祖未希，趙曉霞，高 芬

（1太原旅游職業(yè)學(xué)院酒店管理系，太原 030032；2山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，太原 030006）

0 引言

黃芪為豆科植物蒙古黃芪(Astragalus membranaceus var.mongholicus，AMM)或膜莢黃芪(A.membranaceus)的干燥根，性溫、味甘，具補(bǔ)氣固表、托瘡生肌等功效，是藥用價(jià)值很高的中藥材[1]，并在2012年被納入藥食同源目錄，其主要藥效成分包括黃酮類、皂苷類、多糖等。近年來，黃芪被廣泛用于臨床各科和日常保健，市場需求量逐年攀升。然而，由于黃芪野生資源日益匱乏，移栽黃芪且主要是蒙古黃芪開始大規(guī)模種植，并占據(jù)了市場份額的90%以上[2]。山西作為蒙古黃芪的主產(chǎn)區(qū)，移栽芪的生產(chǎn)也步入了快車道，但隨之有2個(gè)問題開始在生產(chǎn)中日益凸顯，一是被稱為“植物癌癥”的根腐病發(fā)生日漸廣泛和嚴(yán)重[3-4]，且目前無論化學(xué)防治還是農(nóng)業(yè)手段，均無法有效控制其危害[5]；二是研究發(fā)現(xiàn)，移栽芪中的某些藥效成分如毛蕊異黃酮葡萄糖苷[6-7]、芒柄花苷[7]、皂苷[7-8]、多糖[6,9]等的含量顯著低于野生芪。藥效成分的穩(wěn)定性和均一性是確保中藥材質(zhì)量及中醫(yī)臨床用藥安全有效的關(guān)鍵[10]。移栽芪藥效成分含量變化導(dǎo)致的品質(zhì)下降，也成為阻礙黃芪產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展不可忽視的因素。

利用拮抗微生物特別是芽孢桿菌(Bacillus spp.)來防治植物病害，一直是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，以其為主體因子開發(fā)的生防制劑，在多種農(nóng)作物土傳病害防治上顯示出了良好的效果。近年來，隨著中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，利用拮抗芽孢桿菌防治中藥材土傳病害，也越來越被科研人員所關(guān)注，特別是針對(duì)人參根腐病，關(guān)一鳴等[11]篩選獲得了能強(qiáng)烈抑制人參根腐病菌(Fusarium solani)菌絲生長和孢子萌發(fā)的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)B11。KIM等[12]發(fā)現(xiàn)了可防治人參根腐病(Cylindrocarpon destructans)的解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)AK-0。對(duì)于黃芪根腐病，本課題組前期也開展了一系列的相關(guān)研究，萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus)SXKF16-1[13]和枯草芽孢桿菌G10(B.subtilis)[3]均對(duì)由腐皮鐮刀菌(F.solani)和銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)引起的根腐病有明顯的離體防病效果。此外，芽孢桿菌在調(diào)節(jié)植物營養(yǎng)成分，提升中藥材藥效成分含量方面也多有報(bào)道?？莶菅挎邨U菌FZB24可以提高藏紅花中番紅花苦苷、番紅花酸和藏紅花醛的含量[14]。內(nèi)生芽孢桿菌(B.endophyticus)AMR83能顯著促進(jìn)白術(shù)根部活性成分揮發(fā)油的積累[15]。內(nèi)生多黏類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)[16]和多粘芽孢桿菌菌劑[17]對(duì)人參生長和皂苷累積均起到了促進(jìn)作用。由此可見，篩選利用具有“抗病提質(zhì)”效力的多功能菌株，并將其開發(fā)為生防制劑，不僅有利于對(duì)中藥材病害進(jìn)行有效防控，還可在一定程度上提升藥效成分，滿足中藥材生產(chǎn)中對(duì)產(chǎn)量和質(zhì)量的多重要求。

1 材料與方法

1.1 供試材料

病原菌：黃芪根腐病菌銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)和腐皮鐮刀菌(F.solani)，由本課題組分離、鑒定并保存。

拮抗菌：菌株R57，由本課題組篩選獲得并保存。

植物材料：蒙古黃芪(Astragalus membranaceus var.mongholicus；AMM)，以下統(tǒng)一簡稱為黃芪。試驗(yàn)室盆栽種植5～6個(gè)月，取長勢(shì)基本一致的幼苗，用于離體防病試驗(yàn)；采自山西應(yīng)縣黃芪種植基地的一年生黃芪（根長10～15 cm左右，直徑3～6 mm），用于盆栽防效和藥效成分影響試驗(yàn)。

試驗(yàn)在山西大學(xué)完成，2014年4月—2016年6月進(jìn)行拮抗菌篩選、平皿及離體防病試驗(yàn)；2016年10月—2017年6月間進(jìn)行盆栽防病和功能菌株形態(tài)和生理生化鑒定；2019年10月—2021年6月進(jìn)行藥效成分影響試驗(yàn)和功能菌株分子鑒定。

1.2 儀器與試劑

儀器：Waters e2695液相色譜儀（配備Waters 2489紫外可見檢測(cè)器、Chromachem ELSD檢測(cè)器、Empower色譜工作站）。試劑：乙腈和甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；對(duì)照品為毛蕊異黃酮葡萄糖苷(CAS NO.20633-67-4)、芒柄花素(CAS NO.485-72-3)、黃芪皂苷I(CAS NO.84680-75-1)、黃芪皂苷IV(CAS NO.84687-43-4)均購于上海永恒生物科技有限公司；芒柄花苷(CAS NO.486-62-4)、毛蕊異黃酮(CAS NO.20575-57-9)購于成都曼斯特公司。上述標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。

1.3 菌株R57抑菌防病效果的測(cè)定

1.3.1 無菌發(fā)酵濾液的平板抑菌活性 牛津杯法測(cè)定抑菌活性[3]。病原菌孢子懸液和菌株R57無菌發(fā)酵液制備均參照文獻(xiàn)進(jìn)行，發(fā)酵培養(yǎng)基為R57專用培養(yǎng)基。試驗(yàn)以無菌水為對(duì)照，3次重復(fù)。

1.3.2 無菌發(fā)酵濾液的離體防病效果 浸根法測(cè)定離體防效[13]。試驗(yàn)中病原菌孢子懸液制備同1.3.1，終濃度1.5×106cfu/mL～2.5×107cfu/mL；菌株R57無菌發(fā)酵液制備同1.3.1。7天和15天記錄發(fā)病情況，病情指數(shù)表示發(fā)病程度，根腐病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[13]。對(duì)照和重復(fù)設(shè)置同1.3.1。

逝者如斯，一晃輪到柳知客家?guī)O媳婦了。正在大家歡欣鼓舞前往合家歡時(shí)，卻被柳知客家門前貼的一張啟示（“事”被柳知客誤寫為“示”）攔住了——

1.3.3 發(fā)酵液的盆栽防病效果 將采自種植基地的黃芪采用1.3.2方法洗凈、消毒；栽種前用鋼絲球輕微刮擦根部，制造少許傷口，待用。病原菌孢子懸液制備同1.3.2；R57發(fā)酵液制備同1.3.1，但不去除菌體。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理：A為黃芪栽入花盆后，僅澆灌R57發(fā)酵液500 mL（陰性對(duì)照）；B為黃芪根在50 mL病原菌孢子懸液中浸泡60 min后栽入花盆，剩余懸液澆入土中（陽性對(duì)照）；C為保護(hù)性處理：將黃芪根在R57發(fā)酵液500 mL中浸泡15 min后栽入花盆，剩余的發(fā)酵液澆入土中；常規(guī)培養(yǎng)72 h后，用病原菌孢子懸液灌根（50 mL/盆）；D為治療性處理：將黃芪根在50 mL病菌孢子懸液中浸泡60 min后栽入花盆，剩余懸液澆入土中；常規(guī)培養(yǎng)72 h后，用R57發(fā)酵液灌根（500 mL/盆）。每處理3次重復(fù)（3盆），每盆8～10株黃芪。人工氣候室培養(yǎng)30天后[(25±1)℃，光照交替12/12 h]，記錄各處理黃芪發(fā)病率，并計(jì)算防效。以上土壤為經(jīng)高溫滅菌的無菌土。

1.4 菌株R57對(duì)黃芪藥效成分影響的分析

1.4.1 黃芪的種植與處理 將采集自種植基地的黃芪幼苗種植于花盆中（8～10株/盆），緩苗40天，常規(guī)管理。菌株R57發(fā)酵液制備同1.3.3。發(fā)酵液分3次澆注，間隔10天，每次澆液量為150 mL/kg土壤。以蒸餾水為對(duì)照，3次重復(fù)。黃芪培養(yǎng)60天后（條件同1.3.3）記錄生長情況，采集根部，-80℃保存，用于藥效成分測(cè)定。

1.4.2 對(duì)黃芪總多糖含量的影響 苯酚-硫酸比色法測(cè)定總多糖含量，總多糖提取和樣本制備參照文獻(xiàn)[6]。用無水葡萄糖對(duì)照品制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.0635x+0.0196，R2=0.9973，葡萄糖在4.10～14.35 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。488 nm波長下測(cè)定樣本吸光度完成后，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液中總多糖含量。

1.4.3 對(duì)黃酮類和皂苷類含量的影響 HPLC-UVELSD法測(cè)定黃酮類和皂苷類含量，條件及樣本制備均參照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法[18]。標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)品溶液用0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL。測(cè)定完成后，將4種黃酮的含量相加得總黃酮的含量，2種皂苷的含量相加得總皂苷含量。

以上活性成分測(cè)定時(shí)每生物學(xué)重復(fù)均以3次技術(shù)重復(fù)測(cè)定。

1.5 菌株R57的分類鑒定

1.5.1 形態(tài)、生理生化特征觀察 參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[19]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[20]，觀察菌株R57的菌落形態(tài)與顏色、革蘭氏染色和芽孢染色等特征，并測(cè)定其生理生化特性。

1.5.2 16S rDNA序列測(cè)定與分析 菌株R57基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增均參照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法[21]。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測(cè)序，所得基因序列與GenBank中的已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)，運(yùn)用MEGA 5.05構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016處理數(shù)據(jù)，SPSS 16.0進(jìn)行Duncan’s新復(fù)極差檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株R57的抑菌防病效果

以F.solani為靶標(biāo)測(cè)定菌株R57無菌發(fā)酵濾液的抑菌活性時(shí)，抑菌圈清晰透明，邊緣整齊，直徑為(18.02±1.71)mm；以F.acuminatum為靶標(biāo)時(shí)，抑菌圈透明度和邊緣整齊度均略弱于前者，直徑為(19.96±2.42)mm。結(jié)果表明：菌株R57對(duì)2種病原菌均具有良好的抑菌活性，但抑菌效果存在差異。

離體防病試驗(yàn)中，只加入菌株R57發(fā)酵液和PD培養(yǎng)液的對(duì)照組，黃芪均不發(fā)??；F.solani接種組的黃芪根部在7天即開始明顯發(fā)病，病情指數(shù)為58.33±2.08，此后隨時(shí)間延長發(fā)病加重，15天病情指數(shù)達(dá)66.67±2.78；F.acuminatum接種組發(fā)病情況同F(xiàn).solani接種組，7天病情指數(shù)為50.00±25.00，15天病情指數(shù)達(dá)72.22±4.81。菌株R57無菌發(fā)酵液的不同處理方式，對(duì)2種病原菌的致病情況表現(xiàn)出不同防效。針對(duì)F.solani侵染，R57保護(hù)處理在7天時(shí)表現(xiàn)出顯著防病效力；治療處理在7天和15天均表現(xiàn)出顯著防病效力；拮抗處理僅在7天時(shí)有明顯防效。針對(duì)F.acuminatum侵染，R57保護(hù)處理在15天時(shí)有顯著防病效力；治療處理在7天和15天均表現(xiàn)出顯著防效；拮抗處理則無防病效力。可以看出，菌株R57發(fā)酵液對(duì)由F.solani和F.acuminatum侵染引起的根腐病，具有治療性和保護(hù)性的離體防病效果（表1）。

表1 菌株R57無菌發(fā)酵液的離體防病效果

盆栽防效試驗(yàn)中，僅澆灌R57發(fā)酵液的黃芪苗長勢(shì)良好，無發(fā)病癥狀；接種2種病原菌的處理地上部分發(fā)病不明顯，但根部均出現(xiàn)了黑色或褐色斑點(diǎn)，少數(shù)有腐爛發(fā)生。菌株R57發(fā)酵液施用對(duì)由F.solani和F.acuminatum接種引起的根腐病均顯示出較好的保護(hù)性防病作用，防效分別為61.27%±4.89%和64.33%±8.25%；治療性處理也顯示出了一定效果，但較保護(hù)性防效低，均未超過50%（表2）。

表2 菌株R57發(fā)酵液的盆栽防病效果

2.2 菌株R57對(duì)黃芪藥效成分的影響

盆栽黃芪幼苗澆注菌株R57發(fā)酵液后，生長期間長勢(shì)良好，至樣品采集時(shí)，處理組黃芪地上部分生長明顯高于對(duì)照組，且葉片更加濃綠、茂盛。藥效成分測(cè)定結(jié)果表明（表3）：與對(duì)照組相比，黃酮類的毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花苷含量均顯著升高(P<0.05)，分別提升40.5%和83.1%；毛蕊異黃酮和芒柄花素含量未發(fā)生明顯變化；以上述4種成分的總量來看，總黃酮含量較對(duì)照顯著升高(P<0.05)。皂苷類無論單一成分還是總量，與對(duì)照相比均有所升高，但差異不顯著?？偠嗵呛课窗l(fā)生顯著變化。由此可知，菌株R57發(fā)酵液施用可在一定程度上提升黃芪黃酮類活性成分的含量，但對(duì)皂苷和多糖無明顯促進(jìn)積累的作用。

表3 菌株R57發(fā)酵液施用對(duì)黃芪藥效成分的影響

2.3 菌株R57的分類鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)及生理生化特征 菌株R57在PDA平板上菌落呈圓形或橢圓形，米白色，不透明，表面中間褶皺，邊緣鋸齒狀；菌體大小為(0.5～1.5)μm×(3.0～4.0)μm，革蘭氏和芽孢染色均為陽性，芽孢通常在菌體中間。生理生化特性測(cè)定結(jié)果見表4。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，初步鑒定R57為枯草芽孢桿菌B.subtilis。

表4 菌株R57的生理生化特性

2.3.2 16S rDNA序列測(cè)定與分析 以菌株R57基因組DNA為模板，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)得R57 16S rDNA核苷酸序列長度為1460 bp。將該序列提交到GenBank（登錄號(hào)：KX427025.1），并與數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)；運(yùn)用MEGA5.05建立系統(tǒng)發(fā)育樹Test Neighbor-Joining Tree（圖1）。結(jié)果表明，菌株R57與B.subtilis形成一個(gè)族群，同源性高達(dá)99%。綜合菌體形態(tài)、生理生化特性、16S rDNA序列分析，最終將菌株R57鑒定為枯草芽孢桿菌B.subtilis。

圖1 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株R57的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

芽孢桿菌具有抑菌譜廣、抗逆性強(qiáng)、可分泌多種抗菌物質(zhì)，且繁殖快、生產(chǎn)成本低、安全性高、種類繁多等優(yōu)點(diǎn)，在植物病害的生物防治中占有重要地位[22]。同時(shí)，它還是植物健康和營養(yǎng)的天然資源[23]，產(chǎn)生的代謝物可促進(jìn)植物生長發(fā)育，改善植物品質(zhì)[24-25]，因此也被應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品的增產(chǎn)提質(zhì)中。研究獲得的多功能菌株R57為枯草芽孢桿菌，該類細(xì)菌在改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，維持土壤養(yǎng)分供給和病蟲害防治等方面功效明顯；同時(shí)，枯草芽孢桿菌處理對(duì)促進(jìn)植株生長，改善果實(shí)品質(zhì)也有很好的效果[24]。菌株R57兼具了上述兩項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，在黃芪根腐病防治和活性成分含量提升方面均顯示出了一定的應(yīng)用潛力，但無論防病效果還是品質(zhì)改善作用，都還需通過制劑形成、使用方法改進(jìn)等措施進(jìn)一步加以提高，才能滿足在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用的要求。研究表明，復(fù)合菌肥因其含有多種微生物而能夠發(fā)揮更加豐富的功能，因此，加大研究力度以獲得更多的功能菌株，并將其混配復(fù)合使用，可作為提高功能菌制劑整體效能的有效途徑之一。

農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，芽孢桿菌作為一類典型的植物根際有益細(xì)菌，通常以競爭作用、抗生作用、促進(jìn)植物生長和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性等機(jī)制對(duì)病害起到防控作用[22]。對(duì)藥用植物的有效成分，根際微生物則通過調(diào)控藥用植物中與次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因的表達(dá)，合成轉(zhuǎn)化植物活性成分前體的關(guān)鍵酶等機(jī)制促進(jìn)其積累[26]。如短小芽孢桿菌B.pumilus通過增加關(guān)鍵酶的表達(dá)來提高甘草酸的含量[27]。另外，植物地上部產(chǎn)量的增加和品質(zhì)的提高離不開根系對(duì)土壤中養(yǎng)分吸收的提升，根際有益微生物能通過礦化、硝化等過程活化土壤養(yǎng)分，提高土壤中速效養(yǎng)分（如有效氮、有效磷等）的含量[25]，促進(jìn)植株體對(duì)這些養(yǎng)分的吸收利用?？傊爸参铩幸嫖⑸铩寥馈敝g存在著復(fù)雜的互作關(guān)系，這種關(guān)系的變化一方面影響植物土傳病原對(duì)植物根系的入侵，另一方面也通過影響根際介質(zhì)結(jié)構(gòu)與肥力，間接影響作物生產(chǎn)過程，調(diào)控植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累。因此，枯草芽孢桿菌R57灌根后，如何阻止根腐病菌侵染黃芪根部，如何調(diào)控或促進(jìn)藥效成分含量變化，進(jìn)而達(dá)到“防病提質(zhì)”的效果，將是下一步深入研究的方向。

在R57對(duì)根腐病防效試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)預(yù)防性處理和治療性處理下，離體與盆栽防病的效果間并不具有一致性，推測(cè)其原因一方面可能在于R57發(fā)揮作用的介質(zhì)（水和土壤）不同，影響了抗菌物質(zhì)效力的發(fā)揮；另一方面離體防病試驗(yàn)中去除了拮抗菌菌體，而盆栽試驗(yàn)用全發(fā)酵液進(jìn)行灌根，也是造成防效波動(dòng)的重要因素。此外，研究中僅測(cè)定了黃芪6種主要藥效成分的變化，不足以全面反映R57處理對(duì)黃芪整體品質(zhì)的影響，因此，借助以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)的植物代謝組學(xué)技術(shù)探究其對(duì)黃芪活性成分的影響，是更為理想的品質(zhì)變化評(píng)價(jià)手段。還需注意的是，黃芪中的皂苷80%以上分布在表皮，試驗(yàn)中樣品粉碎前對(duì)黃芪表皮的處理可能導(dǎo)致了部分皂苷的損失，使得皂苷Ⅳ和皂苷Ⅰ的實(shí)際測(cè)定結(jié)果較其他文獻(xiàn)的報(bào)道偏低。

4 結(jié)論

針對(duì)由F.solani和F.acuminatum侵染引起的黃芪根腐病，功能菌株R57發(fā)酵液的保護(hù)性防病效果分別為61.27%±4.89%和64.33%±8.25%；同時(shí)，該發(fā)酵液的施用還使黃芪中主要活性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花苷的含量分別提升了40.5%和83.1%。經(jīng)鑒定，菌株R57屬枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。上述結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌R57不僅具有抑菌防病的作用，而且還能促進(jìn)黃芪主要藥效成分的積累，改善品質(zhì)。菌株R57的研究為黃芪專用多功能制劑的開發(fā)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，其進(jìn)一步開發(fā)利用可為解決當(dāng)前黃芪規(guī)?；a(chǎn)中根腐病發(fā)生嚴(yán)重和藥效成分含量降低等問題提供思路和方法。