★ 馬梅芳 侯惺 李凡 趙林濤 李芳（.棗莊市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 山東 棗莊 770；.棗莊市立醫(yī)院 山東 棗莊 7700；.陜西省中醫(yī)藥研究院 西安 70068）

蛋白質(zhì)分子是體現(xiàn)生命活動(dòng)的特征性物質(zhì)，在不同的生物種屬間存在差異，受遺傳基因的控制，具有遺傳的穩(wěn)定性［1］。日本學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的譜帶序列具有生物種的特征，并在生物的分類學(xué)研究中，成功地應(yīng)用了蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)［2］。蛋白質(zhì)分子分為同工酶和貯藏蛋白兩大類，不同蛋白質(zhì)分子的分子量大小、電荷數(shù)目、電荷極性以及空間結(jié)構(gòu)都具有差異，是進(jìn)行電泳分離的基礎(chǔ)。中藥體內(nèi)的同工酶、貯藏蛋白等大分子物質(zhì)攜帶有各種遺傳性信息，中藥品種的遺傳特性，可以直接或間接通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳的檢測(cè)結(jié)果反映出來(lái)，利用這種生物學(xué)方面的差異，可將蛋白質(zhì)電泳技術(shù)用于中藥物種的鑒定。

自上世紀(jì)80年代初，石俊英教授等率先將電泳技術(shù)引入到中藥的鑒別研究中，與現(xiàn)代生物技術(shù)的結(jié)合與運(yùn)用，為傳統(tǒng)中藥學(xué)科的發(fā)展注入新的活力，中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)手段和技術(shù)也從手摸、眼看、鼻聞、口嘗等傳統(tǒng)的性狀控制逐漸發(fā)展到顯微鑒別、組織形態(tài)分析、細(xì)胞培養(yǎng)以及蛋白質(zhì)分子水平。在蛋白質(zhì)電泳原理的指導(dǎo)下，經(jīng)過(guò)研究人員大量的實(shí)驗(yàn)探索，建立了“中藥電泳鑒別法”這項(xiàng)新技術(shù)，并將之廣泛應(yīng)用于各類中藥的鑒別研究中［3-11］。近年來(lái)，“指紋圖譜”概念的提出，為中藥的研究指出新的方向，將蛋白質(zhì)電泳技術(shù)與“指紋圖譜”思路相結(jié)合，提出的“中藥電泳指紋圖譜”新理念，將中藥鑒別研究再一次提高到生物指紋圖譜水平，擺脫了蛋白質(zhì)之外的其它因素的干擾和制約，實(shí)現(xiàn)了中藥鑒定手段的跨越。本實(shí)驗(yàn)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法對(duì)南葶藶子、北葶藶子及其偽品的蛋白質(zhì)、同工酶進(jìn)行分析測(cè)試，繪制葶藶子的蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜，豐富和完善葶藶子的質(zhì)量控制研究?jī)?nèi)容。

1 儀器與試藥

電子天平(BS-224S型，德國(guó)賽多利斯公司)；穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀及電泳儀槽（DYY-Ⅲ型，DYY-Ⅲ28型，北京六一儀器廠）；高速冷凍離心機(jī)（LGR16-W型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；凝膠成像紫外分析儀（EDAS-290型，北京市新技術(shù)應(yīng)用研究所）；真空泵（AVP-7120型，梅瑞泰克科技）；真空干燥器（DZF6050型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；超聲提取器（JBT-QX500F型，濟(jì)寧金白特電子有限責(zé)任公司）；一次性注射器（江蘇正康醫(yī)療器械有限公司）；微量進(jìn)樣器（上海安亭微量進(jìn)樣器廠）。

四甲基乙二胺（TEMED）（天津大茂化學(xué)試劑有限公司）；過(guò)硫酸銨（天津博迪化工股份有限公司）；瓊脂（上海精細(xì)化工有限公司）；蔗糖（上海精細(xì)化工有限公司）；考馬斯亮藍(lán)（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 分離膠貯液、濃縮膠貯液、分離膠緩沖液（pH8.9）、濃縮膠緩沖液（pH6.7）、電泳緩沖液（pH8.3），按照《中國(guó)藥典》2015年版四部規(guī)定的方法新鮮配制。

山東威海9個(gè)2019年的葶藶子樣品，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)石俊英教授鑒定為十字花科植物獨(dú)行菜Lepidium apetalumWilld.的種子（北葶藶子，編號(hào)1~8）和十字花科植物播娘蒿Descurainiasophia（L.）Webb ex Prantl.的種子（南葶藶子，編號(hào)9）；山東威海3個(gè)2019年的葶藶子偽品，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)石俊英教授鑒定為十字花科植物薺 菜Capsella bursa-pastoris（L.）Medic.的 種 子（編號(hào)10）；十字花科植物喜山葶藶Draba oreadesL.的種子（編號(hào)11）；十字花科植物北美獨(dú)行菜Lepidium virginicumL. 的種子（編號(hào)12）。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

稱取樣品1.0 g，置冰浴研缽中，控制低溫研磨粉碎，加入pH8.9濃縮膠緩沖液（用前稀釋4倍）1 mL，超聲提取30 min（冰浴控制提取溫度），冷凍離心2 min（0 ℃，8 000 r/min），取上清液，與相同體積的蔗糖溶液（濃度40%）混勻，置4℃冰箱內(nèi)，備用。

2.2 電泳槽的安裝

為降低氧對(duì)聚丙烯酰胺聚合反應(yīng)的抑制作用，實(shí)驗(yàn)選擇垂直板電泳槽，電泳槽雙平板為封閉環(huán)境，灌膠后，除頂層部分凝膠外其他均與空氣隔絕，減少與氧的接觸。垂直板電泳槽樣式繁多，目前流行的是有機(jī)玻璃材質(zhì)的，呈方形或長(zhǎng)方形，由兩個(gè)半槽組成，在硅酮橡膠的夾套內(nèi)裝入兩塊玻璃即構(gòu)成凝膠模子，凝膠模子設(shè)計(jì)在兩個(gè)半槽之間，用來(lái)裝電極緩沖液的正負(fù)兩個(gè)槽在模子的兩側(cè)。

實(shí)驗(yàn)前玻璃板按照洗液或去污劑浸泡清洗、水沖洗、蒸餾水沖洗的順序處理干凈，直立干燥，注意已經(jīng)潔凈的玻璃板面不要被手接觸污染。安裝時(shí)，用雙手控制玻璃板的兩側(cè)邊緣部分，先把玻璃板裝入夾套，再整體放入兩個(gè)半槽之間（注意保持角度的垂直），先固定長(zhǎng)螺桿，再按照順序，擰緊各個(gè)螺絲（注意用力要均勻）。

安裝好電泳槽后，將瓊脂加熱熔化，緩緩倒入電泳儀底槽內(nèi)，凝結(jié)成約5 mm厚的瓊脂層封底。

2.3 凝膠的制備

按表1的比例配制3%濃縮膠液4 mL、7%分離膠液16 mL。將配好的2種膠液置真空干燥器內(nèi)抽真空處理10 min，以降低氧對(duì)聚合反應(yīng)的抑制作用。分離膠液，緩緩注入已安裝好的凝膠模子中，待膠液稍凝后，在表層覆蓋約1 mm厚的分離膠緩沖液，靜置1 h以上，液面分層后，用濾紙條吸凈水層。插上上樣槽模具，將濃縮膠注入凝膠模子中，靜置，待濃縮膠變?yōu)槿榘咨珪r(shí)，取出上樣槽模具。立即向電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液。

表1 電泳凝膠的配制

2.4 上樣與電泳

濃縮膠凝固后應(yīng)上樣，上樣量20 μL，在負(fù)極槽電極緩沖液中加入一滴溴酚藍(lán)指示劑用來(lái)示蹤，電泳開(kāi)始時(shí)電流保持15 mA，待樣品進(jìn)入分離膠后，調(diào)整電流至25 mA。待示蹤指示劑行至距瓊脂層約1 cm時(shí)，關(guān)閉電源，停止電泳。

2.5 染色與脫色

2.5.1 蛋白質(zhì)染色與保存 電泳結(jié)束后，取出膠板，標(biāo)記前沿。將凝膠板浸于考馬斯亮蘭染色液內(nèi)，在37 ℃染色1~2 h，至譜帶清晰。用蒸餾水洗去凝膠表面附著的染料，再浸于脫色液中脫色，直至譜帶背景清晰。保存于7%醋酸溶液中。

2.5.2 同工酶染色與保存 電泳結(jié)束后，取出膠板，標(biāo)記前沿。將膠板浸于醋酸聯(lián)苯胺染色液中，加30%雙氧水2~3滴，常溫下染色，很快出現(xiàn)藍(lán)色譜帶，不久譜帶變?yōu)樽丶t色，棄去染色液，凝膠板用蒸餾水沖洗后保存于7%的醋酸溶液中。

3 結(jié)果

3.1 蛋白質(zhì)及同工酶電泳結(jié)果

樣品蛋白質(zhì)電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，樣品同工酶電泳結(jié)果圖2。

圖1 樣品蛋白質(zhì)電泳圖譜

圖2 樣品同工酶電泳圖譜

3.2 電泳圖譜分析

通過(guò)“凝膠成像系統(tǒng)” （Image Analysis）將脫去底色的凝膠板掃描成PAGE圖譜，然后經(jīng)“Advanced American Biotechnology” (AAB)系統(tǒng)分析后即得到以各譜帶的光密度值（OD）為縱坐標(biāo)、譜帶泳動(dòng)距離（Pos）為橫坐標(biāo)的電泳圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 樣品蛋白質(zhì)電泳圖譜分析

圖4 樣品同工酶電泳圖譜分析

3.3 相似度分析

樣品蛋白質(zhì)電泳相似度分析結(jié)果見(jiàn)圖5，樣品同工酶電泳相似度分析結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖5 樣品蛋白質(zhì)電泳相似度分析圖

圖6 樣品同工酶電泳相似度分析圖

3.4 聚類分析

樣品蛋白質(zhì)電泳聚類分析結(jié)果見(jiàn)圖7，樣品同工酶電泳聚類分析結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖7 樣品蛋白質(zhì)電泳聚類分析圖

圖8 樣品同工酶電泳聚類分析圖

4 討論

（1）由葶藶子的蛋白質(zhì)電泳圖譜可知：相同產(chǎn)地、不同生長(zhǎng)環(huán)境的8個(gè)獨(dú)行菜種子樣品的蛋白質(zhì)電泳圖譜條帶無(wú)差異，說(shuō)明8個(gè)獨(dú)行菜種子樣品中存在相同種類的蛋白質(zhì)；獨(dú)行菜種子與播娘蒿種子、薺菜種子、喜山葶藶種子、北美獨(dú)行菜種子相比，則差異較大。由蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜相似度與聚類分析的結(jié)果可以看出：相同產(chǎn)地、不同生長(zhǎng)環(huán)境的獨(dú)行菜種子中含有的蛋白質(zhì)種類相同，含量近似。生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)獨(dú)行菜種子中蛋白質(zhì)種類無(wú)影響，對(duì)蛋白質(zhì)含量影響不大。獨(dú)行菜種子與播娘蒿種子、薺菜種子、喜山葶藶種子、北美獨(dú)行菜種子相比，蛋白質(zhì)種類與數(shù)量均有較大差異。

（2）由葶藶子的同工酶電泳圖譜可知：相同產(chǎn)地、不同生長(zhǎng)環(huán)境的8個(gè)獨(dú)行菜種子樣品的同工酶電泳譜帶位置相同，說(shuō)明8個(gè)獨(dú)行菜種子樣品中含有的相同種類的同工酶。由同工酶電泳指紋圖譜相似度與聚類分析的結(jié)果可以看出：相同產(chǎn)地、不同生長(zhǎng)環(huán)境的獨(dú)行菜種子中含有的同工酶種類相同，含量極為近似。獨(dú)行菜種子與北美獨(dú)行菜種子相比，同工酶種類與數(shù)量具有一定的相似性；獨(dú)行菜種子與播娘蒿種子、薺菜種子、喜山葶藶種子相比，同工酶種類與數(shù)量均有顯著性差異。

（3）蛋白質(zhì)分子普遍存在于植物細(xì)胞內(nèi)，是基因表達(dá)的產(chǎn)物，受遺傳基因的控制而不受地理位置、生長(zhǎng)環(huán)境、種植采收等眾多外界因素的影響，具有種的特異性和穩(wěn)定性。因此，不同的植物品種、雜交種會(huì)表現(xiàn)出不同的電泳譜帶模式，可以區(qū)分。獨(dú)行菜、北美獨(dú)行菜均來(lái)源于十字花科獨(dú)行菜屬，播娘蒿來(lái)源于十字花科播娘蒿屬，喜山葶藶來(lái)源于十字花科葶藶屬，薺菜來(lái)源于十字花科薺菜屬，其蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜的差異表明：蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜不僅可以用于不同科屬間正品、偽品的鑒別，而且可以解決同科同屬不同種間正品、偽品不易區(qū)分的難題。而同工酶指紋圖譜在品種的鑒定上更加準(zhǔn)確、穩(wěn)定，因?yàn)橥っ傅慕Y(jié)構(gòu)差異主要來(lái)源于基因差異，利用它可以鑒別諸多基因變異，如生物的類別、品種的地理分布、演化關(guān)系等［12］。8個(gè)獨(dú)行菜種子樣品的同工酶電泳譜帶位置相同，表明不同的生長(zhǎng)環(huán)境沒(méi)有引起獨(dú)行菜的品種退化。12個(gè)樣品同工酶電泳指紋圖譜相似度與聚類分析的結(jié)果提示：與播娘蒿、薺菜、喜山葶藶相比，北美獨(dú)行菜與獨(dú)行菜的親緣關(guān)系更近一些，此結(jié)果與植物分類學(xué)的研究一致。

（4）本實(shí)驗(yàn)建立了葶藶子的蛋白質(zhì)、同工酶電泳指紋圖譜，把聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果中各譜帶的位置、寬度及每條譜帶中蛋白質(zhì)、同工酶含量的大小都進(jìn)行了量化，進(jìn)一步增加了中藥電泳的準(zhǔn)確度。聚丙烯酰胺凝膠電泳具有分析靈敏度高、實(shí)驗(yàn)材料用量少、結(jié)果重現(xiàn)性好，分析過(guò)程受環(huán)境因素影響小，對(duì)樣品形態(tài)、來(lái)源適應(yīng)性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。針對(duì)目前葶藶子品種來(lái)源復(fù)雜多樣、內(nèi)在質(zhì)量難以評(píng)價(jià)、鑒定困難等難題，電泳技術(shù)的靈敏、準(zhǔn)確、分析效率高、速度快等優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。葶藶子蛋白質(zhì)、同工酶電泳指紋圖譜的建立，再次證明了以蛋白質(zhì)分子為標(biāo)示，從分子水平上進(jìn)行中藥的鑒定與質(zhì)量評(píng)價(jià)，是完全可行的。