王 洋鄧振鵬鄧蘭蘭霍淑慧周鵬鑫黃現(xiàn)強

(1.西北師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.聊城大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東 聊城 252059)

0 引言

銅作為人體不可或缺的一種微量元素，人們通常由日常飲食攝入[1]。銅離子對于人體的正常代謝、發(fā)育等有著非常重要的影響[2]，但是當銅離子含量超過人體細胞的需要時，過量的銅離子也會引起蛋白質(zhì)的沉淀，破壞細胞的原生質(zhì)[3]，并且細胞中過量的銅離子也會破壞人體的神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致人體患上阿爾茨海默病、帕金森病等[4]。而Cu2＋易通過食物鏈富集，最終嚴重危害人體健康。因此，對于環(huán)境中和人體內(nèi)Cu2＋的檢測很有必要。傳統(tǒng)的檢測方法包括電感耦合等離子體法(ICP-MS)，原子吸收光譜法(AAS)、電化學(xué)法等[5]。這些方法需要依賴大型儀器，使得Cu2＋的檢測成本高昂；且操作復(fù)雜，無法迅速地檢測Cu2＋。熒光探針具有易操作、成本低廉、專一識別、肉眼可見等優(yōu)點，近年來被廣泛應(yīng)用于Cu2＋的檢測[6]。科學(xué)家們在設(shè)計熒光探針時，由于具有近紅外發(fā)射的熒光探針分子具有細胞毒性低、良好的生態(tài)環(huán)境和生物兼容性、強的組織穿透力、小的細胞組織損傷性等優(yōu)點，都希望探針分子擁有近紅外的發(fā)射[7，8](＞600 nm)；且為了避免吸收光譜和發(fā)射光譜之間光譜重疊較大，科學(xué)家們盡可能地追求大的Stokes位移，從而使得探針分子在熒光發(fā)射中盡可能地提高熒光輻射在能量耗散中的比例。其中，二氰基異佛爾酮是一種良好的熒光母體，具有Stokes位移大、近紅外發(fā)光、易合成等特點，近年來被廣泛應(yīng)用于各種離子(分子)的檢測[9]。目前的Cu2＋探針雖然取得了較大的進展，但是存在選擇性差，其他金屬離子對Cu2＋的檢測具有一定的干擾性；Stokes位移小，導(dǎo)致探針分子的吸收光譜和發(fā)射光譜之間有重疊，致使探針分子的熒光輻射比例降低；發(fā)射波長短，使得探針分子的細胞毒性高、生物兼容性差，難以應(yīng)用于生物體體內(nèi)內(nèi)源性和外源性Cu2＋的檢測[10]。因此，合成了一種基于二氰基異佛爾酮母體用于專一識別Cu2＋的探針W1，探針W1擁有近紅外的熒光發(fā)射、大的Stokes位移；多個N、O 原子，可以很好的與Cu2＋配位，從而傳遞熒光信號且不受其他金屬離子干擾。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

所用試劑均為分析純，購買自上海泰坦科技股份有限公司，金屬離子溶液均來自于相應(yīng)的硝酸鹽，以二級去離子水定容。核磁測定:Varian Mercry 400plus超導(dǎo)核磁共振波譜儀，400/600 MHz for1H NMR，150 MHz for13C NMR)，以四甲基硅烷(TMS)做內(nèi)標.在氘代溶劑中測定。質(zhì)譜:HP5989B質(zhì)譜儀。紫外可見吸收光譜(UV):Shimadzu Model 3 100 UV-vis紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。熒光發(fā)射光譜:F97 pro熒光分光光度計熒光光譜儀(南京諾泰施格科學(xué)儀器有限公司)。激發(fā)波長為416 nm，激發(fā)狹縫寬度和發(fā)射狹縫寬度為10 nm。掃描速度:1 000 nm/min。

1.2 化合物1的合成

化合物1的合成按照已經(jīng)報道的方法合成[11]:在100 m L的兩口瓶中，將異佛爾酮(1.38 g，10 mmol)和丙二腈(0.66 g，10 mmol)溶解于8 m L DMF中，再分別加入300μL哌啶和250μL乙酸酐以及150μL冰醋酸，混合體系在室溫下攪拌6 h，然后將混合物在氮氣保護下回流(120 ℃)4 h，反應(yīng)結(jié)束后，將混合物倒入1 000 m L冰水中，有大量黑色沉淀析出，過濾收集沉淀，置于真空烘箱中干燥過夜；接著，用異丙醇/水重結(jié)晶得到黃色固體1.39 g，產(chǎn)率:75%。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:6.60(d，J＝1.2 Hz，1H)，2.50(s，2H)，2.16(s，2H)，2.02(s，2H)，1.00(s，6H).13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:170.05，159.46，120.25，112.86，77.92，45.6，42.32，32.05，27.50，24.99。

1.3 化合物2的合成

化合物2的合成參照文獻報道的方法[12]，具體如下:在100 m L 的兩口瓶中，將化合物2-1(372 mg，2 mmol)和對羥基苯甲醛(244 mg，2 mmol)溶于10 m L乙醇中，分別加入100μL 哌啶和冰醋酸作為催化劑，混合體系在氮氣保護下回流(80 ℃)6 h，冷至室溫后，減壓下除去溶劑，用二氯甲烷/水萃取，收集有機并用無水硫酸鈉干燥過夜，粗產(chǎn)品用硅膠柱色譜純化(洗脫劑:二氯甲烷)，得到紅色固體化合物435 mg，產(chǎn)率:75%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:9.87(s，1H)，9.87(s，1H)，7.81(d，J＝8.7 Hz，2H)，7.42(d，J＝8.7 Hz，2H)，6.96(d，J＝8.6 Hz，2H)，6.86(d，J＝8.6 Hz，2H)，2.59(s，4H)，1.07(s，6H).13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ:170.32，159.41，156.76，138.35，129.94，127.19，126.32，121.44，115.95，114.20，113.38，74.89，42.40，38.28，31.74，27.52。

1.4 化合物3的合成

化合物3的合成參照文獻報道的方法[13]:將化合物2(360 mg，1.24 mmol)溶解于5 m L 三氟乙酸中，再加入烏洛托品(348 mg，1.2 mmol)，混合物加熱回流，用TLC法檢測至原料點消失(約2 h)，反應(yīng)完成后，倒入大量冰水中，有固體析出，收集并干燥固體，用硅膠色譜柱純化(洗脫劑:石油醚/乙酸乙酯＝20/1，v/v)，得到黃色固體化合物241 mg，產(chǎn)率:61%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:11.18(s，1 H)，9.94(s，1H)，7.72(s，1H)，7.05(d，J＝8.5 Hz，1H)，7.00(s，1 H)，6.92(d，J＝16.2 Hz，1 H)，6.85(s，1 H)，2.61(s，2 H)，2.46(s，2 H)，1.09(s，6H).13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:196.23，169.04，162.54，153.33，135.31，134.73，132.93，128.36，128.02，123.53，120.69，118.70，112.63，42.93，39.20，32.01，27.99。

1.5 化合物4的合成

在50 m L單口瓶中，將水楊醛(244 mg，2 mmol)溶于10 m L 乙醇中，攪拌下加入水合肼(500 mg，10 mmol)，然后加入100μL冰醋酸，混合物攪拌回流(80 ℃)過夜，反應(yīng)完成后，減壓除去溶劑，粗品用二氯甲烷重結(jié)晶得到198 mg白色細針狀晶體，產(chǎn)率:70%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:11.41(s，1H)，8.72(s，1 H)，7.39(dd，J＝18.2，7.9 Hz，2 H)，7.04(d，J＝8.2 Hz，1 H)，6.98(d，J＝7.5 Hz，1H)，1.26(s，2H)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:164.69，159.80，133.43，132.99，119.72，117.21。

1.6 探針W1的合成

在50 m L單口瓶中，將化合物3(32 mg，0.01 mmol)和化合物4(14 mg，0.01 mmol)溶解于20 m L乙醇中，再加入3滴冰醋酸，接著，混合物在80℃下回流至原料點消失(約14 h)，反應(yīng)完成后，待混合物冷至室溫后，將混合物倒入100 m L碎冰中，有紅色沉淀析出，收集并干燥粗品，用硅膠色譜柱純化(洗脫劑:石油醚/乙酸乙酯＝10/1，v/v)，得到21 mg紅色固體，產(chǎn)率38%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:11.70(s，1H)，11.31(s，1 H)，8.74(s，2H)，7.60(d，J＝8.1 Hz，1 H)，7.50(s，1 H)，7.46～7.36(m，2 H)，7.12～7.03(m，2H)，7.02～6.96(m，2H)，13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:153.99，140.63，134.29，133.11，132.95，129.32，129.29，129.20，128.26，128.04，109.99，55.99，40.30，33.31，29.66，18.66。HRMS(ESI):calculated for C27H24N4O2:[M＋H＋]:437.1971；Found:437.197 2。

1.7 探針檢測限的計算

采用熒光分析法測定檢測限.連續(xù)測定空白樣品(W1，10μmol/L；VDMF/VPBS＝7/3，p H ＝7.4)的熒光強度11次，計算得到空白樣品的標準偏差，再用下式計算求得檢測限

式中XLOD是檢測限，σ是連續(xù)十一次空白樣品的標準偏差，k是線性方程的斜率。

2 結(jié)果與討論

2.1 測試條件的優(yōu)化

為了更好的研究探針分子對Cu2＋的識別體系，測試了探針分子在N，N 二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、乙腈(ACN)、四氫呋喃(THF)這幾種能和水以任意比互溶的溶劑中探針分子的熒光發(fā)射，從圖1(a)可看出，探針分子在DMF溶劑中熒光發(fā)射最強，這是由于探針W1在DMF中擁有良好的溶解性，其作為極性非質(zhì)子溶劑不會干擾探針分子本身存在的激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)，且DMF 溶劑極性相對較強，探針分子本身存在分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)，DMF 溶劑中能促進這種分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移且分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移的激發(fā)態(tài)在大極性溶劑中更加穩(wěn)定，因而探針W1在DMF溶劑中熒光更強。除此之外，探針分子擁有席夫堿結(jié)構(gòu)，應(yīng)該存在聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)效應(yīng)，為此，我們研究了探針分子在良溶劑(DMF)，不良溶劑(H2O)不同比例下的熒光發(fā)射，如圖2(b)所示那樣，結(jié)果表明，在DMF/H2O(7/3，v/v)體系下熒光發(fā)射最強，當水分數(shù)從10%增加到30%時，探針分子的熒光發(fā)射逐漸增強，這是由于不良溶劑的增加致使探針分子逐漸聚集，亞胺鍵的異構(gòu)化被抑制，使得非輻射能量耗散降低[14](AIE 效應(yīng))；而當探針分子從30%增加到90%時，熒光逐漸降低，這是由于水分的進一步增加，導(dǎo)致探針分子更加聚集，形成了H-聚集體[15]。因此，我們之后的熒光測試都在DMF/PBS(7/3，v/v)體系中進行。

圖1 探針W1的合成

圖2 (a) 探針W1在不同溶劑中的熒光發(fā)射; (b) 探針W1在不同DMF/H 2 O 比例體系中的熒光發(fā)射

2.2 探針W1對Cu2+的選擇性識別

如圖3所示，進一步研究了探針W1對金屬離子的響應(yīng)，在(DMF/PBS，7/3，v/v)體系中，分別加入十倍Cu2＋當量的金屬離子(Ag＋、Na＋、K＋、Mg2＋、Fe3＋、Al3＋、Ca2＋、Zn2＋、Cr3＋、Pb2＋、Hg2＋、Ba2＋、Co2＋、Ni2＋)，可以看出，探針分子對上述金屬離子幾乎沒有響應(yīng)，而1倍當量Cu2＋的加入?yún)s使得探針W1的熒光降至原來的十分之一。表明這些金屬離子與探針分子存在的相互作用力非常弱，對探針分子檢測Cu2＋幾乎沒有干擾，所以探針W1對Cu2＋的識別具有良好的選擇性。

圖3 (a) 探針W1與不同金屬離子響應(yīng)的熒光曲線; (b) 探針W1與不同金屬離子響應(yīng)的柱形圖

2.3 探針W1對Cu2+的時間響應(yīng)及其在不同p H 下對Cu2+的識別探究

按照1.1節(jié)實驗條件，在(DMF/PBS，7/3，v/v)體系中探究了過量Cu2＋加入探針W1探針溶液中時的熒光發(fā)射光譜圖4(a)，由圖4可見，在加入Cu2＋后熒光迅速猝滅，僅120 s后探針分子的熒光強度已經(jīng)降至穩(wěn)定且不再變化，這表明探針W1可以迅速識別Cu2＋。為了研究不同p H 下探針分子對Cu2＋的識別，用不同比例的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)PBS緩沖體系的p H 為3～11，在(DMF/PBS，7/3，v/v)體系中測試了不同p H 下的探針分子及加入1當量Cu2＋后的熒光發(fā)射，結(jié)果表明，在p H 4～10的范圍內(nèi)，探針W1對Cu2＋的識別良好，而p H＝3時由于酸效應(yīng)的影響導(dǎo)致其識別效果略微降低，p H＝11時則由于Cu2＋部分水解導(dǎo)致熒光不能完全猝滅。

圖4 (a) 探針W1對Cu2＋的時間響應(yīng); (b) 探針W1在不同p H 下對Cu2＋的識別

2.4 探針W1對Cu2+的熒光滴定實驗

圖5和圖6為探針W1對Cu2＋的熒光滴定得到的曲線，從圖5可看出，在0～12μmol/L的Cu2＋中，探針W1的熒光發(fā)射逐漸降低，當Cu2＋濃度與探針分子濃度接近1∶1時，熒光強度的改變變得非常小。圖6(a)為W1與Cu2＋滴定的線性擬合曲線，在Cu2＋濃度0～6×10－6mol/L之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y＝－4.91x＋367.49，R2＝0.9921。由連續(xù)11次空白探針W1的熒光強度標準偏差算出探針W1對Cu2＋的檢測限為2.9×10－8mol/L；圖6(b)是用等摩爾連續(xù)遞變法測定探針W1與Cu2＋的配位比，首先，固定探針W1與Cu2＋的總濃度為20μL，改變二者的比例來測定探針W1與Cu2＋的配位比，結(jié)果表明，探針W1與Cu2＋在1∶1時熒光已經(jīng)降至最低，說明其配位比為1∶1。

圖5 (a) 探針W1對Cu2＋的熒光滴定曲線; (b)Cu2＋滴定的非線性擬合曲線

2.5 探針W1對Cu2+的可視化檢測

在探針W1的DMF溶液中加入不同當量的Cu2＋時，如圖7(a)所示那樣，探針W1溶液的顏色也隨之改變，探針W1可以很好地用于Cu2＋的可視化檢測。同時，制備了探針W1的濾紙條用以快速檢測Cu2＋，將干凈的濾紙條浸泡在探針W1的DMF溶液中(10－4mol/L)，待其充分附著后，放入真空烘箱中干燥，向上滴加Cu2＋，發(fā)現(xiàn)試紙迅速變?yōu)樽睾稚覠o需在紫外燈的照射下即可肉眼識別，表明該法成本低廉、識別迅速，具有良好的實用價值。

圖7 (a) 探針W1加入不同當量Cu2＋時的溶液顏色變化(10－5 mol/L); (b) 探針W1的顯色試紙用于可視化檢測Cu2＋

同時，將制備好的濾紙條在365 nm 紫外燈下照射，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)紅色熒光，然后，向上滴加不同的金屬離子(10－4mol/L)。當?shù)渭覥u2＋后發(fā)現(xiàn)，探針W1的濾紙條熒光發(fā)射猝滅，且在365 nm 的照射下的濾紙條顏色發(fā)生明顯的改變，同樣也證明了探針W1具有成本低廉、專一高效可視化檢測Cu2＋的能力。

圖8 探針W1的濾紙條加入不同金屬離子時在365 nm 下對Cu2＋的專一性可視化識別

2.6 探針W1識別Cu2+的機理

Cu2＋具有強順磁性，而探針W1分子存在分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)，當探針W1分子與Cu2＋配位后，由于Cu2＋的順磁性能夠使探針分子的電荷轉(zhuǎn)移至Cu2＋(配體-金屬電荷轉(zhuǎn)移，LMCT)，導(dǎo)致熒光團從S1到T1態(tài)的系間竄越(ISC)速度加快，并由雙分子非輻射過程(順磁效應(yīng))失活，使得探針分子熒光團的ICT 激發(fā)態(tài)猝滅[16，17]，同時酚羥基到亞胺鍵的激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)也被抑制，所以產(chǎn)生了螯合熒光猝滅[18](CHEQ)。

3 結(jié)論

以二氰基異佛爾酮為母體，設(shè)計合成了高靈敏、高選擇性響應(yīng)Cu2＋的近紅外熒光探針W1，W1擁有大的Stokes位移(252 nm)和近紅外的熒光發(fā)射(668 nm)，對Cu2＋的檢測限低至2.9×10－8mol/L，并且探針W1還能在自然光下肉眼識別Cu2＋，濾紙條實驗也證明了其擁有肉眼快速可視化檢測Cu2＋的實用價值。