王莉 王立新 秦莉

陣發(fā)性冷性血紅蛋白尿癥（paroxysmal cold hemoglobinuria，PCH）是自身免疫性溶血性貧血中最為罕見的一種，發(fā)病率僅為1/100萬～10/100萬[1-2]。DONATH和LANDSTEINER在1904年證明了該疾病由D-L抗體（Donath-Landsteiner antibodies）引起[3]。由于臨床工作中PCH十分罕見，大部分檢驗科及輸血科工作人員對其診斷以及D-L抗體的檢測并不熟悉。本文將介紹1例PCH患者的診斷過程以及如何應(yīng)用D-L抗體檢測輔助診斷成人PCH。

資料與方法

1 一般資料 患者魯某某，男，65歲，因“反復(fù)發(fā)作性尿色加深2月余”于2021年3月8日至我院血液內(nèi)科門診就診。自述從兩個月前開始出現(xiàn)反復(fù)尿色加深，呈咖啡色，且可能與低氣溫有關(guān)。兩個月前于外院檢測血紅蛋白77 g/L、直接膽紅素48 μmol/L、間接膽紅素43 μmol/L，并伴有乳酸脫氫酶明顯升高。3月8日于本院檢測血紅蛋白120 g/L、直接膽紅素2.7 μmol/L、間接膽紅素7.1 μmol/L、乳酸脫氫酶365 U/L；尿隱血陽性、觸珠蛋白＜58.30 mg/L、網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)0.1218×109/L；冷球蛋白陰性、6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PD）3807 U/L，且熱溶血、酸溶血、蔗糖溶血以及Rous試驗均陰性。由于懷疑患者體內(nèi)存在D-L抗體引起PCH，于2021年3月18日進(jìn)行D-L抗體檢測試驗。

2 試劑與儀器 采集新鮮AB型正常人血清作為補(bǔ)體來源。直接抗球蛋白分型檢測卡（西班牙戴安娜，批號：15002.21），低離子溶液（美國 BIO-RAD），卡式離心機(jī)（美國 BIO-RAD），試管離心機(jī)（日本日立），37 ℃恒溫水浴箱（上海一恒儀器）。

3 方法

3.1 標(biāo)本準(zhǔn)備：采集患者及同ABO血型的正常人新鮮EDTA抗凝標(biāo)本及促凝標(biāo)本各1管，將促凝管標(biāo)本分離血清后立即置于37 ℃水浴箱保溫，將抗凝管標(biāo)本分離壓積紅細(xì)胞后以0.9% NaCl溶液洗滌3次備用。采集AB型正常人新鮮血清作為補(bǔ)體來源。

3.2 直接抗球蛋白試驗（direct antiglobulin test，DAT）：將洗滌后的患者壓積紅細(xì)胞以低離子溶液配置成0.8%～1.0%紅細(xì)胞懸液，加入直接抗球蛋白分型卡后離心并觀察結(jié)果。

3.3 D-L抗體檢測：參考美國血液與生物治療促進(jìn)協(xié)會（Association for the Advancement of Blood & Biotherapies，AABB）技術(shù)手冊第19版中的冷熱溶血試驗方法進(jìn)行D-L抗體檢測[4]，具體操作步驟見表1。首先使用患者紅細(xì)胞進(jìn)行第一次試驗（實驗1），隨后使用正常人紅細(xì)胞進(jìn)行第二次試驗（實驗2），兩次試驗的方法步驟完全一致。

表1 D-L抗體檢測步驟

結(jié)果

1 DAT分型結(jié)果 患者DAT呈抗IgG陰性，抗C3d陽性。

2 D-L抗體檢測結(jié)果 如表2所示，患者血清可使其自身以及正常人紅細(xì)胞發(fā)生溶血，即D-L抗體檢測結(jié)果陽性。

表2 D-L抗體檢測結(jié)果

討論

本例患者出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作性尿色加深，結(jié)合其實驗室檢查結(jié)果可初步判斷為免疫性溶血性貧血。然而，進(jìn)一步診療卻無法確定患者出現(xiàn)溶血的原因。冷球蛋白檢測陰性且患者紅細(xì)胞并未凝集，可排除冷凝集素??；G6PD水平正常，可排除G6PD缺乏癥；熱溶血、酸溶血、蔗糖溶血以及Rous試驗均陰性，可排除陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥。此時我們發(fā)現(xiàn)，患者反復(fù)發(fā)作的尿色加深與低氣溫有關(guān)；當(dāng)氣溫回升時，癥狀有所緩解。因此，我們懷疑患者可能患有由D-L抗體引起的PCH。

PCH多在兒童患者中發(fā)現(xiàn)[5-8]，成人相對罕見。與血管內(nèi)溶血相關(guān)的癥狀和體征是PCH的標(biāo)志特征，包括暴露在低溫后出現(xiàn)深色尿、背部或腿部疼痛、乏力、惡心、嘔吐等[9-12]。PCH的診斷需要結(jié)合臨床和實驗室結(jié)果，當(dāng)患者有相應(yīng)癥狀且DAT抗C3d陽性、IgG陰性[13]，同時D-L抗體檢測陽性時，即可診斷為PCH。D-L抗體與PCH直接相關(guān)，是一種經(jīng)典的雙相IgG抗P自身抗體。TIWARI K等人[14]在檢測D-L抗體時特別使用表達(dá)P1抗原的紅細(xì)胞，實際是混淆了P1和P抗原。如今的P1抗原為最早由LANDSTEIER所發(fā)現(xiàn)并命名的“P抗原”，在2011年由國際輸血協(xié)會（ISBT）重新命名為P1抗原，歸于P1PK血型系統(tǒng)；而P抗原為SANGER在1955年所發(fā)現(xiàn)的Tj（a+）表型紅細(xì)胞上的Tja抗原，隨后由ISBT歸于Globoside系統(tǒng)[15]。P抗原是一種幾乎在所有人（超過99%）紅細(xì)胞表面都表達(dá)的神經(jīng)酰胺基團(tuán)多糖[16]，故本文未對其進(jìn)行特異性檢測。

PCH患者通常表現(xiàn)為DAT抗C3d陽性[13]，本文病例也符合該特征。檢測結(jié)果顯示A2管上清液溶血，是由于患者血清中的D-L抗體在正常人新鮮血清中補(bǔ)體的參與下與紅細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)；A1管上清液溶血，是因為患者標(biāo)本亦為新鮮采集，補(bǔ)體成分保留較完整。B1、B2管上清液溶血，可能是由于補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)的溫度條件并不是完全絕對的。我們認(rèn)為37℃時補(bǔ)體的級聯(lián)反應(yīng)最為活躍，但補(bǔ)體成分可能在孵育后的室溫操作中隨著逐漸復(fù)溫而發(fā)生了后續(xù)的級聯(lián)反應(yīng)。A3、B3管上清液未溶血是因為正常人血清中不含D-L抗體。

急性PCH溶血通常是短暫且自限的，臨床采取的措施有保暖、避免暴露于寒冷環(huán)境[13]以及抗補(bǔ)體治療[17]等。D-L抗體的存在可能會對輸血前檢測及交叉配血的結(jié)果產(chǎn)生影響，造成配血困難。但由于P抗原陰性的血液較難獲得，所以一般不對PCH患者進(jìn)行輸血治療。結(jié)合患者血紅蛋白水平及下降速率、臨床癥狀和并發(fā)癥等，當(dāng)貧血嚴(yán)重時可在溫暖環(huán)境下輸注經(jīng)專用儀器加溫后的紅細(xì)胞制品，以防自身抗體與輸注紅細(xì)胞結(jié)合。本病例就診時血紅蛋白120 g/L，且由于天氣轉(zhuǎn)暖已自行緩解癥狀，故未輸血并建議定期復(fù)診。半年內(nèi)多次隨訪顯示基本情況良好，暫無復(fù)發(fā)。

D-L抗體的滴度和熱幅可提示PCH的類型，如梅毒性PCH的抗體熱幅通常小于15 ℃[13，17-19]。今后的研究應(yīng)在條件允許的情況下對D-L抗體的滴度以及熱幅進(jìn)行檢測，以判斷PCH的類型。

綜上所述，本研究通過參考AABB技術(shù)手冊成功對D-L抗體進(jìn)行了檢測，驗證了該操作的可行性和參考價值。在臨床實踐中若無法確定免疫性溶血的原因，可結(jié)合近期氣溫變化及患者出現(xiàn)的癥狀或體征合理懷疑PCH，并利用D-L抗體檢測對其進(jìn)行輔助診斷。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突