莊乃保，吳 凡，張艷艷，梁 爽，梁延連，蘇宇清，彭 龍

（深圳市血液中心，廣東深圳 518035）

Rh 血型系統(tǒng)是目前已發(fā)現(xiàn)的人類血型系統(tǒng)中最復(fù)雜、最具多態(tài)性的血型系統(tǒng)，其中RhD 抗原具有很強(qiáng)的免疫原性，是最重要的抗原。RhD 血型不合可引起致命的溶血性輸血反應(yīng)和嚴(yán)重的新生兒溶血病[1-2]。RhD抗原有很多變異型，包括弱D（Weak D）、部分D（Partial D）和D 放散型（D-elute，DEL）。許多報(bào)告顯示[3-6]，多種RhD 變異型可引起RhD 陰性受血者的免疫反應(yīng)，RhD 變異型個(gè)體也可被完整的RhD 抗原免疫產(chǎn)生所缺乏的表位對(duì)應(yīng)的抗體。RHD*weak D type 72 等位基因于2007年在中國(guó)人群中首次發(fā)現(xiàn)（GenBank 登記號(hào)：EF103573），隨后僅有個(gè)例報(bào)道[7-10]。本文分析1例RHD*weak D type 72 個(gè)體及其家系血清學(xué)表現(xiàn)和RHD 基因，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 患兒（先證者），女，漢族，4 歲2 個(gè)月，右顳頂部硬下血腫，無輸血史。采集先證者及其父親、母親靜脈血液5 ml 置于EDTA 抗凝管中，4℃保存。本研究經(jīng)深圳市血液中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，文中所涉及患者及其家系均已被告知實(shí)驗(yàn)內(nèi)容并由本人/監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 ID-Incubator 37 SI 保溫箱，ID-Centrifuge 12 SII 臺(tái)式離心機(jī)（ 瑞士Diamed AG 公司）；KA-2200 免疫血液學(xué)用離心機(jī)（日本KUBOTA 公司）；BD FACSCantoTMII 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Bioscience 公司）；FL Auto 顯微鏡細(xì)胞成像儀，ProFlex PCR System（美國(guó)Life technologies 公司）；MAXWELL 16 DNA 提取儀（美國(guó)Promega 公司）；EP-1019 電泳儀（美國(guó)Embitec公司）；FluorChem R 多功能成像分析系統(tǒng)（美國(guó)ProteinSimple 公司）。

ABO 血型正/反定型和RhD 血型檢測(cè)卡（其中抗-D 單抗為L(zhǎng)DM3/175-2）、樣本稀釋液和微柱凝膠低離子抗人球蛋白卡（美國(guó)Bio-rad 公司）；抗-C，抗-c，抗-E，抗-e 單克隆IgM 抗體血型定型試劑、抗-D 單克隆IgG 抗體（MS-26）、抗IgG,Cd3d 抗人球蛋白檢測(cè)試劑（上海血液生物公司）；抗-D IgM+IgG 血型定型試劑（175-2/D415 1E4）（加拿大Dominion 公司）；anti-D（TH-28/MS-26）（英國(guó)Millipore 公司）；熒光素FITC 標(biāo)記抗體羊抗人IgG（美國(guó)Jackson Immuno Research公司）；DNA 提取試劑盒（美國(guó)Promega 公司）；人類紅細(xì)胞RhD 基因分型試劑盒（天津市秀鵬公司）。

1.3 方法

1.3.1 ABO 及Rh 血型檢測(cè)：采用ABO 血型正/反定型和RhD 血型檢測(cè)卡檢測(cè)先證者及其父母ABO和RhD 血型；采用單克隆IgM 抗體鑒定RhCcEe抗原。

1.3.2 先證者RhD 抗原檢測(cè)：采用三種不同生產(chǎn)廠家的抗-D 定型試劑，使用試管間接抗球蛋白法（IAT）和微柱凝膠卡抗人球蛋白法進(jìn)一步檢測(cè)先證者RhD 抗原。顯微鏡觀察試管IAT 法凝集情況。1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)先證者RhD 抗原：200μg/ml 的抗-D 單克隆IgG 抗體100 μl 與1%樣本紅細(xì)胞生理鹽水懸液50 μl 混合于微孔板中，37℃孵育30 min。空白對(duì)照孔加生理鹽水100μl 與1%洗滌O 型RhD 陽性紅細(xì)胞懸液50 μl 混合；陰性對(duì)照孔加200 μg/ml 的抗-D 單克隆IgG 抗體100 μl 與1%洗滌O 型RhD 陰性紅細(xì)胞懸液50 μl 混合；陽性對(duì)照孔加 200μg/ml 的抗-D 單克隆IgG 抗體100 μl 與1%洗滌O 型RhD 陽性紅細(xì)胞懸液50 μl混合。生理鹽水洗滌3 次，加入10 μg/ml 熒光素FITC 標(biāo)記抗體羊抗人IgG 100 μl/孔，37℃避光孵育30 min。生理鹽水洗滌3次，最后一次洗滌后扣干，加生理鹽水300 μl/孔稀釋。流式細(xì)胞儀檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度。

1.3.4 基因組DNA 提取、PCR 擴(kuò)增及RHD 基因分型：取300 μl 全血加入Blood DNA Purification Kit DNA 提取試劑盒樣本槽中，采用MAXWELL 16 DNA 提取儀自動(dòng)化提取全血DNA。每份DNA溶于300μl DNA buffer。測(cè)定所提取的DNA 濃度，低于2 ng/μl 的DNA 不能用于以下實(shí)驗(yàn)。使用人類紅細(xì)胞RhD基因分型試劑盒，采用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物技術(shù)（PCR-SSP）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件：96℃預(yù)變性2 min ；然后96℃變性20 s，68℃退火1 min，循環(huán)5 次；96℃變性20 s，65℃退火50 s，72℃延伸45 s，循環(huán)10 次；96℃變性20 s，62℃退火50 s，72℃延伸45 s，循環(huán)18 次；最后72℃延伸5 min，降溫至4℃完成擴(kuò)增。2.5g/dl 的瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.3.5 RhD 雜合型分析：RHD 基因的兩端存在兩個(gè)具有98.6%同源性的區(qū)域，即Rh 盒子序列。當(dāng)RHD 基因全缺失時(shí)，兩端Rh 盒子融合為融合盒子。若樣本可檢出融合盒子，說明至少存在一條染色體RHD 基因全缺失。根據(jù)此原理特異性擴(kuò)增Rh 融合盒子，判斷先證者及其父母是否存在RHD 基因的缺失，由天津秀鵬生物技術(shù)有限公司完成。

1.3.6 RHD 基因編碼區(qū)序列分析：測(cè)定RHD 基因的10 個(gè)外顯子序列，將測(cè)序結(jié)果與參比序列Genebank BN000065 進(jìn)行比對(duì)。引物合成和測(cè)序均由天津秀鵬生物技術(shù)有限公司完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用IBM SPSS Statistics 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析平均熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血型血清學(xué)檢測(cè) 見圖1，圖2。ABO 血型正/反定型和RhD 血型檢測(cè)卡顯示先證者為A 型RhDCcee，其母親為A 型RhDCcee，父親為O 型RhDCCee。先證者RhD 血型檢測(cè)卡以及三種不同生產(chǎn)廠家抗-D 定型試劑微柱凝膠卡抗人球蛋白法結(jié)果均表現(xiàn)為部分凝集，顯微鏡觀察間接抗球蛋白法結(jié)果為混合視野外觀。

圖1 先證者ABO 及RhD 血型微柱凝膠卡檢測(cè)結(jié)果

圖2 先證者RhD 血型試管IAT 法顯微鏡觀察結(jié)果

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)先證者RhD 抗原 見圖3。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照平均熒光強(qiáng)度分別為159.0±27.9，241.7±15.6，19 380.3±160.2（n=3）。先證者RhD抗原平均熒光強(qiáng)度為1 247.0±217.2（n= 3），分別與空白對(duì)照（t=9.320，P=0.011）、陰性對(duì)照（t=8.416，P=0.014）和陽性對(duì)照（t= -86.170，P=0.000）相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。先證者RhD 抗原性較陽性對(duì)照弱，峰值左移；且峰型變寬，同時(shí)存在陽性和陰性反應(yīng)細(xì)胞。

圖3 先證者RhD 抗原流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

2.3 RHD 基因檢測(cè)及家系調(diào)查 對(duì)照結(jié)果格局圖判斷特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，先證者及其父母PCR-SSP結(jié)果均為RhD 陽性，并排除中國(guó)漢族人群中常見的RHD*weak partial 15，RHD*DVI.3，RHD*DEL1等RhD 變異型。先證者及其母親均檢出Rh 融合盒子，說明存在一條染色體RHD 基因全缺失。先證者父親融合盒子檢測(cè)為陰性，說明不存在RHD 基因全缺失。見圖4。經(jīng)RHD 基因編碼序列分析發(fā)現(xiàn)，先證者RHD 基因第9 外顯子上的第1212 位堿基發(fā)生C ＞A 純合突變，其父親RHD 基因第 9外顯子上的第1212 號(hào)堿基發(fā)生了C ＞A 的雜合突變，其母親RHD 基因10 個(gè)外顯子未檢測(cè)到突變。RHD 基因第9 外顯子第1212 位堿基C ＞A 突變?yōu)镽HD*weak D type 72 的特征性突變點(diǎn)。

圖4 先證者及其父母RHD 基因編碼區(qū)序列分析結(jié)果

綜合上述檢測(cè)結(jié)果，家系調(diào)查顯示先證者父親基因型為RHD*weak D type 72 / RHD+；母親基因型為RHD+ / RHD-。先證者RHD 基因第9 外顯子第1212 位堿基C ＞A 突變遺傳自其父親，RHD基因全缺失的染色體遺傳自其母親，其基因型為RHD*weak D type 72 / RHD-。

3 討論

Rh 血型系統(tǒng)是人類血型系統(tǒng)中最為復(fù)雜、最具多態(tài)性的1 個(gè)血型系統(tǒng)，D，C，c，E，e 為主要抗原，其中D 抗原具有很強(qiáng)的免疫原性。臨床上根據(jù)個(gè)體是否存在RhD 抗原分為RhD 陽性和RhD 陰性。RhD 抗原有很多變異體，包括部分D，弱D 和D-elute。一般RhD 陽性個(gè)體紅細(xì)胞膜RhD抗原數(shù)量為10 000 個(gè)左右，弱D 表型為900 個(gè)左右[11]。根據(jù)國(guó)際輸血協(xié)會(huì)（International Society of Blood Transfusion，ISBT）等位基因命名表（table of ISBT allele nomenclature version v5.0. Available at: http://www.isbtweb.org/working-parties/red-cellimmunogenetics-and-blood-groug-terminolter），國(guó)際上已發(fā)現(xiàn)的弱D 型約150 種，其中我國(guó)已發(fā)現(xiàn)35種[10]。RHD*weak D type 72等位基因（c.1212C＞A，p. Asp 404 Glu）于2007年在GenBank 發(fā)布（登記號(hào)：EF103573），隨后被ISBT 命名。2012年，吳筱瑩等[7]在深圳地區(qū)無償獻(xiàn)血者RhD 血型鑒定中發(fā)現(xiàn)1 例RHD*weak D type 72 個(gè)體，該個(gè)體RhCE 表現(xiàn)型為Ccee，常規(guī)鹽水法檢測(cè)RhD 抗原為陰性，IAT檢測(cè)為陽性，表位檢測(cè)結(jié)果則與 RhD 陽性紅細(xì)胞完全一致，提示RHD*weak D type 72 紅細(xì)胞可能不存在 RhD 抗原表位缺失，只表現(xiàn)出 RhD 抗原的分子數(shù)量或抗體反應(yīng)活性顯著下降。2017年，JI 等[8]通過分析中國(guó)南方地區(qū)漢族人群RHD 基因和雜合型發(fā)現(xiàn)1 例RHD*weak D type 72 個(gè)體，該個(gè)體為CcDee 表現(xiàn)型，D-screen 試劑檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)表位缺失，IgM 型抗-D 抗體檢測(cè)呈±～1+強(qiáng)度，IgG 型抗-D抗體檢測(cè)呈2+或4+強(qiáng)度。2019年，ZHANG 等[9]在中國(guó)東北地區(qū)45 例血清學(xué)弱D 型分子結(jié)構(gòu)分析中發(fā)現(xiàn)1 例RHD*weak D type 72 個(gè)體以及1 例RHD*weak D type 72 與RHD*DEL1 雜合個(gè)體，并應(yīng)用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)RHD*weak D type 72 的氨基酸置換位于胞內(nèi)區(qū)。RHD*weak D type 72 等位基因自2007年在中國(guó)人群中首次發(fā)現(xiàn)，至今僅有以上個(gè)例報(bào)道。本研究中先證者RhD 血型經(jīng)基因分型確定為RHD*weak D type 72。采用4 個(gè)不同廠家的抗-D 抗體試劑檢測(cè)先證者樣本，均表現(xiàn)為部分凝集的RhD 陽性結(jié)果。結(jié)合以往的報(bào)道[7-8]，可以判斷RHD*weak D type 72 紅細(xì)胞擁有基本完整的RhD 抗原表位。但對(duì)于該RhD 變異型研究較少，為安全起見，先證者仍應(yīng)視為RhD 陰性受血者，輸注RhD 陰性血液。

然而，以往的研究中未見RHD*weak D type 72血清學(xué)結(jié)果表現(xiàn)為部分凝集的報(bào)道。本研究中，排除操作錯(cuò)誤、自身疾病以及異型紅細(xì)胞輸注史等情況，先證者RhD 血型鑒定經(jīng)多次反復(fù)試驗(yàn)均表現(xiàn)為部分凝集。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)先證者RhD 抗原強(qiáng)度，結(jié)果顯示先證者RhD 抗原性減弱；且先證者樣本峰型變寬，同時(shí)存在陽性和陰性反應(yīng)細(xì)胞，但未見雙峰現(xiàn)象。分析本研究中微柱凝膠卡出現(xiàn)雙群的原因?yàn)椋何⒅z法的工作原理為利用凝膠分子篩篩選，當(dāng)抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)特異性凝集時(shí)，發(fā)生聚集的紅細(xì)胞被攔截在凝膠上層，未反應(yīng)的游離紅細(xì)胞可沉降至凝膠底部。因血型抗原與對(duì)應(yīng)抗體的結(jié)合是一種可逆的過程，RHD*weak D type 72 紅細(xì)胞RhD 抗原與抗-D 抗體結(jié)合強(qiáng)度較弱，在微柱凝膠卡檢測(cè)過程中，當(dāng)離心產(chǎn)生的切應(yīng)力超過抗原抗體結(jié)合的親合力時(shí)，較弱的凝集有可能被分開而出現(xiàn)陰性結(jié)果，強(qiáng)凝集則仍被攔截在凝膠上層。目前，臨床仍常規(guī)采用血清學(xué)方法檢測(cè)RhD 血型[12-13]，本研究中RHD*weak D type 72 表現(xiàn)為部分凝集的血清學(xué)結(jié)果可為臨床上對(duì)于RhD 血型的判斷提供一定的參考，但本研究仍為個(gè)例報(bào)道，對(duì)于RHD*weak D type 72 的血清學(xué)特征仍需更為豐富的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

家系調(diào)查顯示，先證者分別從父親和母親遺傳RHD*weak D type 72 和RHD- 等位基因，其RHD*weak D type 72 等位基因由遺傳獲得，而非由個(gè)體基因變異形成。家系調(diào)查結(jié)果為后續(xù)RHD*weak D type 72 等位基因頻率調(diào)查提供一定的參考意義。