唐 彬 ，萬長春，宗壽洋，胡嘉波

（1.金湖縣人民醫(yī)院，江蘇金湖 211600；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

外周神經(jīng)組織氧化應(yīng)激的發(fā)生是周圍神經(jīng)病變的重要致病因素，氧化應(yīng)激參與了神經(jīng)損傷、毒性病變的發(fā)展過程。氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的大量氧自由基可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷, 包括DNA 損傷、胞內(nèi)Ca2+釋放、蛋白質(zhì)破壞、脂質(zhì)過氧化、營養(yǎng)因子喪失或異常等過程，通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號并最終引起神經(jīng)元凋亡或壞死[1]。研究表明[2-3]，氧化應(yīng)激在神經(jīng)元損傷中起到了關(guān)鍵作用。但在正常生理過程中，活性氧、活性氮等自由基能夠促進神經(jīng)元生存，維持其生理功能。因此，及時清除有害自由基及抑制細胞凋亡對于神經(jīng)元損傷的治療具有重要意義。神經(jīng)干細胞可通過旁分泌效應(yīng)發(fā)揮治療作用，如釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等[4]。微囊泡（microvesicles）是由細胞分泌的一種微小膜性結(jié)構(gòu)，可攜帶母細胞來源的活性物質(zhì)，具有攜帶大量基因及蛋白質(zhì)、低免疫原性等特點[5-6]。本實驗通過建立大鼠背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion, DRG）神經(jīng)元H2O2氧化應(yīng)激損傷模型,研究神經(jīng)干細胞微囊泡（neural stem cell microvesicles, NSC-MVs）對大鼠DRG 神經(jīng)元活力及凋亡的影響,并試圖探尋其機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取第6 至8 代神經(jīng)干細胞進行培養(yǎng)，提取微囊泡。選擇新生SD 大鼠，SD 新生鼠購于江蘇大學(xué)動物實驗中心，實驗遵循江蘇大學(xué)倫理委員會規(guī)范，許可證號：SCXK 2018-0012。提取新生鼠DRG 神經(jīng)元進行培養(yǎng)、鑒定。

1.2 儀器與試劑 Neurobasal 培養(yǎng)液，DF12，胰酶，胎牛血清，B27（美國Gibco 公司）。重組人堿性成纖維生長因子（bFGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）、重組人表皮生長因子（EGF）、非必需氨基酸（NEAA）（美國PeproTech 公司）。兔抗大鼠cleaved caspase 3，cleaved caspase 9 一抗、LDH 檢測試劑盒（沈陽萬類生物科技有限公司）。β-tubulin Ⅲ（美國Abcam 公司）。兔抗大鼠Bcl-2，Bax 一抗（美國Affinity 公司）。山羊抗兔二抗（碧云天生物技術(shù)有限公司）。DAPI，BCA 蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。流式試劑盒（美國BD 公司）。電泳儀（美國Bio-Rad 公司）。倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）。馬爾文Nanosight NS300 納米顆粒跟蹤分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 NSC-MVs 提?。荷窠?jīng)干細胞由胚胎干細胞分化所得[7]。培養(yǎng)于含B27，bFGF，EGF，NEAA的DF12 培養(yǎng)液中，置于5ml/dl CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱。當細胞匯合度達到80%時，將原培養(yǎng)液更換為DF12 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集細胞上清。將收集的上清以2 000 g 轉(zhuǎn)速離心30 min，以去除細胞碎片。隨后以100 000 g 超速離心2h，棄上清，PBS 重懸后以相同條件進行二次離心。100μl PBS重懸，BCA 法測定蛋白濃度，置于-80℃保存。

1.3.2 大鼠DRG 神經(jīng)元培養(yǎng)：將DRG 從新生鼠脊髓椎間孔取出，用眼科剪將神經(jīng)節(jié)剪成0.5mm3碎塊，置于胰酶中消化20 min。胎牛血清終止消化后將解離的DRG 神經(jīng)元放置在多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中加入Neurobasal 培養(yǎng)液，2mmol/L L-谷氨酰胺，100 U/ml 青-鏈霉素，10 μmol/L 阿糖胞苷和2% B27。24 h 后更換1 次培養(yǎng)液，此后每3 天更換1 次。

1.3.3 微囊泡電鏡及粒徑分析：取10μl 微囊泡懸液于200目銅網(wǎng)上，靜置10 min后吸去多余液體, 3%鎢磷酸負染，5 min 后吸去多余鎢磷酸, 80kV 電壓下通過透射電子顯微鏡進行觀察并選取合適視野拍照記錄。PBS 稀釋微囊泡至800 ～1 000 ml，取稀釋后的樣本，進樣3 次，每次30 s。使用NTA2.3軟件進行數(shù)據(jù)分析，通過手動快門和增益調(diào)整對樣本進行分析，快門速度為15 或30ms，相機增益在280 ～560 之間。

1.3.4 神經(jīng)元免疫熒光：吸凈培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞1 次。4g/dl 多聚甲醛室溫固定30 min 后PBS 洗滌細胞3 次，每次5 min。使用0.1g/dl Triton X-100 室溫作用10 min，PBS 洗滌1 次。1 g/dl BSA 封閉30 min，加兔抗鼠β-tubulin Ⅲ單克隆抗體（1∶100），濕盒中4℃孵育過夜。PBS 洗滌3 次，加對應(yīng)熒光二抗孵育1h，DAPI 復(fù)染5 min，抗熒光淬滅封片劑進行封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.5 細胞活力檢測：DRG 神經(jīng)元（1×106/孔）接種于96 孔板，培養(yǎng)7 天后進行H2O2損傷處理，按照前述方法進行MTT 測定[8]。波長490 nm 處酶標儀檢測。確定作用濃度后對DRG 神經(jīng)元進行不同濃度NSC-MVs（100，200 和400 μg/ml）預(yù)處理2 h，H2O2損傷后測定細胞活力。

1.3.6 流式細胞術(shù)：DGR 神經(jīng)元（1×105/孔）接種于24 孔板，培養(yǎng)7 天后通過不同處理分為對照組、H2O2損傷組和NSC-MVs 保護組。胰蛋白酶消化，PBS 重懸。1 000 g 離心5 min 后，依次加入Annexin V 和PI，暗室反應(yīng)15 min。置于冰上，1 h內(nèi)進行流式檢測。

1.3.7 蛋白質(zhì)印跡：將不同組分（對照組、H2O2損傷組和NSC-MVs 保護組）DRG 神經(jīng)元在裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑中裂解，提取總蛋白。采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。在10g/dl 分離膠和5g/dl 濃縮膠中進行電泳。濃縮膠：80 V，30 min；分離膠：110 V，70 min。在350 mA 電流下轉(zhuǎn)膜90 min，5g/dl 脫脂奶粉封閉2 h，然后與一抗β-actin，cleaved caspase3，cleaved caspase 9，Bax，Bcl-2（均1∶1 500）4℃孵育過夜，次日TBST 洗滌4 次，二抗（1∶2 500）孵育1 h，TBST 洗滌后化學(xué)發(fā)光檢測。使用Image J 軟件分析蛋白灰度值，計算蛋白相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 使用GraphPad Prism 7.02 進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Tukey 檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)干細胞形態(tài) 見圖1。倒置顯微鏡觀察神經(jīng)干細胞形態(tài)，神經(jīng)干細胞大小均一，分布均勻，生長狀態(tài)良好，呈典型的玫瑰花環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

2.2 NSC-MVs 電鏡及粒徑分析 見圖2。透射電鏡觀察結(jié)果見圖2A，微囊泡呈茶托形或圓盤狀小囊泡；輪廓清晰，外周可見完整的膜性結(jié)構(gòu)，內(nèi)含低電子密度物質(zhì)。粒徑分析見圖2B，微囊泡直徑分布為40 ～450 nm，較多聚集于100 nm 附近。

2.3 大鼠DRG 神經(jīng)元熒光染色 見圖3。DRG 神經(jīng)元進行免疫熒光染色鑒定：藍色熒光為細胞核團，紅色熒光為神經(jīng)元軸突標記蛋白β-tubulin Ⅲ。

2.4 NSC-MVs 提升DRG 神經(jīng)元活力 將不同濃度H2O2作用于大鼠DRG 神經(jīng)元以建立氧化應(yīng)激損傷模型，MTT 結(jié)果顯示，隨著H2O2濃度的增加，細胞活力逐漸下降。與對照組相比，H2O2濃度為25μmol/L 時，細胞活力下降至84.4%（P＜0.01）。當濃度為50，100，200 μmol/L 時具有顯著性差異，細胞活力分別為73.7%，69.8%，49.5 %（F=127.4，P＜ 0.01），即200μmol/L H2O2處理DRG 神經(jīng)元時，細胞活力降至50%以下，故我們選用200μmol/L 濃度的H2O2進行實驗。在后續(xù)實驗中，經(jīng)濃度為100，200 和400 μg/ml 的NSC-MVs 預(yù)處理的DRG 神經(jīng)元，細胞活力得到明顯提升，細胞活力分別為51.4 %，67.4 %和73.5 %，呈現(xiàn)一定劑量依賴性。當NSC-MVs 濃度為200 μg/ml 時即差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=149.47，P=0.023），后續(xù)選擇200 μg/ml 濃度的NSC-MVs 進行實驗。

2.5 NSC-MVs 抑制DRG 神經(jīng)元凋亡 流式結(jié)果顯示見圖4A。與對照組相比，H2O2損傷組DRG神經(jīng)元凋亡明顯增多，經(jīng)NSC-MVs 處理后，神經(jīng)元凋亡率顯著下降（F=232.8,P＜0.01）。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果見圖4B，相比于對照組，H2O2損傷組cleaved caspase 3，cleaved caspase 9，Bax 蛋白水平明顯上調(diào)（F= 93.75，32.32，59.88，均P＜ 0.05），Bcl-2 明顯下調(diào)（F= 65.43，P＜ 0.05），NSC-MVs逆轉(zhuǎn)了這種趨勢（均P＜0.05）。

圖4 NSC-MVs 對DRG 神經(jīng)元凋亡的影響

3 討論

神經(jīng)干細胞是神經(jīng)系統(tǒng)不同發(fā)育階段的初級祖細胞，具有自我更新和多向分化潛能。可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞，從而為大腦提供大量腦細胞[9]。神經(jīng)干細胞在抑制神經(jīng)炎癥和降低氧化應(yīng)激方面發(fā)揮積極作用，但由于細胞去分化、畸胎瘤形成、免疫排斥反應(yīng)、移植干細胞存活率低等問題限制了神經(jīng)干細胞的臨床應(yīng)用[10-11]。微囊泡是一類由細胞產(chǎn)生和分泌的雙層脂質(zhì)微小膜性結(jié)構(gòu)，存在于循環(huán)系統(tǒng)中，含有來自宿主細胞的多種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA，miRNA 甚至 DNA 等，促進細胞間通訊和調(diào)節(jié)受體細胞功能[12]。

相比于神經(jīng)干細胞，NSC-MVs 則避免了上述缺陷。首先，在動物實驗中，NSC-MVs 可以通過鼻內(nèi)給藥靶向運輸至大腦不同區(qū)域。同時，微囊泡靜脈或鼻內(nèi)給藥導(dǎo)致血栓形成（小血管阻塞）的可能性很小，因為其能夠穿過血腦屏障并通過胞吞作用與質(zhì)膜直接融合或與細胞表面蛋白和細胞黏附分子結(jié)合被轉(zhuǎn)運到腦細胞中[13]。與細胞療法不同，微囊泡不含細胞核，使其在釋放后無法復(fù)制和快速分解，故微囊泡給藥后發(fā)生腫瘤或惡性轉(zhuǎn)化的可能性幾乎為零。微囊泡還具有低免疫原性，隨著新技術(shù)的出現(xiàn)，大規(guī)模生產(chǎn)治療性囊泡前景廣闊[14]。此外，由于微囊泡在-80℃條件下能夠長期保存，在4℃條件下其生物活性能維持數(shù)周，方便儲存和運輸[15]。

目前，基于微囊泡的無細胞治療策略已被廣泛研究。神經(jīng)干細胞是大腦中產(chǎn)生神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的直接細胞來源，這意味著NSC-MVs 可能表現(xiàn)出強大的神經(jīng)源性潛力。YUAN 等[16]數(shù)據(jù)表明，神經(jīng)干細胞衍生的外泌體含有高豐度miR-9，并證實通過轉(zhuǎn)移 miR-9 促進神經(jīng)干細胞的分化。ZHANG 等[17]研究表明，NSC-MVs 促進心肌細胞自噬，抑制細胞凋亡，并最終證實其通過轉(zhuǎn)運熱休克蛋白70 發(fā)揮保護作用。ZHONG 等[18]結(jié)果表明，神經(jīng)干細胞外泌體可以增強脊髓微血管內(nèi)皮細胞的血管生成活性，促進血管生成，減少脊髓腔，并證實通過轉(zhuǎn)移血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）促進微血管再生和組織愈合。這些研究表明神經(jīng)干細胞衍生的微囊泡或外泌體應(yīng)用前景巨大，同時也為我們的研究提供了一些思路。

在本實驗中，當神經(jīng)干細胞匯合度達到80%時，立即更換培養(yǎng)液為DF12 基礎(chǔ)培養(yǎng)液，避免了添加在培養(yǎng)液中細胞因子的干擾，12 h 后收集細胞上清，進行超速離心以提取微囊泡，并對其進行電鏡和粒徑分析。神經(jīng)元體外培養(yǎng)是神經(jīng)元生長分化、軸突再生、神經(jīng)損傷疾病等研究的基礎(chǔ)，以往多采用胎鼠神經(jīng)元進行體外培養(yǎng)，但由于胎鼠孕期不易掌握以及可獲得的神經(jīng)元數(shù)量少等問題[19], 因此我們選擇新生鼠代替胎鼠進行體外培養(yǎng)。本實驗采用含有B27 的Neurobasal 培養(yǎng)液，B27 作為血清替代物，含有多種生長因子，能夠抑制膠質(zhì)細胞生長，促進神經(jīng)元生長。H2O2被廣泛應(yīng)用于氧化應(yīng)激損傷[20-21]，本實驗通過使用不同濃度的H2O2模擬DRG 神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，并最終選擇半數(shù)抑制濃度200μmol/L H2O2進行后續(xù)實驗。

神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷包括DNA 損傷、胞內(nèi)Ca2+釋放、蛋白質(zhì)破壞、脂質(zhì)過氧化、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺失等過程，最終引起神經(jīng)元凋亡或壞死，而凋亡是受促凋亡基因和抑凋亡基因共同調(diào)控的細胞主動死亡的過程。Bcl-2 編碼的蛋白質(zhì)多分布于線粒體外膜和細胞膜內(nèi)表面，作為抗凋亡蛋白，能夠與Bax 前體結(jié)合，改變細胞膜通透性，從而介導(dǎo)細胞色素c 釋放并啟動caspase 9，并通過切割下游凋亡執(zhí)行關(guān)鍵酶caspase 3 觸發(fā)凋亡[22]。綜上所述，其機制可能通過NSC-MVs 調(diào)控Bax/Bcl-2 表達，并激活下游cleaved caspase 9 和cleaved caspase 3，從而抑制神經(jīng)元凋亡。盡管本實驗提供了NSC-MVs 治療神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的依據(jù)，但由于NSC-MVs成分復(fù)雜，我們尚未發(fā)現(xiàn)其中發(fā)揮神經(jīng)保護作用的基因或蛋白以及其進入細胞的具體過程，后續(xù)仍需對其成分進行分析和驗證。