孟 茹，付 永，王淑琴，康 明，張成圖，吳 英，陳永忠，謝彩英

（1西寧市動物疫病預防控制中心，西寧 810003；2青海畜牧獸醫(yī)科學院，西寧 810003；3青海大學農(nóng)牧學院，西寧 810000）

0 引言

住肉孢子蟲(Sarcocystis)是一種人畜共患的傳染病[1-2]，屬于頂復門，孢子蟲綱，真球蟲目，住肉孢子蟲科，住肉孢子蟲屬，是專性寄生于細胞內(nèi)的原蟲[3]。住肉孢子蟲中間宿主多為食草動物，終末宿主多為食肉動物，羊是其重要的中間宿主[4]。綿羊住肉孢子蟲病在世界分布廣泛[5]，寄生于綿羊的住肉孢子蟲有4種，分 別 為 S.gigantea、 S.medusiformis、 S.tenella、S.arieticanis，前2種終末宿主是貓科動物，后2種終末宿主是犬科動物且均對羊有致病性。中國綿羊住肉孢子蟲的平均陽性率為41.5%，最低陽性率為7.74%，而最高陽性率為100%[6]。住肉孢子蟲病不僅影響肉品質(zhì)量，而且嚴重危害人類的健康[7-8]。西寧市人口占全省人口的1/3，部分地區(qū)少數(shù)民族人口達到了80%以上[9]，食用肉類主要以牛、羊肉為主。目前，已證實多種住肉孢子蟲具有較強的致病性，主要表現(xiàn)在感染后可引起貧血、消瘦、乳產(chǎn)量下降、流產(chǎn)甚至死亡[10-11]，然而西寧地區(qū)住肉孢子蟲系統(tǒng)的專項流調(diào)幾乎是空白，因此掌握西寧市及其轄屬區(qū)縣綿羊住肉孢子蟲的感染強度并明確感染類型可以為有效開展住肉孢子蟲病防控提供科學的技術支撐。

1843年Miescher第1次通過鏡檢在鼠橫紋肌中發(fā)現(xiàn)了白色線狀的住肉孢子蟲包囊[12]，1990年王光雷[13]提出通過觀察住肉孢子蟲囊壁的形態(tài)結構及其在中間宿主體內(nèi)的發(fā)育過程作為羊住肉孢子蟲的蟲種鑒定指標，住肉孢子蟲的研究不斷深入。目前，住肉孢子蟲的診斷技術除經(jīng)典的組織壓片鏡檢外，胃蛋白酶消化技術、免疫學檢測以及分子生物學檢測技術的研究也日益廣泛，但在肉品檢驗中，組織壓片鏡檢耗時長檢出率低，胃蛋白酶消化技術又常常會使肌細胞被過度消化，影響觀察，容易出現(xiàn)漏診[14]。分子生物學鑒定是目前確定感染蟲種最可靠的方法，常用的候選基因有18SrRNA、28SrRNA和線粒體細胞色素C氧化酶亞基I(cytochrome C oxidase subunit 1,Cox1)基因[15]。其中Cox1基因是線粒體基因組中比較保守基因，具有中度的變異速率，廣泛用于細胞和寄生蟲種屬鑒別及交叉污染分析[16]，多項研究表明其適宜于種間的分類鑒別和系統(tǒng)發(fā)育，近年來廣泛用于住肉孢子蟲分類研究[17]。目前針對西寧市轄屬區(qū)縣市場流通的羊肉各肌肉部位住肉孢子蟲感染率、感染強度系統(tǒng)研究還很欠缺，因此，掌握西寧市市場流通中羊肉的住肉孢子蟲感染情況，為牛羊肉調(diào)運流通的關鍵地區(qū)提出防控住肉孢子蟲病的有效措施，為西寧市的牛羊調(diào)運及市場流通的牛羊肉檢驗檢疫是否應該加入關于住肉孢子蟲病的檢測提供科學依據(jù)，都是目前西寧市動物疫病防控特別是人畜共患病防控和保障市民購買的畜產(chǎn)品質(zhì)量安全面臨和急需解決的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

在西寧市的青海裕泰屠宰場、湟源縣的青海眾和肉食品有限公司隨機抽取供往西寧市轄屬區(qū)縣各市場、超市及攤販的屠宰后綿羊，分別采取剔除脂肪組織和結締組織后的膈肌、心肌、舌肌、食道肌樣品各40份，每份至少10 g，編號并標明樣品來源及日期后裝于樣品袋中立即帶回西寧市動物疫病預防控制中心病理室，-40℃冰箱保存。試驗在西寧市動物疫病預防控制中心病理實驗室開展，于2018年11月—2019年10月進行。

乙醇溶液（國藥集團化學試劑有限公司，生產(chǎn)批號20190403）、4%多聚甲醛通用型組織固定液（Biosharp，生產(chǎn)批號1608145）、二甲苯（萊陽經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)精細化工廠，生產(chǎn)批號20140518）、染色機（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術有限公司，型號YR-23）、包埋機（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術有限公司，型號YB-6LF）、切片機（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術有限公司，型號YGQ-3128D）、上海華連醫(yī)療器械有限公司電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號DHP-9082型）、奧林巴斯顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)（上海）有限公司，型號CX21）、顯微成像系統(tǒng)（奧林巴斯（日本）有限公司，型號Motic BA310）。

1.2 方法

1.2.1 壓片鏡檢 首先剝離肉樣表面肌膜、脂肪，肉眼觀察肌肉表面是否存在白色米粒狀或點狀疑似蟲體存在。食道肌可直接觀察是否存在住肉孢子蟲包囊，膈肌、心肌、舌肌剖開表層肌肉順肌纖維方向剪取肉樣1 g，盡量不要剪的很碎，之后再將剪取的肌肉橫切剪至米粒大小，每塊載玻片放5～6小塊，用力將肉樣壓薄，呈半透明狀，以透過肉樣依然清晰可見報紙上的六號字為準（見圖1）。在10×10倍光學顯微鏡下檢查計數(shù)，在任何一個部位發(fā)現(xiàn)住肉孢子蟲包囊，即被判定為陽性，并計數(shù)，統(tǒng)計住肉孢子蟲感染率、感染強度，未檢出蟲體者判定為陰性。

圖1 膈肌、舌肌、心肌壓片圖

1.2.2 切片制作及HE染色 剛取的新鮮組織塊經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，沖洗，經(jīng)不同濃度乙醇溶液脫水，二甲苯透明。經(jīng)透蠟后將組織連同熔化的石蠟，一起倒入盛有蒸餾水的容器內(nèi)，使其立刻凝固成蠟塊；調(diào)整石蠟切片與刀片的位置和角度進行切片，厚度一般為4～7 μm，切片機搖轉(zhuǎn)速度40 rpm；將切片至37℃恒溫箱中烘干，用二甲苯脫蠟后經(jīng)酒精和蒸餾水沖洗，將切片放入蘇木精水溶液中染色，樹膠封片。

1.2.3 蟲種的分子生物學鑒定 采用DNA提取試劑盒對感染樣本肉樣進行消化、DNA提取。以Cox1的特異性片段為靶基因設計的引物，引物參照Rubiola S[14]上下游引物分別為F:5，-TGTACATACTTACGGCAGGT-3，R:5，-CCGTAGGTATGGCGATCA-3。進行PCR擴增，反應體系為25 μL，其中模板DNA 2 μL，上、下游引物(100 nmol/μL)各 1 μL，10×PCR Master Mix 2.5 μL，BSA1 μL，滅菌去離子水18.5 μL。PCR反應條件為預變性94℃ 5 min；變性95℃ 60 s，退火60℃ 45 s，延伸72℃ 30 s，40個循環(huán)；延伸72℃ 5 min。

2 結果與分析

2.1 西寧地區(qū)綿羊各部位肌肉感染情況分析

對隨機抽樣采取的供往西寧轄屬區(qū)縣的屠宰場、超市、集散中心和農(nóng)貿(mào)市場的40只綿羊?qū)氖车兰?、膈肌、心肌、舌肌住肉孢子蟲感染情況進行統(tǒng)計，檢查出有33份樣品有住肉孢子蟲感染，具體每份樣品不同部位的感染數(shù)統(tǒng)計見表1。對此次樣品的整體感染情況進行統(tǒng)計分析，此次整體樣品感染率為82.5%，其中膈肌的感染率為75%，心肌的感染率為67.5%，舌肌的感染率為57.5%，平均感染強度7.67，不同部位感染狀況詳見表2。膈肌、心肌、舌肌住肉孢子蟲壓片鏡檢結果見圖2～4，可以看出，10倍顯微鏡下觀察，住肉孢子蟲蟲體一般在為300～455 μm，呈長梭形，分布于肌纖維中，與纖維方向平行，囊壁表面平。從寄生部位上看，膈肌感染率最高(75%)，其次是心肌(67.5%)、舌肌(57.5%)，食道肌未見有感染。

圖2 西寧地區(qū)綿羊膈肌住肉孢子蟲10倍鏡壓片觀察結果

圖3 西寧地區(qū)綿羊心肌住肉孢子蟲10倍鏡壓片觀察結果

圖4 西寧地區(qū)綿羊舌肌住肉孢子蟲10倍鏡壓片觀察結果

表1 西寧地區(qū)綿羊不同部位肌肉感染數(shù)量統(tǒng)計

表2 西寧地區(qū)綿羊不同部位住肉孢子蟲感染情況

續(xù)表1

2.2 染色切片鏡檢結果分析

對西寧地區(qū)綿羊膈肌、心肌住肉孢子蟲切片進行觀察，結果見圖5、圖6，經(jīng)H.E.染色可見蟲體呈藍紫色，周圍肌肉組織呈紅色，蟲體呈長梭形，分布于肌肉纖維間，蟲體囊壁分為兩層，原生囊壁與次生囊壁均結構平整無突起皺褶等特殊性結構，初步鑒定為綿羊柔嫩住肉孢子。

圖5 西寧地區(qū)綿羊膈肌住肉孢子蟲染色切片結果

圖6 西寧地區(qū)綿羊心肌住肉孢子蟲染色切片結果

2.3 分子生物學鑒定分析

選取蟲體含量高的羊心肌和膈肌樣品，采用動物基因組抽提試劑盒提取樣品DNA，經(jīng)COI-PCR法擴增目的基因、瓊脂糖凝膠電泳檢測及分析后，成功擴增出目的條帶，PCR產(chǎn)物送上海生工進行測序，序列長度為905 bp。在GenBank上進行序列比對，Blast測序結果標明其與已公布的羊柔嫩住肉孢子蟲的同源性達98%，最終鑒定為綿羊柔嫩住肉孢子(S.tenella)，與形態(tài)學鑒定結果一致。

3 討論

3.1 西寧地區(qū)綿羊住肉孢子蟲的感染強度分析

調(diào)查表明，河南地區(qū)綿羊住肉孢子蟲的感染率為32.48%[18]，湛江羊感染率為70.68%[19]，西寧地區(qū)的感染強度要高于國內(nèi)其他省份。但是在青海省內(nèi)，青海澤庫縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的感染率在90%～100%之間[20]，互助縣綿羊住肉孢子蟲病感染率為100%[21]，青?；】h[22]綿羊膈肌中住肉孢子蟲的感染率為93.3%，數(shù)據(jù)顯示西寧地區(qū)綿羊住肉孢子蟲的感染強度較青海省其他州縣感染整體偏低，特別是此次研究隨機采取的樣本中未見綿羊食道肌住肉孢子蟲的感染。主要原因有3個方面，首先：可能是由于樣本采集面及采集數(shù)量有限。其次，與城市郊區(qū)生活飲食習慣及衛(wèi)生條件都較牧區(qū)有極大改善。最后，與西寧市近年非常重視養(yǎng)犬管理，相繼出臺《犬類免疫技術規(guī)范》、《寵物診療機構診療活動技術規(guī)范》、《西寧市養(yǎng)犬管理條例》等對犬類管理、免疫及診療等都進行了規(guī)范化管理，對犬進行建檔及定期驅(qū)蟲，糞便嚴格進行無害化處理等舉措有關。關于不同部位的感染情況，相比蘇曉雪等[23]通過隨機采樣后鏡檢發(fā)現(xiàn)青海共和地區(qū)藏羊不同部位感染率由高到低依次為心肌(96.88%)、膈肌(87.50%)、食道肌(22.07%)，本次研究我們采集同一只羊屠宰后膈肌、心肌、舌肌、食道肌進行檢測，更能反應不同部位的真實感染情況。

3.2 西寧地區(qū)綿羊感染蟲種分析

常用于住肉孢子蟲蟲種鑒定的基因有Cox1基因、18S rRNA和28S rRNA基因[24-26]。研究表明，Cox1作為線粒體基因中的保守基因，在寄生蟲的分類鑒定和群體遺傳方面，被認為是理想的遺傳標記，被廣泛應用于包括住肉孢子蟲在內(nèi)的原蟲的種類鑒別及系統(tǒng)發(fā)育分析[27-28]。并且Cox1為靶基因的COI—PCR法要比以18S rRNA和28S rRNA為靶基因的SSU rRNA-PCR和LSU rRNA-PCR的特異性要好，可有效區(qū)分住肉孢子蟲與其他寄生蟲，適合于動物源性食品中住肉孢子蟲的篩查[29]。巨金玲等[30]用pcox1序列構建巨型住肉孢子蟲與其他住肉孢子蟲的種群遺傳關系，謝彩英等[31]通過pcox1的PCR擴增、測序與分析，發(fā)現(xiàn)共和縣藏羊心肌的住肉孢子蟲存在2個種。本研究采用COI—PCR法在綿羊膈肌和心肌中擴增cox1的特異性片段，測序后在GenBank上進行序列比對，同源性與已公布的羊柔嫩住肉孢子蟲的達98%，因此可以明確目前西寧地區(qū)綿羊感染主要以羊柔嫩住肉孢子蟲(Sarcocystis tenella)為主。

3.3 西寧市地區(qū)住肉孢子蟲病防治策略分析

住肉孢子蟲病傳播主要由犬、貓等終末宿主引起[32]，通過接觸污染的食物或者飲水是人和家畜感染住肉孢子蟲病的主要途徑，因此加強檢驗檢疫和防治污染是控制此病的有效手段[33]，但是檢驗檢疫主要是在農(nóng)牧防疫、檢疫等有關部門開展，同時由于住肉孢子蟲病感染后對人的傷害較包蟲病、布魯氏菌病等人畜共患病較弱，在養(yǎng)殖場戶的宣傳力度也相對薄弱，公眾對其相關知識普及率低，特別是牧區(qū)等相對落后地區(qū)，農(nóng)牧民更是知之甚少，因此未來防控應考慮農(nóng)牧、衛(wèi)生、執(zhí)法等部門聯(lián)防聯(lián)控，同時加強科普宣傳力度，利用新聞媒體、農(nóng)牧服務平臺及公眾號等各種渠道，使廣大農(nóng)牧民和市民提高認識，以達群防群控的目的。傳統(tǒng)治療該病主要采用伊維菌素、吡喹酮等，目前尚無針對性的疫苗和特效治療藥物[34]，未來住肉孢子蟲的有效防治還需加大科研和推廣示范力度，篩選可用于免疫和治療的候選基因并開展有效藥物實驗。

4 結論

通過對西寧地區(qū)羊住肉孢子蟲病感染情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)西寧地區(qū)綿羊肉住肉孢子蟲感染率為82.5%，平均感染強度7.67，從寄生部位上看，膈肌感染率最高75%，感染率已經(jīng)遠高于中國平均水平，因此相關部門急需引起高度重視，考慮制定專項防治計劃，并納入本地區(qū)疫病防控體系中。此外本研究通過對Cox1保守區(qū)片段擴增、測序、比對初步明確西寧地區(qū)綿羊感染主要以羊柔嫩住肉孢子蟲為主，為西寧地區(qū)評估羊住肉孢子蟲病的危害及采取有效防控措施提供了重要科學依據(jù)，并且該方法省時、敏感、特異、準確，可考慮進一步優(yōu)化和完善用于住肉孢子蟲病的分子診斷和流行病學調(diào)查。