王哲，張敬，吳仁通，張潮，陳懷安，苗文隆

膀胱癌(bladder cancer，BC)是我國常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，男性發(fā)病率是女性的3～4倍，大部分患者只能通過藥物治療來緩解病情[1-2]。因此，明確BC的發(fā)展機(jī)制、尋找有效的分子靶點(diǎn)和診斷標(biāo)志物是BC臨床治療的關(guān)鍵。微小RNA(miR)-489-3p已被證實(shí)參與調(diào)控BC等腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡[3-4]。在冠心病內(nèi)皮細(xì)胞中，抑制miR-26a-5p表達(dá)可靶向第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)正調(diào)控磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路促進(jìn)其細(xì)胞凋亡[5]。然而，miR-489-3p是否通過調(diào)控PTEN影響B(tài)C的增殖、凋亡、侵襲仍不清楚。因此，本研究將通過癌癥基因組圖譜(TCGA-BLCA)數(shù)據(jù)庫分析BC中差異表達(dá)的miRNA，并探討miR-489-3p與BC臨床病理特征的關(guān)系及其在BC細(xì)胞中的功能和潛在的分子機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 組織和細(xì)胞來源 收集2018年6月—2021年7月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科110例BC患者手術(shù)切取的癌組織及其癌旁組織，于-80℃冰箱冷凍保存，并收集BC患者的臨床病理資料。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(K2021095)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書，且術(shù)前均未進(jìn)行放療或化療。人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1及人膀胱癌細(xì)胞系5637、J82、T24購自南京科佰生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器 (1)試藥、試劑：RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清，購自美國HyClone公司；胰蛋白酶、Trizol、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、噻唑藍(lán)(MTT)試劑、Transwell小室，均購自美國Invitrogen公司；PTEN、PI3K、Akt抗體及相應(yīng)二抗，購自美國CST公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自上海賽默飛公司；SYBR premix Ex Taq PCR試劑盒，購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司；Annexin-V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒，購自上海翌圣生物科技有限公司；miR-489-3p模擬物(miR-489-3p mimics)、miR-489-3p抑制物(anti-miR-489-3p)和陰性對照miR-NC、PTEN過表達(dá)重組載體(pc-PTEN)和空載體pcDNA，購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。(2)儀器、設(shè)備：StepOneTMPCR儀購自美國Thermo Fisher公司，Herocell 180 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自上海潤度生物科技有限公司，PowerPacTM電泳儀、GelDoc Go凝膠成像系統(tǒng)、iMark酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司，DxFLEX流式細(xì)胞儀購自貝克曼庫爾特國際貿(mào)易(上海)有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 2021年1—7月進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。將人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1及人膀胱癌細(xì)胞系5637、J82、T24置于含有10%胎牛血清及青、鏈霉素混合液的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、CO2含量為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將miR-NC、miR-489-3p mimics、miR-489-3p mimics+pcDNA、miR-489-3p mimics+pc-PTEN分別轉(zhuǎn)染至生長狀態(tài)較好的T24細(xì)胞中，并記為：miR-NC組、miR-489-3p mimics組、miR-489-3p mimics+pcDNA組和miR-489-3p mimics+pc-PTEN組，另取常規(guī)培養(yǎng)的T24細(xì)胞作為對照組。48 h后收集各組T24細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 差異miRNA的篩選 下載TCGA-BLCA miRNA測序數(shù)據(jù)，應(yīng)用R軟件(3.6.3版本)中DESeq2包進(jìn)行差異分析，并使用ggplot2包繪制火山圖，藍(lán)色為低表達(dá)，紅色為高表達(dá)，篩選參數(shù)：LogFC>1且P<0.05。

1.5 觀測指標(biāo)與方法

1.5.1 miR-489-3p和PTEN mRNA水平檢測：采用Trizol法提取RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后根據(jù)SYBR premix Ex Taq PCR試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-489-3p和PTEN mRNA的相對表達(dá)量，以U6或GAPDH作為內(nèi)參基因。miR-489-3p引物序列：5’-GGGGTGACATCACATATAC-3’(正向)，5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’(反向)；U6引物序列：5’-CCTGCTTCGGCAGCACA-3’(正向)，5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(反向)；PTEN引物序列：5’-AAGACCATAACCCACCACAGC-3’(正向)，5’-ACCAGTTCGTCCCTTTCCAG-3’(反向)；GAPDH引物序列：5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTT-3’(正向)，5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’(反向)。

1.5.2 T24細(xì)胞增殖檢測：將轉(zhuǎn)染后的各組T24細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，接種至96孔細(xì)胞板上，培養(yǎng)至24、48、72 h時(shí)，分別加入MTT試劑(濃度為5 g/L)20 μl，4 h后利用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的光密度值(OD)。每組處理后的T24細(xì)胞(每孔1×103)置于10 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2周，最后用1%結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)細(xì)胞集落數(shù)(克隆數(shù)目)。

1.5.3 T24細(xì)胞侵襲檢測：Transwell法檢測細(xì)胞侵襲。將解凍后的基質(zhì)膠與不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基充分混合，然后平鋪在Transwell小室的上室，待其凝固后加入細(xì)胞懸液200 μl，下室中加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基600 μl，2 h后擦去未侵襲的細(xì)胞，采用多聚甲醛和結(jié)晶紫進(jìn)行固定和染色，20 min后在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)。染色的細(xì)胞即為發(fā)生侵襲的細(xì)胞。

1.5.4 T24細(xì)胞凋亡檢測：按照Annexin-V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明對轉(zhuǎn)染后的各組T24細(xì)胞進(jìn)行處理，并使用流式細(xì)胞儀檢測其細(xì)胞凋亡率。

1.5.5 T24細(xì)胞中PTEN、PI3K、Akt蛋白表達(dá)檢測：采用Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測T24細(xì)胞中蛋白表達(dá)。提取轉(zhuǎn)染后各組T24細(xì)胞的總蛋白，將定量后的蛋白樣品進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜，然后加入PTEN、PI3K、Akt抗體，4℃培養(yǎng)過夜，洗滌后加入相應(yīng)二抗，培養(yǎng)1 h，使用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測各組T24細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平。

1.5.6 T24細(xì)胞的相對熒光素酶活性：將miR-489-3p mimics與miR-NC分別與構(gòu)建好的WT-PTEN 3’UTR或MUT-PTEN 3’UTR載體質(zhì)粒利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至T24細(xì)胞中，共分成4組：miR-NC+WT-PTEN 3’UTR組、miR-489-3p mimics+WT-PTEN 3’UTR組、miR-NC+MUT-PTEN 3’UTR組和miR-489-3p mimics+MUT-PTEN 3’UTR組。培養(yǎng)48 h后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒測定各組T24細(xì)胞的相對熒光素酶活性。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-489-3p與PTEN的作用關(guān)系，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將miR-NC、miR-489-3p mimics、anti-miR-NC(抑制物陰性對照)、anti-miR-489-3p(抑制物)分別轉(zhuǎn)染至T24細(xì)胞中，并記為miR-NC組、miR-489-3p mimics組、anti-miR-NC組、anti-miR-489-3p組，48 h后收集各組細(xì)胞按照1.5.5的方法檢測PTEN蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 差異miRNA的篩選 通過火山圖分析TGCA數(shù)據(jù)庫中BC組織中差異miRNA，篩選到miR-489-3p在BC組織中顯著下調(diào)，見圖1。

圖1 火山圖分析BC組織中的差異miRNA

2.2 BC組織和細(xì)胞系中miR-489-3p和PTEN mRNA表達(dá)水平比較 與癌旁組織比較，BC癌組織中miR-489-3p相對表達(dá)量下降，PTEN mRNA相對表達(dá)量上升(P<0.01)；與SV-HUC-1細(xì)胞比較，5637、J82、T24細(xì)胞中miR-489-3p相對表達(dá)量降低，PTEN mRNA相對表達(dá)量升高(P<0.05)，見表1。其中，T24細(xì)胞中miR-489-3p相對表達(dá)量最低，PTEN mRNA相對表達(dá)量最高，故選擇T24細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

表1 BC組織及細(xì)胞系中miR-489-3p和PTEN mRNA表達(dá)水平比較

2.3 miR-489-3p表達(dá)在BC患者不同臨床病理特征中比較 根據(jù)miR-489-3p的相對表達(dá)量均值分為低表達(dá)組(≤0.36)70例和高表達(dá)組(>0.36)40例，miR-489-3p低表達(dá)組患者TNM分期T3～4、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤低分化比例高于高表達(dá)組(P<0.05)，而2組患者性別、年齡及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 不同臨床病理特征BC患者中miR-489-3p表達(dá)比較 [例(%)]

2.4 miR-489-3p和PTEN的靶向關(guān)系 生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果顯示，miR-489-3p和PTEN 3’UTR有互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，見圖2。miR-489-3p mimics+WT-PTEN 3’UTR組相對熒光素酶活性低于miR-NC+WT-PTEN 3’UTR組(P<0.05)；而與miR-NC+MUT-PTEN 3’UTR組比較，miR-489-3p mimics+MUT-PTEN 3’UTR組相對熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。另外，miR-489-3p mimics組PTEN蛋白表達(dá)水平低于miR-NC組，anti-miR-489-3p組PTEN蛋白表達(dá)水平高于anti-miR-NC組(P<0.05)，見圖3、表4。

圖2 miR-489-3p和PTEN的結(jié)合位點(diǎn)

注：A.miR-NC組；B.miR-489-3p mimics組；C.anti-miR-NC組；D.anti-miR-489-3p組

2.5 各組T24細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡及PI3K、Akt蛋白表達(dá)比較 與對照組、miR-NC組比較，miR-489-3p mimics組PTEN蛋白表達(dá)水平降低，OD值(24 h、48 h、72 h)下降，克隆數(shù)目和細(xì)胞侵襲數(shù)減少，凋亡率和PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與miR-489-3p mimics組、miR-489-3p mimics+pcDNA組比較，miR-489-3p mimics+pc-PTEN組PTEN蛋白表達(dá)水平升高，OD值(24 h、48 h、72 h)增加，克隆數(shù)目和細(xì)胞侵襲數(shù)增多，凋亡率和PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4、圖5、表5、表6。

表3 各組相對熒光素酶活性比較

表4 各組PTEN蛋白表達(dá)比較

圖4 各組T24細(xì)胞侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)、凋亡情況比較

注：A.對照組；B.miR-NC組；C.miR-489-3p mimics組；D.miR-489-3p mimics+pcDNA組；E.miR-489-3p mimics+pc-PTEN組

表5 各組T24細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)及各時(shí)點(diǎn)OD值、克隆數(shù)目比較

表6 各組T24細(xì)胞侵襲數(shù)、凋亡率及PI3K、Akt蛋白表達(dá)比較

3 討 論

外科手術(shù)是治療BC的主要方法，但由于其術(shù)后復(fù)發(fā)率高，患者的生存率仍然較低[6]。因此，探究新的靶向藥物是BC臨床治療的重中之重。

國內(nèi)外研究表明，miRNA與腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡等聯(lián)系密切，可作為腫瘤早期診斷或預(yù)后標(biāo)志物[7-8]，也可通過與靶基因結(jié)合發(fā)揮抑癌或抗癌作用[9-11]。本研究首先通過火山圖分析TGCA數(shù)據(jù)庫BC組織中差異miRNA，進(jìn)而篩選到顯著下調(diào)的miR-489-3p。以往研究表明，miR-489-3p通過調(diào)控不同靶點(diǎn)抑制胰腺癌、膠質(zhì)瘤、骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)展[12-14]，但是miR-489-3p在BC中的研究極少。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-489-3p在BC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)降低，與Li等[15]的研究結(jié)果一致。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-489-3p低表達(dá)與BC患者的臨床分級明顯相關(guān)，說明miR-489-3p可能作為抑癌因子在BC中起作用。由于T24細(xì)胞中miR-489-3p相對表達(dá)量最低，因此選擇T24細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-489-3p過表達(dá)抑制了T24細(xì)胞增殖和侵襲并誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，這與miR-489-3p在其他癌細(xì)胞中的作用一致，進(jìn)一步揭示了miR-489-3p在BC中的抗癌功能。然而，miR-489-3p調(diào)控BC細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制還不清楚，需進(jìn)行更深一步的研究。

本研究通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測得知PTEN是miR-489-3p的潛在靶基因，并證實(shí)了miR-489-3p靶向負(fù)調(diào)控PTEN表達(dá)。PTEN是10q23.3染色體上的一種抑癌基因，具有雙重磷酸酶特性[16]。研究顯示，PTEN參與癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移等過程[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在BC組織和細(xì)胞中上調(diào)，與Man等[19]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示PTEN在BC中發(fā)揮促癌作用。此外，本研究還表明同時(shí)過表達(dá)miR-489-3p和PTEN后促進(jìn)了T24細(xì)胞增殖和侵襲，阻礙了細(xì)胞凋亡，揭示miR-489-3p靶向PTEN調(diào)控BC細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡。

最近的研究顯示，PTEN能夠通過調(diào)控PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展[20]。在BC細(xì)胞中，PTEN的激活可抑制PI3K、Akt蛋白表達(dá)[21]。大量文獻(xiàn)表明，PI3K/Akt通路參與調(diào)控BC在內(nèi)的各種類型癌細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲，且PTEN與該通路呈負(fù)向調(diào)控的關(guān)系[21-24]。本研究也顯示，miR-489-3p過表達(dá)可提高PI3K、Akt蛋白表達(dá)，而過表達(dá)PTEN能夠逆轉(zhuǎn)上述蛋白表達(dá)水平及miR-489-3p過表達(dá)對T24細(xì)胞增殖、侵襲的阻滯和對凋亡的增強(qiáng)作用。說明miR-489-3p通過靶向抑制PTEN表達(dá)，激活PI3K/Akt信號通路，調(diào)控BC細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲。

綜上所述，miR-489-3p抑制BC細(xì)胞的增殖和侵襲、促進(jìn)凋亡，其機(jī)制可能與靶向下調(diào)PTEN蛋白表達(dá)，激活PI3K/Akt信號通路有關(guān)。miR-489-3p可能作為分子標(biāo)志物，為BC提供新的靶向治療思路。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

王哲：研究構(gòu)思，論文撰寫；張敬：課題設(shè)計(jì)；吳仁通：數(shù)據(jù)獲取；張潮：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；陳懷安：修改論文；苗文隆：論文終審