陳富強 曲莉莉

調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）是免疫抑制性CD4+T細胞的一個特殊亞群，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)保持對自身抗原的耐受性，并通過抑制對宿主有害的過度和異常免疫反應(yīng)來預(yù)防自身免疫性疾病[1]，抑制Th1和Th2細胞的分化和增殖，并在感染、代謝性疾病、組織修復(fù)和癌癥中充當炎癥的負調(diào)節(jié)因素[2]，分子標記包括CD4、CD25、CTLA-4、GITR、LAG-3、CD127和Foxp3等。新的功能學(xué)研究發(fā)現(xiàn)CD4+Treg在一些疾病中并不能起到抑制免疫反應(yīng)的作用，反而能夠促進炎癥損傷或抑制組織重塑，表明其存在功能異質(zhì)性[3]。泛素與其他蛋白質(zhì)共價結(jié)合，涉及泛素活化酶、E2-共軛酶和E3泛素配體的活性。A20（TNFAIP3，Tumor necrosis factor α-l induced protein 3）作為一種泛素編輯酶，通過Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）途徑調(diào)節(jié)細胞因子（如TNF-α和IL-1）或病原體誘導(dǎo)的炎癥信號通路，能將K63連接的泛素鏈從NF-κB信號通路中的特定靶位移走，從而負調(diào)節(jié)NF-κB信號通路的激活[4]，是人類炎癥和自身免疫疾病，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、炎癥性腸?。↖BD）、銀屑病、I型糖尿病、冠狀動脈疾病、風(fēng)濕性心臟病等的易感位點[5]。大多數(shù)Treg細胞在胸腺中發(fā)育，少數(shù)由外周CD4+T細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生。泛素化是一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，在NF-κB激活中發(fā)揮重要作用[6]。然而，A20在T細胞，特別是調(diào)節(jié)性T細胞中的作用仍不清楚。本研究主要探討A20的表達與Treg細胞增殖和凋亡的關(guān)系。

材料與方法

1 材料 IL-2購自R&D公司；A20flox/flox小鼠、CD4–cre小鼠購自上海南方模式生物科技股份有限公司，均飼養(yǎng)在恒溫（25～27℃）、恒定濕度（45%～55%）無特殊病原菌（SPF級）環(huán)境中（該動物實驗遵循國際動物實驗福利指南《關(guān)于動物倫理與福利的作者指南共識》，已獲得審查機構(gòu)的批準（倫理審批件文號魯血倫審字[2022]2號））；RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco生物公司；小牛血清購自Hyclone生物公司；PCR試劑盒購自TaKaRa生物公司；免疫磁珠細胞分離試劑盒購自BD公司，LD分離柱、MS分離柱、MidiMAC分選器購自MACS 公司；FACSCanto Ⅱ流式細胞儀購自美國BD公司。

2 方法

2.1 條件性敲除小鼠A20基因：將A20flox/flox小鼠與CD4–cre小鼠雜交，得到在CD4+T細胞中A20基因敲除的CD4–cre A20flox/flox小鼠作為實驗組（A20 cKO），A20flox/flox小鼠作為對照組（圖1）。

圖1 A20基因條件敲除Treg細胞抑制能力分析實驗

2.2 Treg細胞的分選：按說明書操作小鼠CD4+T 淋巴細胞磁珠分離試劑盒、LD 分離柱、MS 分離柱、MidiMAC分選器，陰性選擇去除非CD4+T 淋巴細胞獲得CD4+T 淋巴細胞；加入FITC CD25單克隆抗體，再加入磁珠標記抗FITC 后分選細胞，陽性選擇獲得CD4+CD25+Treg。

2.3 流式細胞術(shù)分析Treg細胞增殖及IL-2信號通路：分別分離6～8周實驗組和對照組小鼠的胸腺和脾臟淋巴細胞，用Foxp3和TCRβ聯(lián)合標記Treg細胞，流式細胞儀分析Treg細胞的比例和數(shù)量，并分析標識分子CTLA-4、CD73、FR4、GITR的表達。實驗組和對照組小鼠尾靜脈注射2 mg 5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU），12 h后繼續(xù)注射2 mg BrdU，1 h后處死小鼠，分析Treg細胞的增殖情況；100 mg/mL的IL-2于37℃刺激CD4+T細胞20 min，pStat5、 pERK1/2和pAKT抗體標記，分析IL-2信號通路情況。

2.4 體內(nèi)實驗分析Treg細胞的抑制能力（圖1）：從3種基因型小鼠中分別分離不同類型T細胞：Ly5.2（CD45.2） A20flox/flox小鼠分離Treg細胞的作為對照組（Con Treg）、Ly5.2 （CD45.2）CD4–Cre A20flox/flox小鼠分離Treg細胞的作為實驗組A20基因條件敲除Treg（cKO Treg）、Ly5.1 （CD45.1）小鼠分離T細胞作為效應(yīng)性T細胞（Teff）。將3種T細胞分別混合分成3組：Con Treg+Teff組、cKO Treg+Teff組、Teff組，分別尾靜脈注射給Rag 1-/-基因敲除小鼠（免疫缺陷小鼠，每組10只）。每周2次稱量小鼠體重，繪制體重變化曲線。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。率的比較采用χ2/卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 Treg細胞在A20 cKO小鼠胸腺和脾臟中明顯增加A20 cKO小鼠T細胞沒有明顯的變化，但是，其胸腺和脾臟中Foxp3+Treg的比例和數(shù)目均明顯增加（P＜0.05，圖2）。這一結(jié)果表明A20基因的缺失可能是造成Treg細胞增加的原因。

圖2 A20 cKO小鼠的胸腺和脾臟中Treg細胞比例和數(shù)目均明顯增加

2 Treg細胞表面分子的分析無明顯變化：為進一步分析增加的Treg標記物是否有變化，采用流式細胞儀分析實驗組和對照組Treg細胞表面分子CTLA-4、CD73、FR4、GITR的變化，顯示實驗組和對照組小鼠胸腺和脾臟的Treg細胞中，以上4種表面分子的表達無明顯變化（圖3）。

圖3 A20 cKO小鼠Treg細胞表面分子的表達情況

3 體內(nèi)實驗不同組小鼠體重變化情況 基于以上流式細胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)A20 cKO小鼠胸腺與脾臟Treg細胞比例及數(shù)量明顯增加，表面分子表達無明顯變化，進一步進行體內(nèi)實驗，以探索Treg細胞功能的變化情況。以原始體重為基數(shù)，每周2次測量實時體重值/原始體重做為百分比體重（percent body weight，PBW），以時間為橫坐標，百分比體重為縱坐標（圖4），發(fā)現(xiàn)只注射正常效應(yīng)性T細胞（Teff）的Rag 1-/-小鼠，Teff細胞引起的急性自身免疫性反應(yīng)，3周內(nèi)體重明顯下降，3周后體重穩(wěn)定并有一定上升；分別聯(lián)合注射Con Treg+Teff組、A20 cKO Treg+Teff組細胞的Rag 1-/-小鼠體重變化無明顯差別（P＞0.05，圖4），說明實驗組A20 cKO與對照組Treg細胞在體內(nèi)表現(xiàn)的抑制能力無明顯差別。

圖4 尾靜脈注射不同細胞組合Rag 1-/-小鼠體重變化圖

4 外周Treg細胞來源分析 進一步探討A20 cKO小鼠體內(nèi)增加的Treg是來自胸腺（tTreg）還是來自外周淋巴組織（pTreg）。神經(jīng)纖毛蛋白（Neuropilin 1，Nrp 1）在tTreg特異性表達，而在pTreg低水平表達，因此Nrp 1可作為胸腺來源tTreg的表面標志物[7]，在A20 cKO小鼠外周淋巴器官淋巴結(jié)和脾臟中發(fā)現(xiàn)Nrp1+Treg明顯增多，說明增加的Treg很可能來源于胸腺（P＜0.05，圖5）。

圖5 A20 cKO小鼠和對照組小鼠外周淋巴器官中Nrp 1+ Treg的表達

5 tTreg增殖和凋亡分析 A20 cKO小鼠外周淋巴器官的Treg大部分來自胸腺，為研究A20的缺失對tTreg的影響，使用BrdU和膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）分別分析tTreg的增殖和凋亡。A20缺陷tTreg表現(xiàn)正常增殖和凋亡，提示A20在胸腺來源的tTreg增殖和凋亡沒有影響（P＞0.05，圖6）。6 A20對IL-2信號通路的影響 為探討A20在白細胞介素2（IL-2）信號通路中的作用，分析不同類型小鼠中Stat5、ERK1/2、Akt磷酸化情況，發(fā)現(xiàn)A20缺陷小鼠Stat5的磷酸化增強（P＜0.05，圖7），而ERK1/2和Akt則無顯著差異，說明A20可能通過調(diào)節(jié)Stat5的磷酸化影響IL-2的分泌。

圖6 胸腺tTreg的增殖和凋亡

圖7 Stat5 ERK和Akt 在不同小鼠中磷酸化情況

討論

本研究通過雜交手段獲得A20flox/floxCD4–Cre小鼠（A20 cKO）即A20基因在該小鼠CD4+T細胞中被條件性敲除，發(fā)現(xiàn)該小鼠發(fā)育無明顯缺陷，但胸腺和外周組織中Treg細胞比例和數(shù)量顯著增加，推測A20基因的缺失可能是造成Treg細胞增加的原因。通過進一步分析Treg表面分子CTLA-4、CD73、FR4、GITR的變化，發(fā)現(xiàn)四種關(guān)鍵因子在2種小鼠Treg細胞上的表達無明顯差異，表明增加的Treg功能未受影響。為進一步確認Treg細胞的功能，體內(nèi)實驗不同組合的細胞尾靜脈注射小鼠，觀察體重變化，提示Treg的抑制作用未受影響。以往的研究表明，IL-2分泌的增加是Treg細胞增殖的主要原因。IL-2是一種O-糖基化的四α螺旋束細胞因子，主要由活化的T細胞、樹突狀細胞和B細胞產(chǎn)生，維持T細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。Stat5、ERK1/2、Akt分別作為必需的介導(dǎo)分子，是IL-2三條主要的信號通路。在功能上，IL-2誘導(dǎo)活化的CD4+和CD8+T細胞表達IL-2和IL-2Rα，并刺激其增殖[8]。同時，IL-2在維持外周血自身耐受中也起著重要作用，它通過抗原再刺激后啟動Fas介導(dǎo)的活化誘導(dǎo)CD4+T細胞死亡以及促進調(diào)節(jié)性T細胞的分化和存活。缺乏IL-2、IL-2Rα或IL-2Rβ的小鼠沒有表現(xiàn)出嚴重的免疫缺陷表型，而是表現(xiàn)出活化T細胞增多，Treg細胞數(shù)量減少，并發(fā)展為自身免疫性疾病。在自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH） 疾病診斷中，A20 蛋白水平與臨床指標正相關(guān)，Treg細胞水平與臨床指標呈顯著負相關(guān)[9]。

Treg的增加與免疫平衡作用相關(guān)，本研究通過檢測細胞表面特異性表達的標志物，發(fā)現(xiàn)A20缺陷型小鼠外周Treg細胞主要來源于胸腺，且在體內(nèi)、體外均表現(xiàn)出正常的抑制功能。以往的研究發(fā)現(xiàn)，A20作為炎性反應(yīng)的內(nèi)源性調(diào)控蛋白和組織細胞保護性蛋白，通過TNF途徑和TLR途徑，利用其N端的去泛素化和C端的泛素化作用，負調(diào)控p38MAPK/NF-κB信號通路上的多種信號分子，減少細胞炎癥因子的產(chǎn)生[10-11]。LPS炎癥狀態(tài)下，A20可通過抑制NF-κB通路使E-selectin表達降低，提示A20可作為干預(yù)心腦血管患者血管內(nèi)皮細胞的一個重要靶點[12]。在前列腺癌相關(guān)研究中，A20能夠負反饋調(diào)節(jié)NF-κB表達，抑制細胞的凋亡[13]。誘導(dǎo)提高抗炎分子A20的表達將有望成為治療SLE疾病的新策略，PBMC中A20水平升高可抑制TLR2、4-p38MAPK/NF-κB信號通路，從而明顯改善對MRL/lpr狼瘡模型小鼠的炎癥反應(yīng)[14]。Jurkat細胞對DEX耐藥，A20過表達聯(lián)合DEX可增加對DEX 耐藥細胞的敏感性，降低Jurkat細胞增殖率；下調(diào)Jurkat 細胞中NF-κB的表達水平，促進Jurkat細胞的凋亡[15]。Imatinib通過上調(diào)A20水平抑制NF-κB通路激活[16]。

針對IL-2主要的Stat5、ERK1/2、Akt磷酸化3條信號通路進行分析，發(fā)現(xiàn)A20缺陷小鼠Stat5的磷酸化增強，且通過使用BrdU和Annexin V分析tTreg的增殖和凋亡，證明A20對tTreg增殖和凋亡沒有影響，因此，推測Treg的增加可能與IL-2和TCR信號增強有關(guān)，而不是由細胞增殖和凋亡引起的。這些結(jié)果說明A20在調(diào)節(jié)性T細胞增殖中起重要的負調(diào)控作用，這與FISCHER等的研究結(jié)論一致[17]，本研究進一步發(fā)現(xiàn)A20主要通過抑制IL-2信號通路中Stat5的磷酸化，抑制IL-2分泌，進而抑制Treg增殖，維持免疫內(nèi)穩(wěn)態(tài)。A20基因條件敲除小鼠Treg中IL-2的Stat5磷酸化信號通路負調(diào)控水平降低，促進IL-2分泌，從而促進Treg細胞的增殖。本研究雖然證實A20在Treg增殖中對IL-2信號通路的負調(diào)節(jié)作用，但如何進一步確定A20對Stat5的磷酸化/去磷酸化的作用機理？A20為什么不通過影響IL-2另外兩條ERK1/2、Akt磷酸化信號通路起作用？ERK1/2、Akt磷酸通路阻斷后，Stat5的變化情況如何？這些問題仍需要下一步深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突