韓旭晨，董 巖，韓豪杰，譚艷平，劉學(xué)群，劉新瓊，徐 鑫，李 開，王春臺

（中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/生物技術(shù)國家民委重點實驗室/武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室，武漢 430074）

0 引言

世界上一半以上的人口以水稻為主食[1]。由稻瘟病菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病會造成水稻大量減產(chǎn)。培育抗耐病品種是防治稻瘟病最安全、經(jīng)濟有效的措施。選育含有主效抗性基因的品種在多種作物中已經(jīng)被應(yīng)用。到目前為止，已定位稻瘟病主效抗性基因100多個，已克隆出36個[2]。但是由于稻瘟病菌變異較快，從而導(dǎo)致其毒力變化快，形成新的致病小種使抗病品種失去抗病性。因此，研究不同地區(qū)稻瘟病菌的無毒基因分布、變異以及每年的動態(tài)變化，可為水稻產(chǎn)區(qū)抗病品種的選育和布局提供理論依據(jù)。

水稻-稻瘟病菌系統(tǒng)是典型的基因?qū)蛳到y(tǒng)[3]。無毒(Avr)基因編碼的Avr蛋白可作為效應(yīng)器，被植物細胞中相應(yīng)的R蛋白直接或間接識別，這兩種蛋白相互作用，引起寄主植物宿主快速防御反應(yīng)。無毒基因高度多樣化，具有快速自然變化的能力，包括全部或部分缺失、轉(zhuǎn)座子插入、點突變、甚至易位等[4-6]。Avr基因的突變導(dǎo)致由R基因控制的抗性機制的崩潰，為了R基因的可持續(xù)利用，了解病原菌中Avr基因的變異機制具有重要意義。

鄂西南屬云貴高原與東部低山丘陵的過渡區(qū)域，山河交錯，雨熱同期，降水充沛，且鄂西南地區(qū)稻區(qū)海拔不一，光照溫度等自然條件多樣，構(gòu)成了復(fù)雜的氣候資源，稻瘟病菌組成復(fù)雜且變異也特別快，選育適應(yīng)該地區(qū)的水稻品種具有特別重要的意義。目前已有AVR-Pita[7]、AVR-Pizt[8]、AVR1-CO39[9]、ACE1[10]、AVRPia、AVR-Pii、AVR-Pik/km/kp[11]、PWL1[12]、PWL2[13]、AVRPib[14]、AVR-Pi9[15]和AVR-Pi54[16]12 個無毒基因被克隆。Avr-Pia編碼長度為85個氨基酸的分泌蛋白，直接與水稻RGA5中的RATX1結(jié)構(gòu)域互作，釋放RGA4，引起植物抗病反應(yīng)[17-18]。在山東水稻主產(chǎn)區(qū)分離的123個稻瘟病菌中，Avr-Pia的出現(xiàn)頻率為10.57%[19]。云南省13個市采集分離的471株稻瘟病菌中有244株含有Avr-Pia，且主要是完全缺失變異[20]。鄂西南地區(qū)無毒基因AVR-Pia的分布情況和變異以及抗性基因Pia在該地區(qū)的有效性尚未清楚。

本研究通過對2017—2020年收集分離到的661株稻瘟病菌利用PCR檢測來研究鄂西南地區(qū)稻瘟病菌無毒基因Avr-Pia的出現(xiàn)頻率和分布，同時進行致病性鑒定來測定抗性基因Pia的有效性，結(jié)合生物信息學(xué)來分析無毒基因Avr-Pia的變異機理，為鄂西南地區(qū)針對性的聚合水稻主效抗性基因育種以及水稻品種合理布局提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用感病稻桿采集自鄂西南的9個不同地點（咸豐、宣恩、柏楊、建始、鶴峰、來鳳、忠路、賀家坪、野三關(guān)）[21]的不同品種（表1），經(jīng)分離獲得單孢菌株（表2），采用濾紙片保存法保存[22]。含有Pia基因的水稻單基因系IRBLa-A水稻品種及感病對照麗江新團黑谷由武漢中南民族大學(xué)武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室/生物技術(shù)國家民委重點實驗室提供。

表1 各地區(qū)種植水稻品種

續(xù)表1

表2 2017—2020年各觀測點感病品種和分離單孢數(shù)量

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取 稻瘟病菌活化后液體培養(yǎng)獲得菌絲，冷凍干燥。采用CTAB(CTAB 2%、NaC1 1 mol/L、pH 8.0 Tris-HC1 100 mmol/L、EDTA 20 mmol/L)法提取DNA，溶于1×TE緩沖液后，于-20℃冰箱備用。

1.2.2AVR-Pia基因PCR檢測與測序 根據(jù)報道的Avr-Pia無毒基因序列CDS區(qū)域和啟動子區(qū)域序列合成引物（表3），由華大基因合成。20μL反應(yīng)體系包括模板 DNA(20 ng/μL)2 μL、Avr-PiaF1和AVR-PiaR1(10 μmol/L)各0.3μL、10×PCR Buffer(Mg2+Plus)2μL、dNTPs(10 mmol/μL)1 μL、ExTaq(5 U/μL)0.1 μL、ddH2O 14.3 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)；72℃再延伸10 min，12℃保存。重復(fù)2次，制做濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠對產(chǎn)物進行電泳檢測，統(tǒng)計無毒基因AVR-Pia所占比例，對含有無毒基因Avr-Pia的陽性產(chǎn)物送華大基因進行測序，同時結(jié)合致病性結(jié)果選取陽性菌株對啟動子區(qū)域(AVR-PiaF2，AVR-PiaR2)進行擴增，送華大基因測序。

表3 AVR-Pia CDS與啟動子區(qū)域引物

1.2.3 稻瘟病菌孢子懸浮液的制備 將實驗室保存的661株稻瘟病菌株活化后接種到燕麥培養(yǎng)基，25℃下黑暗培養(yǎng)7～9天，當(dāng)培養(yǎng)基平板被菌體覆蓋后，使用棉簽將菌體表面菌絲刮除，置于28℃產(chǎn)孢培養(yǎng)箱紫光產(chǎn)孢3～4天。產(chǎn)孢完成后，用準(zhǔn)備好的無菌水將培養(yǎng)基表面灰色孢子用毛刷刷下雙層紗布過濾，調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度為1.5×105個/mL，加入0.02%Tween-20后備用。

1.2.4 水稻稻瘟病接種與調(diào)查 將水稻單基因系IRBLa-A水稻品種和感病對照品種麗江新團黑谷種子浸種，再將鐵盤裝好土，做好標(biāo)記后將種子放入土坑，每個品種播種10粒左右，用細土蓋住種子，每天定時澆水，大約15天長至4葉期。接種前將鐵盤加入足量的水保證土壤濕潤，再在接種室中利用噴壺將孢子懸浮液均勻噴霧到水稻葉表面，噴好菌液后將幼苗轉(zhuǎn)移至恒溫保濕箱保濕24 h，保證濕度90%以上，保濕完成后轉(zhuǎn)移至溫室，光照培養(yǎng)5～7天，調(diào)查發(fā)病情況，調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)參考文獻[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鄂西南地區(qū)稻瘟病菌無毒基因AVR-Pia的動態(tài)變化

對2017—2020年分離保存的661株稻瘟病菌單孢菌株經(jīng)過PCR檢測，有49株能擴增出預(yù)計463 bp的特異性條帶（圖1），612株未擴增出該條帶。2017年分離的106株稻瘟病菌中，只有8株含有無毒基因AVR-Pia，且只在柏楊和來鳳地區(qū)，分別為7、1株，所占比例為22.6%、14.3%。2018年分離的134株中，AVR-Pia出現(xiàn)的地區(qū)增加，賀家坪、野三關(guān)、來鳳和柏楊分別有2、3、7、11株，所占比例為20%、30%、53.8%、22.4%；2019年分離的161株稻瘟病菌中，僅在來鳳分離的稻瘟病菌中檢測到5株稻瘟病菌含有無毒基因AVR-Pia，所占比例為10.6%；2020年的260株稻瘟病菌中只有13株檢測到含有AVR-Pia，柏楊、宣恩分別有6、7株，所占比例為8.7%、10.1%（表4）?？傮w來說，鄂西南地區(qū)每一年AVR-Pia出現(xiàn)都比較少，2017年、2019年、2020年出現(xiàn)頻率都低于10%，只有2018年出現(xiàn)較多，達到16.0%，而且每一年地區(qū)分布差異較大。宣恩地區(qū)在2017—2019年未出現(xiàn)過，2020年才檢測到含有AVRPia的菌株，總比例為6.1%；柏楊和來風(fēng)地區(qū)相對來說AVR-Pia出現(xiàn)較多，4年中有三年和兩年檢測到AVRPia，比例分別為14.6%、14.6%；賀家坪、野三關(guān)只在2018年出現(xiàn)過含有AVR-Pia的菌株，所占比例分別為3.1%、15.8%；忠路只在2017年出現(xiàn)1株含有AVR-Pia的菌株，所占比例為3.2%；而咸豐、建始、鶴峰未檢測到含有AVR-Pia的稻瘟病菌，表明無毒基因AVR-Pia在鄂西南地區(qū)和稻瘟病菌群體中的分布差異較大，且出現(xiàn)率較小。宣恩柏楊呈現(xiàn)出增多的趨勢，而其他地區(qū)正在出現(xiàn)與消失的邊緣往復(fù)（圖2）。

圖1 PCR擴增無毒基因AVR-Pia電泳圖譜

圖2 2017—2020年各地區(qū)含有AVR-Pia稻瘟病菌數(shù)的變化

表4 稻瘟病菌無毒基因AVR-Pia PCR擴增結(jié)果

2.2 抗性基因Pia的有效性

將2017—2020年分離的661株稻瘟病菌單孢菌株，制備孢子懸液后分別噴霧接種在IRBLa-A和麗江新團黑谷三葉期的葉片上。結(jié)果顯示661株稻瘟病菌均能侵染感病對照，對含有單抗性基因Pia的IRBLa-A致病率達到86.2%。2017年稻瘟病菌群體中，宣恩、柏楊、建始、太平、忠路、賀家坪對IRBLa-A有致病性的菌株分別為16、22、22、5、6、18株，所占比例分別為94.1%、80.0%、81.5%、83.3%、85.7%、100%，總致病率為84.0%。2018年稻瘟病菌群體中，咸豐、宣恩、柏楊、建始、來鳳、賀家坪、野三關(guān)對單基因系IRBLa-A有致病性的菌株分別為27、14、37、3、7、8、7，所占比例分別為87.1%、77.8%、75.5%、100.0%、53.8%、80.0%、70.0%，總致病率為76.9%；2019、2020年稻瘟病菌群體總致病率分別為88.8%、90.4%，除未分離出稻瘟病菌單孢的地點外，所有地點致病率均大于80%。而2017—2020年間抗性基因Pia有效性呈下降的趨勢（圖3）。表明鄂西南地區(qū)水稻抗性基因Pia抗性逐年下降，且不適合在鄂西南地區(qū)以Pia作為主效抗病基因來育種。

表5 鄂西南地區(qū)2017—2020年稻瘟病菌菌株對水稻抗性基因Pia的致病性

圖3 2017—2020年抗性基因Pia有效性變化

2.3 AVR-Pia變異機理

將能擴出463 bp的特異性條帶的49株稻瘟病菌的PCR產(chǎn)物進行測序，將測序的AVR-PiaCDS序列與已克隆的AVR-Pia序列比對，結(jié)果顯示，49株稻瘟病菌均與已克隆基因序列一致，表明鄂西南地區(qū)無毒基因CDS區(qū)域基因穩(wěn)定，不發(fā)生突變（圖4）。把2017—2018年240株稻瘟病菌的擴增結(jié)果與致病性鑒定結(jié)果結(jié)合分析，31株稻瘟病菌中含有AVR-Pia基因且對含有Pia抗性基因的水稻單基因系IRBLa-A無致病性的菌株有16株，含有AVR-Pia基因且對含有Pia抗性基因的水稻單基因系IRBLa-A有致病性的菌株有15株，利用特異性引物對其基因上游啟動子區(qū)域進行擴增并測序，發(fā)現(xiàn)有7株稻瘟病菌AVR-PiaATG上游109處發(fā)生堿基替換（圖5）。將啟動子序列利用Neurel Network Promoter Prediction軟件進行預(yù)測分析，結(jié)果顯示，具有2個高分值的起始轉(zhuǎn)錄位點（表6）。用PLANTCARE對AVR-Pia基因啟動子序列的順式作用元件進行分析（表7），利用SCPD（酵母啟動子數(shù)據(jù)庫）預(yù)測調(diào)控元件（表8），結(jié)果顯示，堿基替換位點均不在預(yù)測的啟動子與調(diào)控元件中。這個點突變是否與該基因的表達有關(guān)有待進一步研究。

表6 啟動子預(yù)測分析

表7 AVR-Pia基因啟動子順式作用元件

表8 利用SCPD（酵母啟動子數(shù)據(jù)庫）預(yù)測的調(diào)控元件

圖4 無毒基因AVR-Pia CDS序列比對結(jié)果

圖5 無毒基因AVR-Pia啟動子區(qū)域序列比對結(jié)果

3 結(jié)論與討論

鄂西南屬云貴高原與東部低山丘陵的過渡區(qū)域，各地區(qū)海拔不一，且降水充沛，光照溫度等自然條件多樣，具有復(fù)雜的氣候資源，使得水稻品種和稻瘟病菌交互變異，實時檢測鄂西南各地區(qū)稻瘟病菌無毒基因動態(tài)變化及變異，對了解稻瘟病菌的群體遺傳結(jié)構(gòu)、有針對性的聚合育種具有重要的意義。本研究連續(xù)4年從鄂西南地區(qū)9個地點的100個水稻品種采集并分離661株稻瘟病菌單孢菌株，利用PCR技術(shù)對AVR-Pia進行擴增檢測，結(jié)果顯示有49個菌株含有無毒基因AVR-Pia，僅占所有分離菌株的7.4%。2017—2020各年AVR-Pia出現(xiàn)頻率不同，分別為7.5%、16.0%、3.1%、5.0%。9個不同采樣地點只有宣恩、柏楊、來鳳、賀家坪、野三關(guān)、忠路檢測到AVR-Pia，咸豐、建始和太平未檢測到。這些結(jié)果表明無毒基因AVR-Pia在鄂西南地區(qū)稻瘟病菌群體中的出現(xiàn)率較小，分布差異較大，除了柏楊、來鳳和野三關(guān)含有AVR-Pia的稻瘟病菌所占比

例在15%左右，其他地區(qū)均小于7%，說明AVR-Pia不是該區(qū)域的主要無毒基因。對比中國其他地區(qū)稻瘟病菌AVR-Pia的檢出結(jié)果，在中國偏東北方的遼寧省2017—2018年采集的151株稻瘟病菌中，沒有檢測到AVR-Pia[24]，2017年黑龍江省208個稻瘟病菌單孢菌株中，AVR-Pia的出現(xiàn)頻率為16.35%[25]，2018年山東省水稻主產(chǎn)區(qū)分離到的123株稻瘟病菌單孢中，AVR-Pia出現(xiàn)頻率為10.57%[19]，2013—2017年江蘇省分離的621株中，只有9.34%的稻瘟病菌檢測到AVR-Pia，均低于20%；而偏西南地區(qū)的云南省13個地市采集并分離的471株稻瘟病菌單孢中，51.8%菌株含有AVR-Pia[20]，湖南省稻瘟病菌群體中，182株稻瘟病菌中98.8%檢測到AVR-Pia，這些結(jié)果說明不同地區(qū)氣候、海拔等環(huán)境因素，以及各地區(qū)種植水稻品種的差異，導(dǎo)致稻瘟病菌群體中無毒基因的組成以及進化速率存在差異，鄂西南地區(qū)AVR-Pia檢出率與偏東北方的地區(qū)相似。

水稻-稻瘟病菌系統(tǒng)作為典型的基因?qū)蛳到y(tǒng)，水稻的抗瘟性與稻瘟病菌無毒基因密切相關(guān)，兩者共同進化。稻瘟病菌作為真菌病原菌，其無毒基因非常不穩(wěn)定，容易發(fā)生變異，無毒基因的變異使得產(chǎn)生新的致病菌株，其富集導(dǎo)致水稻品種抗瘟性喪失，因此研究稻瘟病菌無毒基因的變異機制可為了解稻瘟病菌群體進化提供理論基礎(chǔ)，以及使水稻抗性時期的延長提供方向。AVR-Pia位于靠近染色體端粒區(qū)域，易發(fā)生變異，王群等[20]對云南省42株稻瘟病菌編碼區(qū)進行測序，未發(fā)現(xiàn)缺失、插入和SNP等變異方式，主要變異方式為基因完全缺失。本研究對2017—2020年稻瘟病菌進行抗性檢測，并結(jié)合基因測序?qū)VR-Pia變異機理進行探討，661株菌株中有86.2%菌株使得含有單抗性基因Pia的IRBLa-A致病，表明稻瘟病菌對含有Pia的水稻品種適應(yīng)性增強，使得Pia抗性逐漸衰退。能擴出特異性條帶的49株菌株序列與已報道AVR-Pia序列CDS區(qū)域一致，表明AVR-Pia在鄂西南地區(qū)基因與云南地區(qū)變異情況相同。對2017—2018年含有AVR-Pia基因且對含有Pia抗性基因的水稻單基因系IRBLa-A有致病性的15株菌株利用特異性引物對其基因上游啟動子區(qū)域進行擴增并測序，發(fā)現(xiàn)有7株稻瘟病菌AVR-Pia ATG上游109 bp處發(fā)生堿基替換，該位點不在生物信息學(xué)預(yù)測的調(diào)控元件上。因此這些菌株中無毒性的喪失需要更深入的研究來證實，例如啟動子區(qū)域的克隆與分析，且有研究表明，不同的無毒菌株中AVR-Pia的拷貝數(shù)不同，同源重組會導(dǎo)致AVR-Pia的缺失[27]，推測無毒基因AVR-Pia無毒性的喪失可能是受拷貝數(shù)的影響，從而影響分泌蛋白的量，從而影響其功能，同時表觀遺傳和蛋白修飾調(diào)控機制也會對稻瘟病菌致病過程產(chǎn)生影響。

鄂西南地區(qū)作為重要的水稻糧食產(chǎn)區(qū)，稻瘟病菌群體組成較復(fù)雜，本研究僅對稻瘟病菌無毒基因AVRPia各地區(qū)的監(jiān)測以及變異機制進行分析，需進一步加強其他無毒基因的監(jiān)測以及變異，可為其將來篩選抗病基因以及合理布局提供參考。