵DEPs 的具體信息

圖5 DEPs 的PPI 圖

3 討論

BND 是T10 及以上脊髓損傷后臨床干預(yù)的難點(diǎn)問(wèn)題[17]，其臨床最大的危害在于排尿時(shí)，由于交感神經(jīng)過(guò)度興奮，膀胱括約肌持續(xù)收縮，膀胱內(nèi)壓持續(xù)升高，最終造成尿液反流和腎功能損傷[18]。

由于T10～L2 脊髓節(jié)段在排尿過(guò)程中有重要作用，臨床上通常將其作為治療BND 的目標(biāo)靶位。因此，本研究團(tuán)隊(duì)制備了T10 脊髓節(jié)段橫斷性損傷后的BND 大鼠模型，選擇T10～L2 脊髓節(jié)段作為本研究的觀察對(duì)象。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠脊髓休克期過(guò)后BBB 評(píng)分為0 分；尿流動(dòng)力學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較假手術(shù)組相比，模型組大鼠MCC 和LPP 均增大（P＜0.01）；HE 染色結(jié)果顯示，模型組大鼠T10～L2 脊髓組織有神經(jīng)元崩解現(xiàn)象、壞死后空洞增多、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生，模型組大鼠膀胱頸組織大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)、彈性纖維減少，肌層可見(jiàn)肌纖維增粗、平滑肌壁增厚。 以上結(jié)果提示，通過(guò)橫斷T10 脊髓節(jié)段能夠形成BND 大鼠模型。

利用TMT 定量標(biāo)記技術(shù)篩選出模型組/假手術(shù)組的151 個(gè)DEPs，通過(guò)KEGG 分析挖掘出151 個(gè)DEPs 之間潛在的相互作用關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)富集到的KEGG 通路主要參與了炎癥反應(yīng)（趨化因子信號(hào)通路和NOD-樣受體信號(hào)通路）、凋亡（細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡）和突觸傳遞（多巴胺能突觸和谷氨酸能突觸）。 利用Cytoscape 及其插件對(duì)151 個(gè)DEPs 進(jìn)行可視化分析，篩選出了Lgals3、Apoe、Dhcr24、Snca 等35 個(gè)關(guān)鍵DEPs，利用ClueGO 對(duì)35 個(gè)DEPs 參與的生物過(guò)程進(jìn)行注釋來(lái)展示單個(gè)DEPs 的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)35 個(gè)DEPs 主要參與了突觸修剪、5-羥色胺運(yùn)輸、巨噬細(xì)胞活化、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活等生物過(guò)程。

脊髓損傷后周圍炎細(xì)胞的浸潤(rùn)、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活是引起脊髓繼發(fā)性損傷的主要原因之一[19]。其中，被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放多種氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)因子、趨化因子和炎癥介質(zhì)從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[20]。有研究表明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥會(huì)使神經(jīng)組織損傷進(jìn)一步加重，從而引起神經(jīng)元損傷和脫髓鞘等病理改變[21]。 目前，針對(duì)炎癥反應(yīng)治療繼發(fā)性脊髓損傷，主要通過(guò)靶向CD11d/CD18 或α4β1 整合素的抗體來(lái)減少小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的活化，最終減少脊髓組織的炎性損傷[20]。 本研究中對(duì)151 個(gè)DEPs 進(jìn)行KEGG 分析，發(fā)現(xiàn)趨化因子信號(hào)通路和NOD-樣受體信號(hào)通路等炎癥相關(guān)途徑顯著富集。 此外，35 個(gè)關(guān)鍵DEPs 的生物過(guò)程分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C1qa、Clu、Snca 主要參與了巨噬細(xì)胞活化、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活和小膠質(zhì)細(xì)胞激活等生物過(guò)程。 因此，本次生物信息分析富集到的C1qa、Clu 和Snca可能是抑制脊髓炎性損傷的潛在治療靶點(diǎn)。

此外，本次KEGG 分析富集到了細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡兩條信號(hào)通路。 151 個(gè)DEPs 中Pycard、Glul、Capn1 參與了細(xì)胞壞死通路，其中：Pycard 泛素化可以促進(jìn)白細(xì)胞介素-1β 活化，加重組織的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死和凋亡[22]；Glul 編碼的谷氨酰胺合成酶活性的升高會(huì)增加活性氧（reactive oxygen species, ROS）的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞壞死[23]；Capn1 通過(guò)激活半胱天冬酶-3 觸發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞壞死和凋亡[24]。 此外，151 個(gè)DEPs 中Ctsz 和Ctsd參與了細(xì)胞凋亡途徑，Ctsz 和Ctsd 編碼的溶酶體半胱氨酸蛋白酶家族可通過(guò)降解BCL-2 蛋白從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過(guò)程[25]。 細(xì)胞壞死和凋亡是脊髓繼發(fā)性損傷的重要原因[26]，因此，從抑制細(xì)胞壞死和凋亡的角度出發(fā)尋找潛在靶點(diǎn)是減輕脊髓繼發(fā)性損傷的治療思路之一。

在T10～L2 脊髓組織的KEGG 分析結(jié)果中，多巴胺能突觸和谷氨酸能突觸兩條信號(hào)通路顯著富集。 多巴胺（dopamine, DA）和谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見(jiàn)的神經(jīng)遞質(zhì)， 二者在控制膀胱的排尿過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[27-28]。 研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓中存在能產(chǎn)生內(nèi)源性DA 的多巴胺能神經(jīng)元，在T10 脊髓完全橫斷后，脊髓中的多巴胺能神經(jīng)元合成DA 的能力增強(qiáng)，脊髓中依然能夠檢測(cè)到內(nèi)源性DA[29]。 已有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)鞘內(nèi)注射DA 信號(hào)藥物可以改善脊髓損傷后逼尿肌-外括約肌協(xié)同失調(diào)型膀胱的排尿功能[30]，而脊髓交感神經(jīng)中樞中的DA 可以調(diào)節(jié)膀胱頸的功能[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，參與多巴胺能突觸通路中的Comt 在模型組脊髓中顯著升高，Ddc 顯著降低。 研究表明，Comt 具有降解DA 的功能[32]，Ddc能加速DA 的合成[33]。 因此，多巴胺能突觸以及參與該條信號(hào)通路的Ddc 和Comt 可能是治療脊髓損傷后BND 的潛在治療靶點(diǎn)。

谷氨酸是影響膀胱排尿的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其通過(guò)與突觸后膜上的谷氨酸受體結(jié)合促進(jìn)排尿反射[34]。已有研究表明，腰骶脊髓節(jié)段副交感神經(jīng)區(qū)的谷氨酸可激活膀胱逼尿肌從而促進(jìn)膀胱排尿，目前，谷氨酸受體拮抗劑類藥物已運(yùn)用于膀胱逼尿肌過(guò)度活動(dòng)的治療中[35]。有研究發(fā)現(xiàn)，胸段脊髓交感神經(jīng)區(qū)仍然有谷氨酸能突觸[36]，在谷氨酸能突觸中，Gng4 可抑制突觸前膜釋放谷氨酸，從而降低突觸間隙的谷氨酸濃度[37]，而Homer1 有助于突觸后膜上的代謝型谷氨酸受體與鈣離子示釋放偶聯(lián)，從而發(fā)揮谷氨酸能突觸作用[38]。 本次實(shí)驗(yàn)的KEGG 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，谷氨酸能突觸顯著富集，此外151 個(gè)DEPs中，Homer1、Gng4 參與了該信號(hào)通路，相比于假手術(shù)組，模型組脊髓組織中Homer1 和Gng4 的表達(dá)顯著下降。 這說(shuō)明在T10 脊髓損傷后，由于Gng4 表達(dá)下降，T10～L2 脊髓組織中谷氨酸的釋放增加，但由于Homer1 的表達(dá)明顯下降，導(dǎo)致谷氨酸能突觸不能發(fā)揮正常的生物學(xué)作用，這可能是T10脊髓損傷后出現(xiàn)下尿路功能障礙的原因之一。 目前，對(duì)于交感神經(jīng)中的谷氨酸能突觸是否能對(duì)膀胱頸的活動(dòng)產(chǎn)生作用尚未有報(bào)道，因此從谷氨酸能突觸的角度展開(kāi)進(jìn)一步研究對(duì)治療T10 脊髓損傷后BND 是有意義的。

綜上所述，C1qa、Clu、Snca、Pycard、Glul、Capn1、Ctsz 和Ctsd 可能是減輕T10 脊髓損傷后T10～L2 脊髓組織的炎癥反應(yīng)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、降低脊髓繼發(fā)性損傷風(fēng)險(xiǎn)的潛在治療靶點(diǎn)；脊髓組織中DA 和谷氨酸的含量及相關(guān)受體的活性也可能是治療T10 脊髓損傷后BND 的新思路。 本研究通過(guò)TMT 定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出了T10 脊髓節(jié)段損傷后T10～L2 脊髓組織的DEPs，然而并未對(duì)篩選出的潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。 接下來(lái)，將會(huì)對(duì)篩選出來(lái)的DEPs展開(kāi)驗(yàn)證工作，進(jìn)一步探討這些潛在靶點(diǎn)對(duì)T10～L2 脊髓組織及脊髓損傷后BND 起到的治療作用。