王利民 丁寧 臧思思 劉善鳳 王平

在臨床檢驗工作中，血常規(guī)標本鏡下血小板聚集導致PLT計數假性減低是檢驗人員常遇到的問題。如何有效糾正這類標本的血小板計數，學者們[1-3]也進行了一系列研究，其中提到可采取的方法有重新采血、更換抗凝劑、添加阿米卡星、劇烈震蕩等。另有研究報道[4]，邁瑞6、7系型號以上血液分析儀的光學法（PLT-O）對EDTA依賴性假性血小板減少（EDTA-PTCR）的標本具有解離作用。這種方法操作簡單，可盡快發(fā)出檢驗報告且可避免患者再次采血，特別適用于門診標本檢驗。但血液分析儀PLT-O對不同程度的EDTA-PTCP標本檢測的血小板計數值與實際值究竟有無差別，能否直接用于檢驗報告的發(fā)放，是檢驗人員尤為關注的問題。本文針對這一問題進行研究報道分析。

對象與方法

1 對象 選取2020年4月～2021年5月我院門診患者EDTA-PTCR 53例標本作為實驗組，其中男性15例，女性38例，平均年齡為45±17歲；另選取25例血常規(guī)檢測鏡下無血小板聚集的健康體檢者作為對照組，其中男性7例，女性18例，平均年齡為44±16歲。

2 試劑和儀器 BC6800血液分析儀（深圳邁瑞）及配套標準品、質控品和試劑；邁瑞SC-120自動血涂片制備儀、EDTA-K2抗凝真空采血管（武漢致遠）、采血針、PLT稀釋液（草酸銨法稀釋液）、改良牛鮑氏計數板、CX顯微鏡（日本奧林巴斯）等。本實驗室已通過ISO15189實驗室認可，儀器性能驗證達標，儀器性能符合檢測要求。

3 方法 將確定為EDTA依賴性假性血小板減少的患者重新進行靜脈采血，用EDTA-K2抗凝管采集血液2 mL放置20 min后（根據本實驗室采血到上機檢測的平均TAT時間），用邁瑞B(yǎng)C6800血液分析儀CDR模式進行檢測，得到血小板電阻抗法（PLT-I）和PLT-O的檢測值，并同時進行涂片染色鏡檢。血小板計數手工法（PLF-M）：靜脈血采集前，提前準備好加有0.38 mL稀釋液（草酸銨）的EP管、20 μL毛細采樣管和棉球，EDTA-K2抗凝血采集后，立即擠出采血針管道內殘留的血液，由檢驗人員吸取20 μL血液加入EP管內20倍稀釋，混勻，整個采集過程在90 s內完成；由兩名資深的檢驗員采用雙盲法嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[5]進行PLT計數，取兩人兩次計數的平均值記為PLT-M（兩次計數的誤差＜5%）。再根據EDTA-K2抗凝管標本隨機計數每個標本鏡下30個血小板聚集團（≥3顆的聚集團）的平均血小板數量又分成5組：PLT＜6顆、PLT 6顆～10顆、PLT 11顆～15顆、PLT 16顆～20顆、PLT＞20顆，以PLT-M值為靶值，CV≤2.5%（1/2美國CLIA，88能力驗證計劃的分析質量要求）作為判斷糾正合格的標準，對標本的PLT-O值進行計數糾正的合格統(tǒng)計，對不合格標本進行觀察分析。另隨機選取10份糾正合格的標本，分別放置40 min、60 min后再統(tǒng)計儀器糾正計數合格數及涂片鏡檢。

4 統(tǒng)計學分析 計量資料采用平均值±標準差（）表示。應用SPSS 22.0軟件，采用配對t檢驗進行組間比較分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結果

1 對照組和實驗組PLT-M、PLT-I及PLT-O結果 對照組PLT-I、PLT-O與PLT-M均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。實驗組PLT-I與PLT-M有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），PLT-O與PLT-M無統(tǒng)計學差異（P=0.317），見表1。

表1 對照組和實驗組PLT-M、PLT-I及PLT-O結果

25組不同血小板聚集數標本的直方圖和血涂片 根據鏡下隨機計數30個血小板聚集團的平均血小板數量，將標本分成5組：PLT＜6顆、PLT 6顆～10顆、PLT 11顆～15顆、PLT16顆～20顆、PLT＞20顆。每組各選取一例血小板實際計數正常標本的血小板直方圖及顯微鏡下圖進行展示，如圖1。從圖中可以看出，隨著血小板聚集顆粒數的增加，血小板直方圖的波峰呈現(xiàn)下降趨勢，尾部都存在翹尾現(xiàn)象。

圖1 5組不同血小板聚集數標本的直方圖和高倍鏡（10×40倍）下血涂片

3 5 組標本的糾正計數統(tǒng)計 將53例標本的PLT-O檢測值，以PLT-M值為靶值，CV≤12.5%為標準進行糾正計數合格統(tǒng)計，結果如表2。我們發(fā)現(xiàn)當PLT平均聚集顆粒數大于20顆時，PLT-O糾正計數的合格率很不理想。

表2 5組標本的糾正計數合格統(tǒng)計表

4 糾正合格標本和糾正失敗標本血涂片對比 將PLT≤20顆PLT-O檢測結果糾正失敗標本的涂片與糾正合格標本的涂片油鏡下進行對比，選取其中5份糾正失敗標本和5份糾正合格標本的涂片，見圖2。結果發(fā)現(xiàn)：PLT-O計數糾正合格的標本鏡下血小板聚集較疏松，基本能看清各血小板的界限，而糾正失敗的標本鏡下血小板黏附聚集較致密，呈塊狀，各血小板之間的界限模糊或消失。

圖2 5例糾正合格和5例糾正失敗的標本血涂片油鏡（10×100倍）下對比

5 另隨機選取10份糾正合格的標本，分別放置40 min、60 min后再統(tǒng)計儀器糾正計數合格數量及涂片鏡檢。結果為：放置40 min后，糾正合格標本數為7份；放置60 min后，糾正合格標本數為5份。糾正合格的標本鏡下血小板平均聚集顆粒數仍小于20顆，而新增糾正失敗的標本鏡下血小板聚集的顆粒數出現(xiàn)了明顯的增加，且平均顆粒數均大于20顆。

討論

臨床上導致血常規(guī)標本發(fā)生血小板聚集的主要原因有抗凝劑、血液采集因素、臨床藥物、冷凝集等。其中EDTA-PTCP是目前我們血常規(guī)檢測中最常遇到的鏡下血小板聚集案例。EDTA-PTCP如未及時發(fā)現(xiàn)，將為臨床提供錯誤的檢測結果，從而導致不必要的血小板輸注、脾切除、皮質類固醇等不當治療，可能會導致手術的延遲、不必要的骨髓穿刺等一系列錯誤的舉措[6-9]，同時易引起醫(yī)療糾紛。因此準確識別EDTA-PTCP標本、及時有效地糾正血小板計數對臨床決策很重要，這也是一名檢驗技師應該熟練掌握的技能。

本次研究選取了53例門診EDTA-PTCP患者作為實驗組和25例無血小板聚集的健康體檢者作為對照組，本次實驗標本選取靜脈血，是為了避免靜脈血和末梢血間血小板計數的誤差[10]。結果表明：對照組PLT-I、PLT-O與PLT-M均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），表明手工法與儀器法具有一致性；實驗組PLT-I與PLT-M有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），PLT-O與PLT-M無統(tǒng)計學差異（P=0.317），表明儀器檢測EDTA-PTCP標本，PLT-I結果不準確，PLT-O結果具有較好的準確性，糾正計數性能顯著。這是由于BC6800的PLT-O法對血小板具有解聚作用。BC 6800血液分析儀網織紅細胞通道（RET通道）的PLT-O法對血小板的解聚主要是由四方面原因組成。首先保證最合適的解聚溫度，試劑預熱池和反應池的溫度分別為45.47℃和42℃。儀器吸取血樣后，立即與已經預熱的熒光試劑一起高速注入42℃的恒溫反應池中，形成旋流，使熒光試劑與血樣充分作用。同時，攪拌桿以1400 r/min的速度對反應液進行高速攪拌，對血小板聚集的物理結構進行機械破壞。反應池通過渦旋混勻以及高速打散裝置實現(xiàn)均勻分散血小板。另外試劑中的專屬“解聚成分”對血小板聚集的分子結構進行化學破壞，并與單個血小板結合，使血小板依次通過激光檢測通道，從而達到對血小板聚集結果的糾正。攪拌與加溫都只是輔助的作用，這兩者不會導致紅細胞破壞。最后RET通道的PLT-O法采用核酸熒光染色，增強了對血小板形態(tài)的鑒別能力，可以有效地鑒別紅細胞碎片，使得PLT檢測結果不受紅細胞碎片等物質的干擾[11]。

為了確定不同聚集程度的標本PLT-O檢測值是否都能直接用于檢驗報告的發(fā)放，將隨機計數30個血小板聚集團的顆粒數進行了分組，結果發(fā)現(xiàn)：PLT＜6顆、PLT 6顆～10顆、PLT 11顆～15顆、PLT16顆～20顆這四組的糾正計數合格率比較理想，均≥80%；而PLT＞20顆的糾正計數合格率較差，只有22.2%，臨床實驗室不能接受。針對PLT≤20顆糾正計數失敗的標本，油鏡下仔細觀察發(fā)現(xiàn)：與糾正計數合格的標本涂片相比，血小板與血小板之間黏附聚集更致密，呈塊狀，各血小板之間的界限模糊或消失。另外實驗結果也表明隨時間的推移，儀器解離糾正合格的標本數呈下降趨勢。這是由于EDTA依賴性假性血小板減少會隨時間的推移存在越來越嚴重的現(xiàn)象[12]。但只要標本解離時血小板聚集平均顆粒數小于20顆時，儀器仍具有良好的糾正性能。目前，EDTAPTCP發(fā)生的機制仍未能全面闡釋。廖遠泉等[13]總結了已發(fā)現(xiàn)的EDTA-PTCP發(fā)生機制，主要有EDTA的螯合機制（抗原抗體反應）、EDTA誘導血小板活化機制、“血小板的衛(wèi)星現(xiàn)象”、溫度相關性依賴現(xiàn)象-冷凝集、藥物因素等，它的發(fā)生并不是某單一機制或因素影響所導致的現(xiàn)象，應是多種因素共同作用的結果。是否由于不同機制引發(fā)的EDTA-PTCP的聚集形式和程度的不同，從而導致部分標本無法解聚，有待進一步的研究。BAO等[14]引入“解聚率”概念來定義解聚效果，解聚率=血小板聚集標本PLT-O值/PLT真實值×100%，他認為EDTA-PTCP的解聚效果是由物理和化學因素的組合導致的解離效應。另外一些聚集嚴重的標本，血小板之間黏連非常嚴重，在此儀器的反應體系快速檢測過程中無法打散所有聚集的血小板，許穎等[15]也進行了相應的報道。以上結果表明在PLT≤20顆且聚集較疏松的情況下，BC6800血液分析儀PLT-O計數可以直接用于檢測結果值的發(fā)放；但當血小板聚集顆粒數較多（＞20顆）或聚集較致密時， BC6800血液分析儀PLT-O通道并不能完全打散血小板聚集團，對血小板的糾正計數超過儀器檢測血小板的允許誤差，需采用其他糾正方法對血小板計數進行檢測。

綜上，檢驗工作中遇到EDTA依賴性假性血小板減少的標本可以使用BC6800血液分析儀光學法對血小板計數的進行糾正，但要結合血涂片鏡下血小板聚集的大致顆粒數及血小板之間黏附的致密程度來確定糾正計數結果的準確性。

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