張紫若，馬佳潔，高秋雨，吳則東,2

（1黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2黑龍江省普通高校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜作為制糖原料，在中國栽培時(shí)期較短，僅有100多年的歷史。中國使用甜菜作為試種糖料作物始于1906年，當(dāng)時(shí)的甜菜種子來源于德國；1909年在阿城縣建立了第一座甜菜機(jī)制糖廠；1936年是建國前種植最多的一年，種植面積約有2.4萬hm2；至建國前夕1949年，甜菜面積也才只有約1.6萬hm2。建國后由于黨和政府的重視，甜菜生產(chǎn)才得以迅速發(fā)展[1]。20世紀(jì)80年代全國甜菜總面積已達(dá)到53.3余萬hm2，65%在東北，19.1%在華北，另有10.4%在西北[2]。但從1999年起，由于糖料市場(chǎng)供大于求，國家開始對(duì)糖業(yè)方面的政策做出調(diào)整，甜菜生產(chǎn)急劇下降，整個(gè)甜菜行業(yè)進(jìn)入低谷時(shí)期。2005年以來，諸多名企先后加入制糖行業(yè)，才為整個(gè)行業(yè)注入了新的生機(jī)。

目前，國內(nèi)使用的甜菜種子大都依靠進(jìn)口，偶爾會(huì)出現(xiàn)假冒偽劣的品種。所以如何鑒別甜菜品種的真實(shí)性顯得尤為重要。根據(jù)傳統(tǒng)的表型形態(tài)學(xué)鑒定法，不僅耗時(shí)長(zhǎng)，而且形態(tài)學(xué)特征受環(huán)境影響較大，特征表現(xiàn)不穩(wěn)定，面對(duì)遺傳親緣關(guān)系較近的甜菜品種，往往難以鑒別。因此，我們選用更加快速、準(zhǔn)確、高效的分子標(biāo)記技術(shù)來鑒別甜菜品種。

分子標(biāo)記在20世紀(jì)80年代就已經(jīng)開始應(yīng)用，它是繼形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記技術(shù)之后發(fā)展起來的一種遺傳標(biāo)記[3]。近幾十年以來，已經(jīng)有SNP[4]、EST[5]、ISSR[6-7]、RFLP[8]、RAPD[9]、AFLP[10]、SRAP[11]和SSR[12-15]等多種分子標(biāo)記技術(shù)被運(yùn)用于甜菜遺傳圖譜的構(gòu)建和遺傳多樣性分析中。李清等[16]通過6對(duì)SSR引物，構(gòu)建了廣東省96份大豆種質(zhì)的DNA身份證。樊曉靜等[17]用SNP位點(diǎn)組成的DNA指紋圖譜構(gòu)建了茶樹品種資源身份證。而本次研究則通過DAMD分子標(biāo)記技術(shù)來對(duì)甜菜品種進(jìn)行分子身份證的構(gòu)建。

DAMD分子標(biāo)記技術(shù)全稱為基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的小衛(wèi)星DNA定向擴(kuò)增[15]。小衛(wèi)星是由10～60 bp堿基組成的串聯(lián)重復(fù)序列，含有小衛(wèi)星的區(qū)域通常表現(xiàn)出較高水平的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)。由于小衛(wèi)星的遺傳方式遵循孟德爾遺傳定律，而且具有較高的特異性，因此，可利用小衛(wèi)星序列作為引物，用PCR技術(shù)擴(kuò)增到小衛(wèi)星之間的序列[18]，來區(qū)分不同的甜菜品種，構(gòu)建其指紋圖譜及進(jìn)行遺傳多樣性分析。胡建斌等[19]利用15種小衛(wèi)星核心DNA引物對(duì)20份不同類型的黃瓜進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果與SSR標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。興旺等[20]選用12個(gè)甜菜品種對(duì)25條DAMD引物進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)DAMD引物擴(kuò)增效率很高，結(jié)果穩(wěn)定，條帶清晰。丁劉慧子等[21]用29條DAMD引物對(duì)40個(gè)甜菜品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，8條引物擴(kuò)增出的101條帶中99條均為多態(tài)性條帶，結(jié)果表明DAMD分子標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是多態(tài)性高，對(duì)于鑒別甜菜品種的真實(shí)性有高效快捷的作用。

本研究在前人學(xué)者的基礎(chǔ)之上，利用DAMD引物擴(kuò)增效率高、結(jié)果穩(wěn)定、條帶清晰的特性，構(gòu)建甜菜品種的分子身份證。以求快速鑒定甜菜品種的特異性，補(bǔ)充和打破形態(tài)學(xué)鑒定法區(qū)分甜菜品種的短板和局限，為甜菜品種的快速鑒定提供依據(jù)，以保護(hù)農(nóng)民以及甜菜育種家的利益不受侵害。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試品種 實(shí)驗(yàn)中所用到的甜菜品種及來源見表1。

表1 供試品種名稱及來源

續(xù)表1

1.1.2 DAMD引物 7條DAMD標(biāo)記引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，采用HAP方式純化，其序列來源于相關(guān)文獻(xiàn)，序列見表2。

表2 DAMD引物信息

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甜菜基因組DNA的提取 本研究所用供試品種均種植于黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)試驗(yàn)田，待其長(zhǎng)出4片真葉后，從各品種中挑選10株健康幼苗混樣放入2 mL離心管中，經(jīng)液氮冷凍后研磨成粉末，然后利用CTAB法[22]提取甜菜基因組DNA，最后用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)基因組DNA的濃度和純度，并稀釋至20ng/μL，再放置-20℃冰箱冷凍備用。

1.2.2 甜菜DAMD-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 反應(yīng)體系為5.0 μL 體 系 ：預(yù) 混 液 Mix 2.5 μL，水 1.1 μL，引 物0.4 μL，震蕩離心，加入DNA模板1.0 μL，最后用渦旋儀混勻。

1.2.3 甜菜DAMD-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序 反應(yīng)程序設(shè)定為Touchdown程序，退火溫度先由65℃到56℃，1℃兩個(gè)循環(huán)，最后55℃20個(gè)循環(huán)。

1.2.4 電泳及染色 使用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，每孔點(diǎn)樣1.5 μL。使用50 bp的marker，0.5×TBE作為緩沖液，180 V電壓分離90 min。電泳結(jié)束后將膠板取下用紅色熒光G-red染液染色10 min，再放入紫外凝膠成像儀觀察結(jié)果并記錄。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 根據(jù)記錄下的圖像結(jié)果，統(tǒng)計(jì)PCR擴(kuò)增圖譜上在同一遷移率位置上的條帶，有帶記為1，無帶記為0，將數(shù)據(jù)輸入Excel表格，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。再利用Mega程序，得到其指紋圖譜并進(jìn)行聚類分析和遺傳多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 96個(gè)甜菜品種的指紋圖譜構(gòu)建

利用7條DAMD引物對(duì)96個(gè)甜菜品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將其擴(kuò)增產(chǎn)物通過電泳檢測(cè)，即可得到擴(kuò)增產(chǎn)物的清晰條帶圖。根據(jù)96個(gè)品種的0、1數(shù)據(jù)表格即可構(gòu)建其數(shù)字指紋圖譜，進(jìn)而構(gòu)建96個(gè)供試甜菜品種的分子身份證。

本研究在得到以上成果的基礎(chǔ)上又逐次減少引物進(jìn)行聚類分析，以尋求利用最少引物將96個(gè)甜菜品種完全區(qū)分開，從而建立分子身份證的方法。第一輪試驗(yàn)僅利用一個(gè)引物的擴(kuò)增結(jié)果嘗試區(qū)分96個(gè)品種，但由于品種數(shù)量較多，有些同一育種單位的甜菜品種遺傳背景較相似，親緣關(guān)系較近，結(jié)果顯示，7個(gè)引物單獨(dú)標(biāo)記雖都能將一定數(shù)量的甜菜品種區(qū)分，但無一能單獨(dú)完全將96個(gè)甜菜品種區(qū)分開來；第二輪試驗(yàn)采取兩兩引物組合的方式嘗試區(qū)分96個(gè)品種，共有21種組合方式，結(jié)果顯示，21種引物組合方式中，僅有URP1F和URP17R兩種引物組合能夠?qū)?6個(gè)甜菜品種完全分離開，其余20種組合方式均未徹底將96個(gè)品種區(qū)分。但為了避免此實(shí)驗(yàn)結(jié)果是由于這兩條引物的條帶不清晰難以辨別而產(chǎn)生的偶然性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此又增加了多態(tài)性較高的URP2R引物來保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。即利用URP1F、URP17R和URP2R三種引物組合構(gòu)建96份甜菜品種的指紋圖譜（全部指紋數(shù)據(jù)圖譜略）。此處以URP2R引物對(duì)1-48號(hào)品種的擴(kuò)增條帶為例展示。

圖1 引物URP2R對(duì)48個(gè)甜菜品種的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 遺傳距離及聚類分析

根據(jù)PCR擴(kuò)增條帶，將擴(kuò)增結(jié)果0、1數(shù)據(jù)導(dǎo)入MEGA 7.0進(jìn)行遺傳距離計(jì)算和聚類分析。96個(gè)品種的遺傳距離變化范圍在0.039～0.485之間，平均遺傳距離0.237。其中最大遺傳距離來自于品種63號(hào)和54號(hào)之間，63號(hào)品種IM1162來源于荷蘭安地國際有限公司，54號(hào)品種KWS7125來源于KWS SAAT SE。最小遺傳距離來自于品種26號(hào)LS1318和27號(hào)LN80891之間，均來源于英國萊恩種業(yè)。

利用UPGMA進(jìn)行聚類分析。遺傳距離位于0.17時(shí)，96個(gè)品種被分為兩類，類群一僅由54號(hào)品種KWS7125組成，說明54號(hào)品種與其余95個(gè)品種遺傳差異性較大。類群二在略小于0.17位置時(shí)又被分成兩類，將43號(hào)品種KUHN1260與其余94個(gè)品種分離開，剩余聚類情況如圖2所示。63號(hào)和38號(hào)、88號(hào)和22號(hào)、67號(hào)和8號(hào)、12號(hào)和7號(hào)兩兩遺傳背景相似度較高，經(jīng)查表1，他們均來源于荷蘭安地國際有限公司。51號(hào)和56號(hào)、53號(hào)和52號(hào)、28號(hào)和87號(hào)遺傳背景較相似，對(duì)照表1，他們都來自于荷蘭安地國際有限公司和KWS SAAT SE，說明這兩個(gè)育種單位的甜菜品種內(nèi)部相似度較高。以上結(jié)果基本符合來源相同的品種其遺傳背景也相近這一規(guī)律。

圖2 96個(gè)甜菜品種的聚類分析圖

3 討論與結(jié)論

DAMD分子標(biāo)記技術(shù)首先可以打破傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的局限性，且DAMD分子標(biāo)記技術(shù)相較于RFLP、SSR等技術(shù)，在操作上更加簡(jiǎn)便，同時(shí)還能具有良好的多態(tài)性和擴(kuò)增條帶的清晰性，使擴(kuò)增結(jié)果更便于識(shí)別和分析。

本研究在前人基礎(chǔ)之上，利用7個(gè)擴(kuò)增效率高、結(jié)果穩(wěn)定、條帶清晰的DAMD引物對(duì)96個(gè)甜菜品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果構(gòu)建出一份甜菜品種獨(dú)有的分子身份證，創(chuàng)建了一種快速鑒定甜菜品種的途徑。研究結(jié)果成功將96個(gè)來源和遺傳背景不盡相同的甜菜品種區(qū)分，對(duì)96個(gè)品種進(jìn)行了遺傳距離和聚類分析，構(gòu)建了DAMD標(biāo)記引物的甜菜品種分子身份證，使供試的96個(gè)甜菜品種都有自己的分子身份證。本研究為了能夠進(jìn)一步縮小引物范圍使品種鑒定更加快速高效，又減少引物進(jìn)行了聚類分析。共進(jìn)行了兩輪試驗(yàn)，在第二輪兩兩引物組合的21種方式中，發(fā)現(xiàn)URP1F和URP17R兩種引物組合能夠?qū)?6個(gè)甜菜品種完全分離開。96個(gè)甜菜品種被分為兩類群，類群I僅有59號(hào)品種，類群II包含其余95個(gè)品種。但為了避免此結(jié)果為這兩種引物條帶不清難以辨別而產(chǎn)生的偶然性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此又增加了多態(tài)性較高的URP2R引物來保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。最終成功利用URP1F、URP17R和URP2R三種引物組合構(gòu)建出96份甜菜品種的分子身份證。本研究結(jié)論可用于快速鑒定甜菜品種，單獨(dú)使用一個(gè)DAMD引物也可鑒定分離幾十個(gè)甜菜品種，若7個(gè)引物同時(shí)使用，可鑒定上百個(gè)甜菜品種。

基于7個(gè)DAMD引物將96個(gè)供試甜菜品種完全鑒別分離的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究成功構(gòu)建出甜菜品種的分子身份證，能夠快速鑒定甜菜品種真實(shí)性，補(bǔ)充了通過形態(tài)學(xué)鑒定法區(qū)分甜菜品種而造成的局限，同時(shí)也進(jìn)一步驗(yàn)證了利用DAMD引物鑒定甜菜品種的可行性和高效性?？梢詭椭行Ы鉀Q市場(chǎng)相似品種混雜，假冒偽劣等問題，為保證育種家和農(nóng)民的利益提供保障。