趙 婷，馬文明

(山東省濰坊市人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科 261041)

腸道微生物群對于維持腸道免疫平衡和機(jī)體健康起著重要作用，腸道內(nèi)正常微生物群遭到破壞會引起腸道免疫系統(tǒng)的失衡[1]。益生菌制劑具有預(yù)防和治療消化道的疾病，因其能幫助機(jī)體維持正常的腸道微生物區(qū)系、產(chǎn)生抗炎因子、抑制病原菌群生長[1-2]。有研究結(jié)果表明，乳桿菌和雙歧桿菌對機(jī)體具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用[3]，可有效預(yù)防結(jié)腸癌、降低血清膽固醇水平等[4]，與人類健康密不可分。而如今臨床抗生素應(yīng)用欠規(guī)范、菌株耐藥嚴(yán)重，雙歧桿菌和乳桿菌的益生劑受到了學(xué)者們的廣泛關(guān)注[5]。乳雙歧桿菌V9(B.lactis V9)是自健康兒童腸道中分離出來的一株雙歧桿菌乳亞種[6]，干酪乳桿菌Zhang(L.casei Zhang)是2001年從內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒大草原牧民家制作的傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶(koumiss)中分離并篩選獲得的性能優(yōu)異的益生菌[7]，植物乳桿菌P-8(L.plantarum P-8)是從內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗草原上牧民家庭自然發(fā)酵酸牛乳樣品中分離篩選出的性能優(yōu)良的益生菌[3,8]。以上三類菌株均因其對人工胃液、腸液及膽鹽有良好的耐受性而成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)[9-10]。近年，有研究表明，益生菌的混合制劑具有更好的免疫調(diào)節(jié)作用[11-13]。本文重點(diǎn)是在動物實驗?zāi)Ｐ椭刑剿麟p歧乳桿菌三聯(lián)菌(B.lactis V9+L.casei Zhang+L.plantarum P-8三聯(lián)菌，簡稱BLL)凍干粉的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制，為BLL的研究開發(fā)和真實世界應(yīng)用提供臨床前實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)細(xì)胞系：YAC-1細(xì)胞、雞紅細(xì)胞購自上海源葉生物科技有限公司。(2)實驗動物：雄性C57BL/6J小鼠320只，體重18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[動物許可證號：SCXK(京)2019-0010]。按照實驗動物飼養(yǎng)要求進(jìn)行小鼠喂養(yǎng)，飼養(yǎng)員均具備實驗動物人員資格證。該研究內(nèi)容已獲本院倫理審查小組批準(zhǔn)(批號：SRSWLL-2021091802)。(3)實驗益生菌粉：B.lactis V9、L.casei Zhang、L.plantarum P-8菌粉，均為活菌數(shù)2 000億/克，購自金華銀河生物科技有限公司(批號分別為20210205001、20210108001、20210123001)。(4)試劑：基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)液和試劑盒等材料，如淋巴細(xì)胞分離液、0.4%臺盼藍(lán)溶液、Hank’s液、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、刀豆蛋白A(ConA)、NP40(0.1%)、Tris-HCl緩沖液(0.2 mol/L，pH=8.2)及印度墨汁，分別購自美國Gibco公司、北京索萊寶科技有限公司、Sigma公司和碧云天生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1實驗動物分組及給藥

分別稱取冷凍干燥保存的B.lactis V9、L.casei Zhang、L.plantarum P-8活菌粉，根據(jù)質(zhì)量比，以2∶1∶1的比例無菌雙蒸水進(jìn)行溶解(即50%B.lactis V9+25%L.casei Zhang+25%L.plantarum P-8)后備用。根據(jù)研究內(nèi)容，將320只小鼠隨機(jī)分為8個免疫組，每個免疫組40只，每個免疫組又分別設(shè)置對照組(雙蒸水灌胃，n=10)、BLL低劑量組(0.1 mg/kg，n=10)、中劑量組(0.2 mg/kg，n=10)、高劑量組(0.6 mg/kg，n=10)，均為每天0.1 mL/10 g灌胃給藥，連續(xù)給藥30 d后處死動物。本實驗嚴(yán)格遵循《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003版)中免疫力評價規(guī)范執(zhí)行和分析[14]。

1.2.2小鼠體重及免疫臟器指數(shù)的測定

常規(guī)飼養(yǎng)小鼠30 d，記錄實驗過程中的一般情況，包括每天觀察和記錄小鼠的一般情況、飲食情況和大小便情況等，給藥期間每周測體重1次。實驗結(jié)束(即給藥30 d)，尾靜脈抽取血液，放置4 ℃無菌容器保存?zhèn)溆?；然后頸椎脫臼處死所有實驗動物，立即行手術(shù)取出胸腺、脾臟等器官，稱重，分別計算和記錄胸腺/體重比值及脾臟/體重比值，置于4 ℃無菌容器保存和備用[15]。

1.2.3ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗

取4 ℃保存的無菌生理鹽水漂洗脾臟2次，將脾臟剪碎成0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm組織塊，取脾臟細(xì)胞并將細(xì)胞濃度調(diào)整為3×106個/mL混懸液，將吹打均勻的細(xì)胞液加入24孔培養(yǎng)板中，每孔約1.0 mL，培養(yǎng)24 h。然后，待細(xì)胞貼壁后，將BLL低、中、高劑量組脾臟細(xì)胞給予75 μL ConA/孔(終濃度為7.5 μg/mL)處理，對照組加無菌生理鹽水75 μL/孔處理，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。實驗結(jié)束前4 h棄上清液，每孔吸去多余上清液，同時加入同等量不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，加入 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)溶液(終濃度0.5 mg/mL)50 μL/孔，培育4 h。棄上清液，每孔加入酸性異丙醇1.0 mL，混均置室溫20 min。酶標(biāo)儀570 nm波長處讀取光密度(OD)值。最后，用實驗組(即給予ConA試驗孔)OD值減去對照組(即未予ConA實驗孔)OD值，記錄小鼠的淋巴細(xì)胞增殖數(shù)量[16]。

1.2.4二硝基氟苯(DNFB)誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(耳腫脹法)

充分暴露小鼠腹部后常規(guī)消毒，采用1% DNFB溶液分別在小鼠腹部和右耳均勻涂抹行致敏反應(yīng)檢測。設(shè)置左耳為對照組。敏感反應(yīng)測試24 h后處死動物，取雙耳片稱重，以雙耳重量之差表示遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)程度[17]。

1.2.5血清溶血素測定

常規(guī)比例(2%，v/v)配置收集好的綿羊紅細(xì)胞(SRBC)懸液后，以腹腔注射(ip)方式行免疫反應(yīng)測試。眼球采血后稀釋300倍，取1.0 mL血液，分別0.5 mL加入10% SRBC和1.0 mL補(bǔ)體，均反應(yīng)20 min。隨后，在上清液中分別加入都氏試劑3.0 mL。設(shè)置SRBC+都氏試劑為對照組。OD=540 nm，計算公式為半數(shù)溶血值(HC50)=樣品OD/SRBC半數(shù)溶血時的OD×稀釋倍數(shù)[18]。給予小鼠低、中、高劑量的BLL 30 d后，腹腔注射2%的SRBC細(xì)胞進(jìn)行免疫，4 d后取血清檢測HC50。

1.2.6抗體生成細(xì)胞檢測

同1.2.5方法免疫小鼠，4 d后處死小鼠，無菌取脾臟細(xì)胞，生理鹽水稀釋為5 ×106個/mL的脾臟細(xì)胞懸液。用Jerne改良玻片法檢測抗體生成細(xì)胞數(shù)(以空斑數(shù)/106脾細(xì)胞表示)[19]。

1.2.7小鼠碳廓清實驗

于小鼠尾靜脈注入印度墨汁0.1 mL/10 g，分別從不同時間節(jié)點(diǎn)(第2分鐘和第10分鐘)自內(nèi)眥靜脈叢采血20 μL，加入2 mL 0.1%碳酸鈉(Na2CO3)溶液終止反應(yīng)。設(shè)置Na2CO3為對照組，OD= 600 nm。計算吞噬指數(shù)α[19]。

（2）根據(jù)已經(jīng)確定的課程項目，設(shè)計所需的工作任務(wù)，進(jìn)而確定課程內(nèi)容，將橋隧施工及養(yǎng)護(hù)的基本知識融于項目和任務(wù)之中，寓教于做。

1.2.8小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗(半體內(nèi)法)

以ip方式將20%雞紅細(xì)胞懸液注入小鼠體內(nèi)。于反應(yīng)30 min后處死動物，收集腹腔清洗液1 mL，分別滴注于2片載玻片上于37 ℃孵育30 min。按照1∶1的比例給予丙酮-甲醇溶液固定細(xì)胞，隨后加入濃度控制在4%的Giemsa-磷酸緩沖液行細(xì)胞核染色，常規(guī)漂洗和晾干后，通過鏡下觀察，分別記錄不同視野中的陽性細(xì)胞數(shù)，并分析各噬指數(shù)和吞噬率[15]。

1.2.9自然殺傷(NK)細(xì)胞活性測定

調(diào)整靶細(xì)胞小鼠淋巴瘤細(xì)胞(YAC-1)濃度至4×105個/mL。無菌操作下取小鼠脾臟并制成濃度為2×107個/mL的單細(xì)胞混懸液。效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞各取100 μL加入96孔板進(jìn)行培養(yǎng)(效靶比為50∶1)。將YAC-1孔中再加入1%乙基苯基聚乙二醇(NP40)共培養(yǎng)4 h。吸取上清液后1 500 r/min離心5 min，再次吸取上清液加入96孔板中，每孔加入乳酸脫氫酶(LDH)基質(zhì)液100 μL，反應(yīng)5 min后加入HCl 30 μL/孔，A490 nm。計算NK細(xì)胞活性(%)[15]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般情況和臟器指數(shù)比較

直至實驗終點(diǎn)，BLL低、中、高劑量組小鼠一般情況尚可，無腹瀉、煩躁等表現(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)小鼠有中毒癥狀或非特異性死亡現(xiàn)象。給藥30 d前、后，各組小鼠的初始體重與終末體重差值為8.77～10.65 g，4組實驗動物的初始體重和終末體重差值組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組比較，BLL低、中、高劑量組小鼠的脾臟/體重、胸腺/體重比值比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組小鼠體重及臟器/體重比值比較

2.2 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力及耳郭腫脹度比較

表2 各組小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力及耳郭腫脹度比較

2.3 各組小鼠吞噬指數(shù)α及腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞比較

小鼠碳廓清實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，BLL中、高劑量組小鼠的吞噬指數(shù)α及腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)均明顯升高(P<0.05)。低劑量組小鼠的吞噬指數(shù)α及吞噬率和吞噬指數(shù)與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能比較

2.4 各組小鼠HC50及抗體生成細(xì)胞比較

BLL低、中、高劑量組與對照組樣品的HC50值比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。抗體生成數(shù)量檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，BLL中、高劑量組的空斑數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；BLL低劑量組小鼠的空斑數(shù)與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 各組小鼠血清溶血素與抗體生成細(xì)胞比較

2.5 各組小鼠NK細(xì)胞活性比較

BLL低、中、高劑量組及對照組的NK細(xì)胞活性分別為(28.59±10.15)%、(30.54±9.27)%、(36.56±8.45)%、(25.28±10.47)%。與對照組比較，BLL低、中劑量組小鼠的NK細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而BLL高劑量組小鼠的NK細(xì)胞活性明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

眾所周知，乳桿菌屬(Lactobacillus)細(xì)菌具備維持腸道微生態(tài)平衡、增強(qiáng)腸道的免疫功能的重要作用[16]。研究顯示，給予鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)均能明顯提高小鼠外周血單核細(xì)胞吞噬能力[19-20]。此外，研究發(fā)現(xiàn)人體腸道分離出的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳桿菌和副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei ssp.Paracasei)可促進(jìn)人血液單核細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素(IL)-12，進(jìn)而參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能，并調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能[21-23]。

研究顯示，不同的菌株因細(xì)胞壁組成結(jié)構(gòu)及胞外多糖產(chǎn)生代謝產(chǎn)物不同，益生菌的免疫影響也不同[24-25]。B.lactis V9、L.casei Zhang、L.plantarum P-8三者均具有良好的耐酸性和耐堿性，被證實為值得市場開發(fā)的有潛力的益生菌[26-27]。本文以動物實驗作為載體，通過檢測和分析BLL處理后的細(xì)胞和組織，從動物臟器指數(shù)、細(xì)胞增殖能力、免疫功能強(qiáng)弱和靶細(xì)胞殺傷能力等方面，綜合評定BLL調(diào)節(jié)免疫功能的作用和機(jī)制。

人體免疫器官，如脾臟、胸腺等，是反映人體免疫功能的重要指標(biāo)，以臟器指數(shù)作為單位是衡量免疫功能的初步指標(biāo)[28]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，BLL低、中、高劑量均對小鼠的體重、脾和胸腺指數(shù)無明顯影響，證實了BLL的安全性。但急性毒性、遺傳毒性、亞慢性毒性等還需體內(nèi)外實驗行進(jìn)一步驗證研究。

乳酸菌的細(xì)胞壁肽聚糖、脂磷壁酸或胞外多糖等成分可對巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生不同的效應(yīng)。故不同菌株對動物細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能及吞噬細(xì)胞的作用機(jī)制各異。T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率和增殖率可反映免疫細(xì)胞功能的強(qiáng)弱，主要是通過ConA誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為母細(xì)胞而實現(xiàn)[29]。本研究結(jié)果顯示，給予ConA處理后，BLL中、高劑量組小鼠的脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率明顯高于對照組(P<0.05)，且隨著劑量升高、轉(zhuǎn)化率也隨之提高。表明BLL可有效提高細(xì)胞增殖能力，增強(qiáng)免疫功能。

DNFB誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是檢測小鼠細(xì)胞免疫功能的另一個重要指標(biāo)。近年來，關(guān)于乳酸菌對遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響已有相關(guān)報道[30]，但本研究中未發(fā)現(xiàn)BLL對DNFB誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響，主要原因可能是菌株不同而致。

非特異性免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱常通過單核-巨噬細(xì)胞功能來反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，中、高劑量的BLL可明顯提高小鼠碳廓清功能及小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)(P<0.05)。溶血空斑試驗可用于體外檢測和計數(shù)產(chǎn)生IgM及其他類型Ig的抗體生成細(xì)胞的數(shù)目[31]。本研究結(jié)果顯示，中、高劑量BLL能明顯增加溶血空斑數(shù)(P<0.05)。以上結(jié)果表明，BLL對小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能和體液免疫功能均有明顯的增強(qiáng)作用。NK細(xì)胞在人體內(nèi)廣泛分布，是機(jī)體重要的殺傷淋巴細(xì)胞，無須預(yù)先致敏就有非特異性殺傷作用，可非特異性殺傷病毒感染細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等[3]。胞壁酰二肽作為益生菌細(xì)胞壁肽聚糖的主要成分，其功能是通過激活巨噬細(xì)胞釋放IL-1/IL-6，促進(jìn)淋巴細(xì)胞中的干擾素-γ(IFN-γ)產(chǎn)生，從而提高NK的殺傷力[32]。本研究結(jié)果顯示，高劑量BLL可明顯增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性，根據(jù)活化后的NK細(xì)胞特點(diǎn)，進(jìn)一步合成和分泌多種免疫因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及殺傷靶細(xì)胞的功能[33]。

綜上所述，BLL可通過增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞和體液免疫能力、免疫細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞能力，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，為BLL的未來開發(fā)和利用提供了臨床前數(shù)據(jù)支持，其有望發(fā)展成為有效增強(qiáng)機(jī)體免疫力、值得推廣的益生菌。