王汗鑫，張 通，張凌峰，于明月，李紅姣

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院/河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點試驗室，河北 保定 071000）

0 引言

桑椹是多年生木本植物桑樹(Morus alba)的成熟果實，有黑、白、紫紅、紫黑和紅色多種顏色，其中紫黑色桑椹是補益上品，鮮食口感較好。由于桑椹含有豐富的氨基酸、維生素、花青素、白藜蘆醇等營養(yǎng)和功能性物質(zhì)，被譽為“第三代水果”[1]。桑椹也被醫(yī)學(xué)界譽為“21世紀(jì)的最佳保健品”[2]。

白藜蘆醇在植物中分布廣泛，至今已在21科31屬的72種植物中發(fā)現(xiàn)了白藜蘆醇，且在一些植物中含量較高，如蓼科植物虎杖，其白藜蘆醇含量高達(dá)干重的0.35%左右[3]。白藜蘆醇具有抗菌消炎[4]、抗脂質(zhì)過氧化[5]、抗衰老[6]等諸多藥理作用，在藥品、保健食品和化妝品等方面有著良好的應(yīng)用前景，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注和深入研究。據(jù)統(tǒng)計，全球每年需要白藜蘆醇的需求量持續(xù)增加，但是生產(chǎn)與需求呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，供不應(yīng)求，開發(fā)利用富含白藜蘆醇的天然植物，優(yōu)化成分分離技術(shù)，為植物成分有效利用和填補白藜蘆醇應(yīng)用市場具有重要意義[7]。目前對葡萄[8]、花生[9]等植物中白藜蘆醇的研究較多。桑椹中富含白藜蘆醇，據(jù)報道白藜蘆醇的含量與桑椹采摘后放置時間有關(guān)[10]，桑椹果實與桑枝中白藜蘆醇含量存在差異[11]。

本研究以不同品種、發(fā)育時期、貯藏方式處理的桑椹樣品為材料，測定桑椹中白藜蘆醇含量的品種差異及動態(tài)變化規(guī)律，旨在為合理利用桑椹中的白藜蘆醇、桑椹的品種識別、品質(zhì)評價、選種育種以及貯藏方法的選擇等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

桑園位于河北省定州市。地勢相對平緩、海拔較低，年均氣溫12.4℃，溫差小，年均日照2611.9 h，年均降水量為503.2 mm，無霜期191天，該地區(qū)四季分明，春秋季節(jié)溫度適宜、干燥，夏季高溫多雨，冬季寒冷少雪。

1.2 試驗材料

1.2.1 桑椹材料選用‘孟簡’、‘白玉王’、‘安椹’、‘龍桑’、‘中椹1號’、‘中椹2號’、‘中椹3號’等7個品種桑椹果實為試驗材料，除‘白玉王’桑椹為乳白色外，其余品種的桑椹均為紫黑色。試驗材料均人工采摘自河北省定州市東勝生態(tài)園內(nèi)桑園。桑樹均為5年生，樹木管理措施一致。果實挑選大小均勻、無病蟲害和機械損傷，從每棵樹的東南西北等不同方位取樣，10棵樹為一小區(qū)，重復(fù)3次。

1.2.2 試劑 乙醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、殼聚糖（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、水楊酸（上海源葉生物科技有限公司）、1-MCP（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、茉莉酸甲酯（北京索萊寶科技有限公司），均為分析純；白藜蘆醇標(biāo)品（上海源葉生物科技有限公司），為色譜純。

1.2.3 儀器 飛鴿TGL-16aR型高速冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）、TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計（北京普析通用儀器廠）、DZRW-5型電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器廠）、FA-N型電子分析天平（上海民僑精密科學(xué)儀器廠）、STARTER 2100 pH計（奧豪斯儀器（上海）有限公司）、RXZ人工智能氣候箱（寧波江南儀器廠）、紫外燈滅菌箱（上海新諾儀器集團(tuán)有限公司）、真空包裝機（得力集團(tuán)有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 白藜蘆醇的測定方法

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密稱取5 mg白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，用60%乙醇溶液溶解并定容至50 mL，即濃度為0.1 mg/mL的白藜蘆醇溶液。再用60%乙醇溶液將該溶液稀釋成濃度依次為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)液。

取0.5 mL不同濃度的白藜蘆醇溶液，加入60%乙醇溶液定容至10 mL測定OD305，橫坐標(biāo)為白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，縱坐標(biāo)為OD305，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸方程的計算。

（2）樣品中白藜蘆醇的測定。準(zhǔn)確稱取桑椹樣品0.2 g，在研缽中充分研磨，按料液比1:15加入60%乙醇溶液混勻避光；60℃水浴加熱1 h，過濾后，7000 r/min離心10 min，取得上清液；取上清液0.5 mL，用60%乙醇溶液稀釋10倍，305 nm波長下測得吸光度，根據(jù)白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線計算白藜蘆醇的含量。

1.3.2 桑椹中白藜蘆醇的品種差異 選用‘孟簡’、‘白玉王’、‘安椹’、‘龍?！?、‘中椹 1 號’、‘中椹 2 號’、‘中椹3號’等7個品種桑椹果實為試驗材料。采摘每個品種成熟桑椹樣品，液氮速凍后帶回試驗室，-80℃貯藏備用，用于測定不同品種桑椹中白藜蘆醇的含量。

1.3.3 桑椹果實不同發(fā)育時期白藜蘆醇含量的變化規(guī)律選用‘孟簡’、‘白玉王’、‘安椹’、‘龍?！ⅰ虚?號’、‘中椹2號’、‘中椹3號’等7個品種桑椹果實為試驗材料。桑椹的生長發(fā)育進(jìn)程分為坐果期、綠熟期、成熟前期、成熟期4個時期。分別于2019年4月23日（坐果期，坐果率95%以上）、5月3日（綠熟期；白色品種果實已經(jīng)顯著膨大，但是仍為綠色，即將開始變成白色，多數(shù)呈現(xiàn)黃綠色；紫黑色品種果實已經(jīng)顯著膨大，但是仍為綠色，即將開始變成紅色）、5月13日（成熟前期；白色品種果實呈現(xiàn)白色，少數(shù)顏色發(fā)黃，外果皮有韌性，果柄柔韌呈嫩綠色，入口酸甜；紫黑色品種果實已經(jīng)變成紅色甚至紫紅色，外果皮有韌性，果柄柔韌呈嫩綠色，入口酸甜）、5月23日（成熟期；外果皮柔軟，極易破損，果柄干枯或脫落，白色品種果實呈現(xiàn)乳白色，紫黑色品種果實呈深紫黑色，口感甘甜多汁、入口即化）[12]的早晨進(jìn)行人工采摘，樣品采摘后液氮速凍帶回試驗室，-80℃貯藏備用，用于測定不同物候期桑椹中白藜蘆醇的含量。

1.3.4 不同貯藏方式對桑椹中白藜蘆醇含量的影響 選擇的桑椹品種為‘中椹1號’（紫黑色品種）、‘白玉王’（白色品種）。選擇成熟前期和成熟期的果實，將樣品采摘后用冰盒迅速帶回試驗室，挑選健康、無機械傷的果實進(jìn)行不同貯藏條件的處理。

（1）常溫(24℃)貯藏：將采摘回來的桑椹樣品放在室溫下進(jìn)行貯藏，每2天取樣1次，直到50%以上果實腐爛為止。

（2）4℃冷藏：將采摘回來的桑椹樣品放入4℃冰箱內(nèi)冷藏。每2天取樣1次，直到50%以上果實腐爛為止。

（3）自發(fā)氣調(diào)貯藏：將樣品放入密封袋子，再放入4℃恒溫培養(yǎng)箱中保存。每2天取樣1次，直到50%以上果實腐爛為止。

（4）減壓（真空）貯藏：將樣品放入密封袋內(nèi)抽出空氣使袋子內(nèi)呈現(xiàn)真空狀態(tài)再放入4℃恒溫培養(yǎng)箱中保存，每2天取樣1次，直到50%以上果實腐爛為止。

（5）紫外照射貯藏：將樣品在紫外燈(≥300 lx)下照射10 min后放入4℃恒溫培養(yǎng)箱中保存，每2天取樣1次，直到50%以上果實腐爛為止。

（6）殼聚糖涂膜貯藏：將樣品在1%殼聚糖溶液中浸泡涂膜浸泡1 min后取出，迅速瀝干后放入4℃恒溫培養(yǎng)箱中保存，每2天取樣1次，直到50%以上果實腐爛為止。

（7）水楊酸涂膜貯藏：將樣品在1%水楊酸溶液中浸泡涂膜浸泡1 min后取出，迅速瀝干后放入4℃恒溫培養(yǎng)箱中保存，每2天取樣1次，直到50%以上果實腐爛為止。

（8）1-MCP熏蒸貯藏：將樣品放在密閉的氣調(diào)箱內(nèi)，用1 μL/L 1-MCP溶液在4℃下熏蒸24 h，再將樣品放入4℃恒溫培養(yǎng)箱保存樣品，每2天取樣1次，直至50%以上果實腐爛為止。

（9）茉莉酸甲酯熏蒸貯藏：將樣品放入密閉的氣調(diào)箱內(nèi)，用1 μmol/L茉莉酸甲酯溶液在4℃下熏蒸24 h，再將樣品放入4℃恒溫培養(yǎng)箱中保存，每2天取樣1次，直到50%以上果實腐爛為止。

預(yù)試驗結(jié)果表明，成熟期桑椹在常溫貯藏、4℃冷藏和紫外照射貯藏時，在2天后均出現(xiàn)多數(shù)腐爛的現(xiàn)象，而桑椹為呼吸躍變型果實，1-MCP和茉莉酸甲酯熏蒸處理對成熟前期果實腐爛的抑制效果要好于成熟期果實，并且在熏蒸的過程中成熟期桑椹已經(jīng)出現(xiàn)了大量腐爛的現(xiàn)象，因此，在后續(xù)的試驗中，對成熟期桑椹貯藏方式的設(shè)置僅選擇了自發(fā)氣調(diào)貯藏、減壓貯藏、殼聚糖涂膜貯藏、水楊酸涂膜貯藏4種。

將每種貯藏方式取出的樣品液氮速凍后，放入-80℃冷凍設(shè)備中備用，用于測定不同貯藏條件下桑椹中白藜蘆醇的含量。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 所有試驗重復(fù)4次，用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，使用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑椹中白藜蘆醇的品種差異

不同品種桑椹中白藜蘆醇含量差異如圖1所示。在相同栽培條件及氣候條件下，不同品種間白藜蘆醇含量存在一定差異，紫黑色桑椹果實白藜蘆醇含量高于白色果實，‘中椹1號’與‘中椹3號’中白藜蘆醇含量顯著高于其他品種，這2個品種之間白藜蘆醇含量沒有顯著差異(P＞0.05)。

圖1 成熟期桑椹中白藜蘆醇含量差異

2.2 不同發(fā)育時期桑椹中白藜蘆醇含量的變化規(guī)律

不同發(fā)育時期桑椹果實白藜蘆醇的含量變化規(guī)律如圖2所示，桑椹中白藜蘆醇含量隨著發(fā)育時期的變化整體均呈現(xiàn)下降趨勢。其中，‘孟簡’坐果期白藜蘆醇含量顯著(P＜0.05)高于其他發(fā)育時期，果實成熟前期與成熟期白藜蘆醇含量差異不顯著；‘白玉王’和‘龍?！?個發(fā)育時期白藜蘆醇含量存在顯著差異(P＜0.05)，以坐果期白藜蘆醇含量最高；‘安椹’、‘中椹1號’、‘中椹2號’和‘中椹3號’坐果期和綠熟期白藜蘆醇含量顯著高于(P＜0.05)其他時期，這2個時期之間白藜蘆醇含量差異不顯著。表明各桑椹品種中白藜蘆醇含量隨發(fā)育時期的變化而發(fā)生變化，所測7個品種白藜蘆醇合成集中于發(fā)育初期。試驗材料中‘孟簡’、‘白玉王’、‘安椹’、‘龍?！?個品種在整個發(fā)育階段坐果期白藜蘆醇含量最高，‘中椹1號’、‘中椹2號’、‘中椹3號’3個品種在整個發(fā)育階段綠熟期白藜蘆醇含量最高，但均與坐果期沒有顯著差異。因此，為合理利用桑椹中的白藜蘆醇，應(yīng)選擇適宜的發(fā)育時期對不同品種桑椹進(jìn)行合理采收。

圖2 不同發(fā)育時期桑椹中白藜蘆醇含量變化

2.3 不同貯藏方式對桑椹中白藜蘆醇含量的影響

桑椹屬于呼吸躍變型果實，果實采摘后極易腐爛，果實中有效化學(xué)成分也發(fā)生較大變化，不同的貯藏方式對果實的貯藏效果影響有差異。

2.3.1 成熟前期‘中椹1號’常溫、4℃冷藏處理、減壓貯藏和茉莉酸甲酯熏蒸等處理均使白藜蘆醇的含量有所上升，但常溫、4℃冷藏處理在6月3日之后桑果50%以上腐爛，不再取樣，殼聚糖涂膜處理使白藜蘆醇含量先上升后下降，紫外照射使白藜蘆醇含量先下降后上升，自發(fā)氣調(diào)使白藜蘆醇含量呈下降趨勢，1-MCP和水楊酸涂膜處理的貯藏過程中，白藜蘆醇含量波動變化無明顯規(guī)律（圖3）。隨著貯藏時間的延長，在4℃冷藏、減壓貯藏、殼聚糖涂膜貯藏及茉莉酸甲酯熏蒸貯藏等貯藏方式下白藜蘆醇含量上升，說明在后熟的過程中白藜蘆醇合成仍在繼續(xù)，所以綜合考慮貯藏時間和白藜蘆醇含量，4℃冷藏、減壓貯藏、殼聚糖涂膜貯藏及茉莉酸甲酯熏蒸貯藏為合適的貯藏方式。

圖3 不同貯藏條件下成熟前期‘中椹1號’桑椹中白藜蘆醇含量的變化規(guī)律

2.3.2 成熟前期‘白玉王’常溫貯藏過程中，白藜蘆醇含量呈下降趨勢，4℃貯藏、自發(fā)氣調(diào)條件貯藏、殼聚糖涂膜貯藏和水楊酸涂膜貯藏條件下白藜蘆醇含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，紫外輻射處理使白藜蘆醇含量先下降后上升，減壓貯藏白藜蘆醇含量無明顯變化規(guī)律，1-MCP熏蒸條件下白藜蘆醇含量隨時間延長呈現(xiàn)波動變化，茉莉酸甲酯熏蒸貯藏過程中白藜蘆醇含量隨時間延長呈現(xiàn)波動變化沒有一定規(guī)律（圖4）。要對成熟前期‘白玉王’中白藜蘆醇進(jìn)行合理的提取利用，可以選擇的貯藏方式有殼聚糖涂膜貯藏及水楊酸涂膜貯藏。

圖4 不同貯藏條件下成熟前期‘白玉王’中白藜蘆醇含量的變化

2.3.3 成熟期‘中椹1號’減壓貯藏過程中白藜蘆醇含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，自發(fā)氣調(diào)條件貯藏過程中白藜蘆醇含量呈現(xiàn)先下降后上升，殼聚糖涂膜貯藏過程中白藜蘆醇含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，水楊酸涂膜貯藏過程中白藜蘆醇含量呈現(xiàn)波動變化且沒有一定規(guī)律（圖5）。要對成熟期‘中椹1號’中白藜蘆醇進(jìn)行合理的提取利用，可以選擇的貯藏方式為減壓貯藏。

圖5 不同貯藏條件下成熟期‘中椹1號’中白藜蘆醇含量的變化

2.3.4 成熟期‘白玉王’減壓貯藏過程中‘白玉王’白藜蘆醇含量隨時間的延長呈下降趨勢，自發(fā)氣調(diào)過程中白藜蘆醇含量隨時間延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，殼聚糖涂膜及水楊酸涂膜貯藏過程中白藜蘆醇含量隨貯藏時間延長呈現(xiàn)波動變化（圖6）。

圖6 不同貯藏條件下成熟期‘白玉王’中白藜蘆醇含量的變化

不同貯藏方式對于桑椹中白藜蘆醇含量的變化較為復(fù)雜，可以選擇常溫、減壓及茉莉酸甲酯熏蒸貯藏成熟前期‘中椹1號’對白藜蘆醇進(jìn)行提取利用；選擇殼聚糖涂膜和水楊酸涂膜貯藏成熟前期‘白玉王’對白藜蘆醇進(jìn)行提取利用；選擇減壓貯藏成熟期‘中椹1號’對白藜蘆醇進(jìn)行提取利用；選擇自發(fā)氣調(diào)條件貯藏成熟期‘白玉王’對白藜蘆醇進(jìn)行提取利用。

3 結(jié)論

同一發(fā)育時期內(nèi)不同品種、不同發(fā)育時期同一品種的桑椹中白藜蘆醇含量存在差異。成熟期的桑椹，‘中椹1號’白藜蘆醇含量最高；不同的發(fā)育時期，綠熟期‘中椹1號’、‘中椹2號’、‘中椹3號’中白藜蘆醇含量最高，坐果期‘孟簡’、‘白玉王’、‘安椹’、‘龍?！邹继J醇含量最高。自發(fā)氣調(diào)、減壓處理、紫外照射、殼聚糖涂膜、水楊酸涂膜浸泡、1-MCP熏蒸及茉莉酸甲酯熏蒸等貯藏方式均可以有效延長桑椹的貯藏時間，茉莉酸甲酯熏蒸、殼聚糖涂膜、減壓貯藏和自發(fā)氣調(diào)等處理方式可以有效保持白藜蘆醇的含量。

4 討論

植物中成分含量變化與品種有密切關(guān)系。白藜蘆醇是植物遭到逆境刺激后體內(nèi)產(chǎn)生的一種抗毒素[13]，是桑椹中重要的次生代謝產(chǎn)物。本研究表明同一物候期不同品種桑椹中白藜蘆醇含量存在一定差異‘，中椹1號’等紫黑色品種中白藜蘆醇含量高于白色品種中白藜蘆醇含量，可能的原因是白藜蘆醇含量受到相關(guān)合成酶活性（如PAL活性）的影響。以不同品種的葡萄為原料測定白藜蘆醇的含量，發(fā)現(xiàn)不同的葡萄品種、不同的組織部位中白藜蘆醇含量有差別[14]，同一發(fā)育時期不同品種釀酒葡萄中白藜蘆醇含量也存在差異，白色品種含量低于有色品種，原因是成熟期有色品種中白藜蘆醇合成關(guān)鍵酶PAL活性高于白色品種中PAL活性[15]，與本研究結(jié)果一致。

果實中有效成分含量變化受物候期的影響較大。Liu等[16]的研究表明，桃總酚含量在成熟過程中呈現(xiàn)不斷下降趨勢，品種間含量存在差異，并且在成熟期總酚抗氧化活性與總酚的含量呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)隨著桑椹果實發(fā)育時期的變化白藜蘆醇含量也發(fā)生變化。桑椹坐果期和綠熟期桑椹中白藜蘆醇含量相對于成熟期較高，可能的原因是在桑椹發(fā)育初期果實中白藜蘆醇合成相關(guān)酶比較活躍，使白藜蘆醇得到積累。張燕等[17]以釀酒葡萄漿果為原料測定不同發(fā)育時期相關(guān)酶活性對白藜蘆醇含量的影響，表明釀酒葡萄漿果中白藜蘆醇含量在膨大期和始熟期達(dá)到峰值，原因是在釀酒葡萄漿果的膨大期和始熟期PAL、RS等相關(guān)酶活性高促使白藜蘆醇含量積累[18]。坐果期和綠熟期白藜蘆醇含量高但是單果重低，成熟前期和成熟期白藜蘆醇含量低但是單果重，應(yīng)綜合考慮產(chǎn)量和白藜蘆醇含量確定最適的采收期，在后續(xù)研究中會有所涉及。

不同貯藏條件對果實中有效化學(xué)成分的含量也有較大影響。茉莉酸甲酯在果實的貯藏過程中得到廣泛應(yīng)用[19]。茉莉酸甲酯處理在減少果膠減重、腐壞、硬度、果汁含量、抑制果膠甲基酯酶和纖維酶活性方面效果顯著。Liu等[20]研究表明，茉莉酸甲酯熏蒸處理使櫻桃番茄果實采后類胡蘿卜素和抗壞血酸含量顯著提高。本研究中成熟前期‘中椹1號’優(yōu)選茉莉酸甲酯熏蒸貯藏，有利于對桑椹中白藜蘆醇進(jìn)行合理利用，同時可以有效延長桑椹貯藏時間，可能的原因是茉莉酸甲酯熏蒸調(diào)動了桑椹中白藜蘆醇合成相關(guān)酶的活性，促進(jìn)了白藜蘆醇的合成，抑制呼吸躍變型果實桑椹中乙烯的釋放，延緩了桑椹的衰老進(jìn)程，有相似研究證明茉莉酸甲酯可以延長果實貯藏時間[21]。

殼聚糖涂膜能有效降低果實的呼吸速率，延長果實的貯藏期[22]。Adriana Pavinatto等[23]研究表明殼聚糖涂膜能提高草莓對真菌的抵抗能力從而保持草莓果實品質(zhì)。此外，殼聚糖對草莓果實的影響主要是果膠代謝酶，特別是果膠甲基酯酶的軟化抑制作用[24]。殼聚糖涂膜處理成熟前期‘白玉王’能有效延長桑椹貯藏時間，可能原因是殼聚糖在桑椹表面形成保護(hù)膜，促生了果實內(nèi)部低氧高二氧化碳的微環(huán)境，有效抑制了果實的呼吸代謝速率，從而延緩果實了的軟化進(jìn)程，進(jìn)而延長了貯藏時間[25]。

Zhang等[26]研究表明自發(fā)氣調(diào)能有效調(diào)節(jié)石榴果皮活性氧代謝的各項指標(biāo)，維持果實正常的生理活動，延緩組織細(xì)胞的成熟和衰老。成熟期‘白玉王’優(yōu)選自發(fā)氣調(diào)貯藏有效延長了桑椹貯藏時間，原因可能是自發(fā)氣調(diào)調(diào)節(jié)了成熟期‘白玉王’的呼吸作用及其生理活動。