張莉，王亮，王俊，程艷榮，王琳

全世界甲狀腺癌每年新發(fā)約56.7萬例，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。甲狀腺癌根據(jù)腫瘤分化程度可分為分化型和未分化型，除未分化癌和髓樣癌預(yù)后較差外，乳頭狀癌、濾泡狀癌患者預(yù)后較好，5年生存率可超過90%[2]。目前甲狀腺癌的治療以手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后促甲狀腺激素抑制治療為主。但部分患者確診時腫瘤已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)[3]。微加工處理器復(fù)合子亞單位8(microprocessor complex subunit 8，DGCR8)是基因編碼微處理器復(fù)合體的一個亞基，介導(dǎo)初級微小RNA(microRNA，miRNA)的轉(zhuǎn)錄，編碼蛋白是雙鏈RNA結(jié)合蛋白，作為微處理器復(fù)合體的非催化亞基發(fā)揮作用[4]。近年來發(fā)現(xiàn)，DGCR8表達(dá)上調(diào)參與了乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤的疾病過程，參與促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[5-6]。核糖核酸酶(DICER1)又稱DCR1,該基因編碼蛋白具有 RNA 解旋酶基序，發(fā)揮核糖核酸酶的作用[7]。研究表明，DICER1基因在肉瘤、內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤中異常表達(dá)，下游微小RNA表達(dá)失常，細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)基因調(diào)控失常，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8-9]。本研究通過檢測甲狀腺癌組織中DGCR8、DICER1基因表達(dá)，探討兩者在甲狀腺癌中的臨床意義，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月—2017年1月西北大學(xué)附屬西安高新醫(yī)院內(nèi)分泌科經(jīng)手術(shù)治療的甲狀腺癌患者90例為研究對象。男25例，女65例，年齡32～67(48.3±5.7)歲；腫瘤直徑：≤2 cm者52例，>2 cm者38例；病理類型：乳頭狀癌70例，濾泡狀癌20例；AJCC分期：Ⅰ～Ⅱ期51例，Ⅲ～Ⅳ期39例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移64例；均無家族遺傳史，高血壓史18例，糖尿病史11例，吸煙史20例，飲酒史21例。本研究符合赫爾辛基宣言原則，醫(yī)院倫理委員會審核通過(2014-022)，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查明確為甲狀腺癌；②首次確診；③手術(shù)前患者無放、化療治療病史；④患者精神狀況良好，能配合檢查和隨訪。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期或哺乳期婦女；②臨床病理資料不完整；③同時伴有其他惡性腫瘤。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 DGCR8、DICER1基因表達(dá)：留取術(shù)中新鮮獲取(離體30 min內(nèi))的甲狀腺癌組織和癌旁組織(距癌灶邊緣>5 cm)，迅速放入無RNA酶的凍存管中，液氮中凍存，實(shí)驗(yàn)室-20℃保存。應(yīng)用Trizol法提取甲狀腺癌組織和癌旁組織總RNA，紫外分光光度法檢測RNA純度，OD260/280比值介于1.9～2.1。然后將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用熒光定量PCR對組織中DGCR8、DICER1 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(儀器為ABI7500，購自美國ABI公司)。DGCR8上游引物引物為：5’-GCAGAGGTAATGGACGTTGG-3’，下游引物引物為：5’-AGAGAAGCTCCGTAGAAGTTGAA-3’；DICER1上游引物為：5’- GAGCTGTCCTATCAGATCAGGG-3’，下游引物為：5’- ACTTGTTGAGCAACCTGGTTT-3’；內(nèi)參GAPDH上游引物為：5’-GCCTCCTCATAGACCCGAACT-3’，下游引物為：5’-CGGTAAAGCTCACGCTAATCTT-3’。引物由北京華大公司合成。熒光定量PCR試劑盒購自日本TAKARA公司。熒光定量PCR總體系為20 μl： SYBR Green preMix 10 μl，引物2 μl，Rox Ⅱ 0.4 μl，cDNA 1 μl ，蒸餾水6.6 μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，循環(huán)40次。DGCR8、DICER1基因表達(dá)水平采用2-△△CT表示。分別以癌組織中DGCR8、DICER1表達(dá)水平的平均數(shù)(2.133、0.832)為臨界值，分為DGCR8高表達(dá)組48例和低表達(dá)組42例；DICER1高表達(dá)組44例和低表達(dá)組46例。

1.3.2 隨訪：用電話或門診復(fù)查方式對患者進(jìn)行隨訪，術(shù)后第1年每2個月隨訪1次，1年后每3個月隨訪1次，隨訪內(nèi)容包括腫瘤復(fù)發(fā)進(jìn)展情況。隨訪截至2020年1月，隨訪終點(diǎn)為患者出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展死亡或隨訪時間結(jié)束。

2 結(jié) 果

2.1 甲狀腺癌組織和癌旁組織DGCR8、DICER1基因表達(dá)比較 甲狀腺癌組織中DGCR8、DICER1的相對表達(dá)量分別為(2.133±0.552)、(0.832±0.251)，癌旁組織分別為(0.561±0.114)、(1.769±0.536)，甲狀腺癌組織中DGCR8相對表達(dá)量明顯高于癌旁組織，DICER1相對表達(dá)量明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/P=26.458/<0.001、15.019<0.001)。

2.2 DGCR8、DICER1在不同臨床病理特征中表達(dá)比較 AJCC分期Ⅲ～Ⅳ期的甲狀腺癌患者病灶組織中DGCR8表達(dá)水平高于Ⅰ～Ⅱ期，DICER1表達(dá)水平低于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.01)；不同性別、年齡、腫瘤直徑、病理類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甲狀腺癌患者病灶組織中DGCR8、DICER1表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 甲狀腺癌組織中DGCR8、DICER1基因表達(dá)水平在不同臨床病理特征中比較

2.3 甲狀腺癌組織中DGCR8與DICER1基因表達(dá)相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，甲狀腺癌組織中DGCR8與DICER1的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.662，P<0.001)。

2.4 DGCR8、DICER1基因表達(dá)與甲狀腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系 90例患者隨訪過程中無失訪，3年復(fù)發(fā)率為44.4%(40/90)。DGCR8高表達(dá)患者3年復(fù)發(fā)率62.5%(30/48)，明顯高于DGCR8低表達(dá)的23.8%(10/42)(χ2=13.580，P<0.001)；DICER1低表達(dá)患者3年復(fù)發(fā)率72.7%(32/44)，明顯高于DICER1高表達(dá)的17.4%(8/46)(χ2=27.889，P<0.001)。

DGCR8高表達(dá)患者無瘤中位生存時間為29.63個月(95%CI28.14～30.21)，短于DGCR8低表達(dá)患者的32.83個月(95%CI30.85～34.12)(Z=3.425,P<0.001)；DICER1低表達(dá)患者為28.87個月(95%CI27.32～31.41)，短于DICER1高表達(dá)患者的33.12個月(95%CI29.34～34.78)(Z=3.589,P<0.001)。

2.5 影響甲狀腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的多因素COX回歸分析 以甲狀腺癌患者隨訪過程中的疾病復(fù)發(fā)情況為因變量(1=復(fù)發(fā)，0=無復(fù)發(fā))，納入腫瘤AJCC分期(0=Ⅰ～Ⅱ期，1=Ⅲ～Ⅳ期)、DGCR8(1=高表達(dá)，0=低表達(dá))、DICER1(1=低表達(dá)，0=高表達(dá))為自變量。多因素COX回歸分析結(jié)果顯示，癌組織中DGCR8高表達(dá)、DICER1低表達(dá)、腫瘤AJCC分期Ⅲ～Ⅳ期是影響甲狀腺癌患者復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素，見表2。

表2 多因素COX回歸分析影響甲狀腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的因素

3 討 論

甲狀腺癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢，以每年4%的速度增長[10]。乳頭狀和濾泡狀甲狀腺癌分化程度較好，惡性程度相對低，屬于低風(fēng)險腫瘤，5年生存率超過90%，對病死率影響很小[11]。然而，腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率仍然不可忽略，往往需通過反復(fù)手術(shù)治療，給患者造成嚴(yán)重的心身健康損傷[12]。因此，尋找有效的分子標(biāo)志物，用于甲狀腺癌早期診斷、評估疾病復(fù)發(fā)進(jìn)展，具有重要臨床價值。

MiRNAs是內(nèi)源性表達(dá)的非編碼 RNA，長度為18～25個核苷酸，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在結(jié)合酶等輔助作用下，不僅參與正常細(xì)胞的增殖、分化、衰老等生理學(xué)過程，還參與感染免疫、心血管疾病、惡性腫瘤等病理過程的發(fā)生發(fā)展[13]。DGCR8基因位于22q11.21。研究表明，在細(xì)胞核中，由RNase Drosha及其結(jié)合配體DGCR8組成的微處理器復(fù)合體切割miRNA的初級轉(zhuǎn)錄本，生成miRNA 前體[14]。miRNA前體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)后，被RNA酶DICER1切割，最終形成成熟的miRNA。近年來發(fā)現(xiàn)，在人類前列腺癌等多種腫瘤中均存在DGCR8異常表達(dá)的現(xiàn)象，并促進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)展[15]。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌組織中DGCR8表達(dá)上調(diào)，提示DGCR8表達(dá)上調(diào)可能參與甲狀腺癌的發(fā)病過程。研究顯示，腫瘤中DGCR8的表達(dá)受到長鏈非編碼RNA如LncRNA TUG1的表達(dá)調(diào)控，LncRNA TUG1通過誘導(dǎo)DGCR8的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，進(jìn)而促進(jìn)甲狀腺癌發(fā)生[6]。目前臨床上主要根據(jù)患者年齡、腫瘤分化程度、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等綜合判斷預(yù)測患者預(yù)后。本研究顯示，甲狀腺癌組織中DGCR8表達(dá)與腫瘤分期有關(guān)，提示DGCR8參與促進(jìn)甲狀腺癌疾病進(jìn)展。研究表明，DGCR8和ZFAT反義RNA 1以PRC2復(fù)合物依賴性方式促進(jìn)尾端型同源框2轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲并抑制細(xì)胞凋亡[16]。此外，腫瘤中DGCR8的過度表達(dá)能夠通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子β的表達(dá)，轉(zhuǎn)化生長因子β通過激活下游細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及信號蛋白SMAD2/3的磷酸化，促進(jìn)腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移[5]。本研究中，DGCR8高表達(dá)患者3年復(fù)發(fā)率較高并且無瘤中位生存時間較短，表明DGCR8是一種能夠判斷甲狀腺癌患者預(yù)后的分子指標(biāo)。臨床醫(yī)師可根據(jù)癌組織中DGCR8的表達(dá)情況，對甲狀腺癌患者的復(fù)發(fā)情況進(jìn)行預(yù)測，對于高危復(fù)發(fā)患者應(yīng)積極予以相應(yīng)診治，降低腫瘤復(fù)發(fā)的發(fā)生率。

DICER1編碼基因位于14q32.13，該基因編碼蛋白質(zhì)氨基末端有DEXH盒，羧基末端含有RNA解旋酶基序。DICER1作為一種核糖核酸酶，參與miRNA的合成，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。近年來發(fā)現(xiàn)，腫瘤中存在DICER1基因失活性突變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，對于DICER1基因突變的人群，腫瘤易感性較高[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌中DICER1表達(dá)水平下調(diào)，提示甲狀腺癌中DICER1可能發(fā)揮腫瘤抑制的功能。Ramírez等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-146b-5p 通過靶向DICER1 mRNA并降低DICER1的表達(dá)，減弱DICER1的miRNA生物合成能力，促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞的侵襲性表型。此外，甲狀腺癌中DICER1表達(dá)的下調(diào)可能與轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子GABPA能夠結(jié)合到DICER1的啟動子區(qū)域，促進(jìn)DICER1的表達(dá)，當(dāng)腫瘤發(fā)生時，由于GABPA表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致DICER1的表達(dá)明顯受到抑制[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌中DICER1的表達(dá)降低與腫瘤AJCC分期密切相關(guān)，提示DICER1的低表達(dá)參與促進(jìn)甲狀腺癌的進(jìn)展過程。研究表明，DICER1的表達(dá)缺失導(dǎo)致其下游具有促癌作用的微小RNA,如miR-146b-5p等表達(dá)顯著上調(diào)，導(dǎo)致下游上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及絲裂原活化的蛋白激酶顯著激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的惡性生物學(xué)行為，導(dǎo)致腫瘤的惡性進(jìn)展[18，20]。本研究亦證實(shí)，DICER1低表達(dá)的甲狀腺癌患者術(shù)后易發(fā)生復(fù)發(fā)，是甲狀腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素。既往研究亦表明，伴有DICER1基因的胚系突變的人群甲狀腺癌、Wilms瘤等的發(fā)生率及復(fù)發(fā)率顯著升高，對于DICER1基因表達(dá)失調(diào)的高危腫瘤患者，臨床建議密切隨訪，并予以術(shù)后輔助治療，減少腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)進(jìn)展的發(fā)生[21-22]。因此，甲狀腺癌中DICER1作為一種抑癌基因，發(fā)揮抑制腫瘤的功能，是一種新的評估甲狀腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的腫瘤標(biāo)志物。此外，本研究中DGCR8與DICER1的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，DGCR8在細(xì)胞核中參與構(gòu)成微處理器復(fù)合體，合成miRNA前體，而在敲低DGCR8表達(dá)后，位于細(xì)胞質(zhì)中的下游分子DICER1表達(dá)升高[23]，但兩者在甲狀腺癌中的具體作用機(jī)制尚不清楚，值得深入研究。

綜上所述，DGCR8表達(dá)上調(diào)，DICER1表達(dá)下調(diào)參與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，兩者表達(dá)與甲狀腺癌AJCC分期密切相關(guān)，是影響甲狀腺癌患者腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素。但本研究為單中心回顧性研究，病例數(shù)較少，可能存在一定的偏倚，尚需前瞻性臨床隊(duì)列研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

張莉：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；王亮：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核;王俊：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改;程艷榮：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;王琳：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫