趙佳慧，余 雯

（1．南通市第六人民醫(yī)院檢驗科，江蘇南通 226001；2．南通市崇川區(qū)疾病預防控制中心檢驗科，江蘇南通 226001）

肝硬化是慢性肝病的終末期表現(xiàn)，其中乙型肝炎是肝硬化最常見的病因[1]。腹腔積液是肝硬化最常見的并發(fā)癥，是肝硬化失代償期的重要標志，與感染、腎功能衰竭及病死率增加關系密切。對于難治性腹腔積液，患者病死率大于50%[2]。對于肝硬化患者，在進行病因治療同時，防治腹腔積液并發(fā)癥也是臨床治療的重點。因此，尋找能夠早期診斷肝硬化失代償并發(fā)腹腔積液的血清標志物，對患者的臨床診治意義重大[3]。微小核糖核酸（microRNA,miR）是長度約25 個核苷酸的單鏈RNA 分子，通過靶向抑制靶基因信使RNA 的表達，廣泛參與個體生長、發(fā)育及衰老等過程。miR-25-3p 位于人類7 號染色體，研究發(fā)現(xiàn)[4]，肝硬化失代償患者血清miR-25-3p 異常表達促進急性肝功能衰竭的發(fā)生，是患者生存預后的獨立危險因素。肝硬化失代償時肝功能合成清蛋白的能力明顯降低，血漿膠體滲透壓下降，促使腹腔積液的形成。因此，miR-25-3p 可能與肝硬化失代償并發(fā)腹腔積液的發(fā)生發(fā)展有關。整合素結合唾液蛋白 (integrin binding sialoprotein，IBSP)編碼基因位于4 號染色體，屬于整合素結合配體 N 端糖基化蛋白家族成員，在激活自然殺傷細胞、中性粒細胞和巨噬細胞中起關鍵作用[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)[7]，IBSP 在肝硬化患者血清表達升高，可能是一種新的反映肝臟纖維化及門靜脈高壓程度的血清標志物。本研究通過檢測血清miR-25-3p,IBSP 蛋白表達水平，探討兩者在不同臨床特征患者中的水平差異和對肝硬化失代償并發(fā)腹腔積液的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2018年5月～2019年5月南通市第六人民醫(yī)院診治的乙型肝炎肝硬化患者120例為肝硬化組，納入標準：①診斷標準參考《慢性乙型肝炎防治指南》[8]；②近三月無保護肝功能及肝臟疾病治療史。③患者無心肺等臟器功能衰竭。排除標準：①伴肝細胞肝癌。②并發(fā)其它類型病毒性肝炎、免疫性肝病及酒精性肝病。③并發(fā)其他器官系統(tǒng)的惡性腫瘤。其中男性66 例，女性54 例；年齡33 ～70（45.2±7.2）歲；代償期68 例，失代償期52 例；肝纖維化程度：輕度39 例，中度46 例，重度35 例；無腹腔積液65 例，有腹腔積液55 例；肝硬化伴消化道出血26 例。參考《肝硬化腹腔積液及相關并發(fā)癥診療指南》[9]，進一步將肝硬化組分為失代償并發(fā)腹腔積液組（47 例）和非失代償并發(fā)腹腔積液組（73 例）。以同期診治的慢性乙型肝炎患者80 例為肝炎組，男性45 例，女性35 例，年齡34 ～69（44.2±7.6）歲。以同期門診健康體檢者60 例為對照組。男性33 例，女性27 例，年齡33 ～67（45.1±7.7）歲。三組在性別、年齡間差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準通過。

1.2 儀器與試劑 人整合素結合唾液蛋白酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒（賽諾利康生物技術公司，貨號SNL5719），血清總RNA 提取試劑盒（北京索萊寶公司，貨號R1200），微量分光光度計Narodrop 2000（美國賽默飛公司），熒光定量PCR 試劑盒（日本TAKARA 公司，貨號RR091A），全自動生化分析儀（美國Beckman 公司，型號AU5800），DNM-9602G 酶標分析儀（北京普朗新技術有限公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1 血清IBSP 水平：分別用生化促凝管（含凝血酶等促凝劑）和抗凝管（枸櫞酸鈉1 ∶9）留取各組研究對象空腹靜脈血5ml 和2ml，生化促凝管用于分離血清，抗凝管用于凝血指標檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測血清IBSP 水平。實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。待終止反應后，450nm波長依序測量各孔的吸光度值，對應標準曲線，計算出樣品IBSP 濃度。

1.3.2 血清miR-25-3p 水平：按RNA 提取試劑盒說明書提取各組患者血清總RNA，檢測RNA 濃度和純度，合格后取500μg 總RNA 進行逆轉錄，合成cDNA。然后進行熒光定量PCR 反應。miR-25-3p和U6引物序列：miR-25-3p正向：5’CGTGCATAGAC ACAGGGAGTT 3’，反向：5’GGAGGTTACATTCAG CGAT 3’；U6 正向：5’CTGGCATCCGCTGGAGA 3’，反向：5’TTCGGTTGTCGATATTCGGT 3’。反應總體系10μl，cDNA 模板1μl，正反向引物各1μl，Master Mix 5μl，雙蒸水2μl。反應程序：95℃預變性2min，95℃ 變性20s，60℃退火30s，70℃延伸30s，共40 個循環(huán)。miR-25-3p 的表達量以2-ΔΔCt值表示結果。每個樣品重復三次，結果取平均值。

1.3.3 肝功能評分：應用全自動生化分析儀檢測各組人群血清肌酐（creatinine, Cr）、總膽紅素（total bilirubin，TBil）、清蛋白（albumin，Alb）水平。采用凝固法檢測凝血酶原時間（prothrombin time，PT），計算國際標準化比值（international normalized ratio，INR）。

選取肝硬化Child-Pugh 評分、終末期肝病模型評分（model for end stage liver disease，MELD）及清蛋白膽紅素評分（albumin bilirubin score, ALBI）評價肝硬化組患者肝功能狀況。根據(jù)TBil，Alb，PT，腹腔積液和肝性腦病的嚴重程度進行Child-Pugh 評分。MELD ＝3.78×ln[TBil（mg/dl）]＋11.2×ln（INR）＋9.57×ln[ 血肌酐（mg/dl）]＋6.43，ALBI ＝-0.085×Alb（g/L）＋0.66×lg[TBil（μmol/L）]。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件進行分析。對符合正態(tài)分布的計量資料，以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。Pearson 線性相關分析肝硬化患者血清miR-25-3p,IBSP 與肝功能指標的相關性。應用Logistic 回歸分析肝硬化失代償并發(fā)腹腔積液的危險因素。受試者工作曲線（receiver operating curve，ROC）分析血清miR-25-3p, IBSP 對乙型肝炎肝硬化失代償并發(fā)腹腔積液的診斷價值,曲線下面積（aera under curve, AUC）比較采用DeLong's檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組血清miR-25-3p, IBSP 蛋白表達水平比較肝硬化組、肝炎組及對照組血清miR-25-3p 水平分別為5.22±0.41, 1.16±0.34 和0.92±0.32，IBSP蛋白水平分別為9.34±1.28ng/ml, 3.15± 0.37ng/ml和1.02±0.30ng/ml。肝硬化組血清miR-25-3p, IBSP蛋白水平明顯高于肝炎組（t=73.327，42.067,均P＜0.005），肝炎組血清miR-25-3p, IBSP 蛋白水平明顯高于對照組（t=4.238，36.486, 均P＜0.005），差異均有統(tǒng)計學意義。

2.2 肝硬化組血清miR-25-3p,IBSP 蛋白表達水平與臨床參數(shù)的關系 見表1。中重度肝纖維化、消化道出血及腹腔積液的肝硬化患者血清miR-25-3p,IBSP 蛋白水平明顯高于輕度肝纖維化、無消化道出血及無腹腔積液的肝硬化患者，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。不同性別、年齡之間肝硬化患者血清miR-25-3p, IBSP 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

表1 肝硬化組血清miR-25-3p,IBSP 蛋白表達水平與臨床參數(shù)的關系（±s）

表1 肝硬化組血清miR-25-3p,IBSP 蛋白表達水平與臨床參數(shù)的關系（±s）

類 別nmiR-25-3pt 值P 值IBSP(ng/ml)t 值P 值年齡（歲） ＜60 535.30±0.39 1.8190.071 9.31±1.36 0.2180.828≥60675.16±0.44 9.36±1.15性別 男性665.27±0.38 1.3690.174 9.45±1.21 1.0730.286女性545.16±0.509.20±1.34肝纖維化程度 輕度393.21±0.61 34.7440.000 5.68±1.57 22.5040.000中重度816.19±0.3311.10±1.04消化道出血 有265.97±0.65 10.1940.000 12.17±1.98 11.6210.000無945.01±0.348.56±1.20腹腔積液 無653.93±0.40 33.8080.000 7.38±1.25 18.3490.000有556.74±0.5111.66±1.30

2.3 肝硬化組患者血清miR-25-3p, IBSP 蛋白表達水平與肝功能評分的相關性 Pearson 線性相關分析結果表明，肝硬化組患者血清miR-25-3p, IBSP水平表達與ALBI 評分、MELD 評分和Child-Pugh評分呈明顯正相關（r=0.584, 0.546, 0.457；0.563,0.520, 0.469，均P＜0.001）。

2.4 肝硬化失代償并發(fā)腹腔積液的多因素Logistic回歸分析 見表2。分別以miR-25-3p, IBSP 為自變量，以是否發(fā)生肝硬化失代償并發(fā)腹腔積液(是=1，否=0)為因變量，多因素Logistic 回歸分析結果，miR-25-3p升高（OR:1.202,95%CI：1.059～1.642）,IBSP 升高（OR：1.229,95%CI：1.0811.719）是乙型肝炎肝硬化失代償并發(fā)腹腔積液的獨立危險因素。

表2 影響乙型肝炎肝硬化失代償并發(fā)腹腔積液的多因素Logistic 回歸分析

2.5 miR-25-3p, IBSP 診斷肝硬化失代償并發(fā)腹腔積液的價值 見表3，圖1。ROC 曲線顯示，miR-25-3p, IBSP 聯(lián)合檢測的AUC 大于miR-25-3p,IBSP單一指標檢測(Z=3.727, 4.163，均P=0.000)。

表3 血清miR-25-3p,IBSP 及聯(lián)合診斷乙型肝炎肝硬化失代償并發(fā)腹腔積液的價值

圖1 血清miR-25-3p,IBSP 及聯(lián)合檢測診斷乙型肝炎肝硬化失代償并發(fā)腹腔積液的ROC 曲線

3 討論

肝硬化是多種慢性肝臟疾病進展的終末階段，以肝臟彌漫纖維化、假小葉形成為病理特征。肝硬化代償期無明顯臨床癥狀，發(fā)病隱匿，當疾病進展到失代償期時，肝功能嚴重損傷，伴有門靜脈高壓，臨床上出現(xiàn)腹腔積液、消化道出血及肝性腦病等并發(fā)癥，最終導致患者多器官功能衰竭而死亡。臨床上針對門靜脈高壓導致并發(fā)癥，主要通過超聲測量門靜脈寬度，間接了解門靜脈壓力情況，但其敏感度不佳[10]。深入研究乙型肝炎肝硬化發(fā)生發(fā)展的機制，尋找影響肝硬化疾病進展和有效預測肝功能失代償并發(fā)腹腔積液的血清標志物，對于乙型肝炎肝硬化的疾病診治具有重要的臨床意義[11]。

研究表明，miRNA 與炎癥、病毒感染及惡性腫瘤等多種人類疾病關系密切，是新的疾病診斷及預后判斷的腫瘤標志物[12-13]。miR-25-3p 是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的miRNA，可以被細胞分泌到血清中，促進血管新生[14]。研究表明，miR-25-3p 在肝硬化失代償、急慢性肝臟衰竭等疾病中表達升高，是患者不良預后的血清分子標志物[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-25-3p 可以通過抑制磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog, PTEN) 的表達，促進組織局部炎癥反應，加重細胞損傷[15]。然而，PTEN 表達能夠通過調控肝星形細胞的活性，抑制肝硬化的發(fā)生發(fā)展[16]。因此，我們推測，miR-25-3p 可能通過影響PTEN 的表達，參與肝硬化的疾病進展。本研究中，與肝炎組及對照組相比，肝硬化組患者血清miR-25-3p 表達水平明顯較高，提示miR-25-3p 參與肝硬化疾病的發(fā)生發(fā)展。分析其原因，推測與肝硬化組織炎癥微環(huán)境中的炎癥因子促進miR-25-3p 的表達有關。研究表明，肝硬化患者肝細胞分泌產(chǎn)生白介素（interleukin，IL）-6[17]，IL-6 是促進肝纖維化的細胞因子,可刺激單核巨噬細胞分泌miR-25-3p，導致血清中miR-25-3p 表達升高[18]。本研究中，在中重度纖維化、伴消化道出血及伴腹腔積液患者血清miR-25-3p 水平升高更為明顯，提示miR-25-3p 參與促進肝硬化疾病進展。推測其原因，可能是miR-25-3p 可促進肝臟免疫相關功能障礙。CISILOTTO 等[14]學者報道，肝硬化中miR-25-3p 的表達促進IL-8，IL-6 等炎癥細胞因子過表達，激活血管內(nèi)皮生長因子信號通路、腫瘤壞死因子通路，促進肝硬化的進展。此外，血清miR-25-3p 水平與肝硬化患者肝功能ALBI, MELD及Child-Pugh 評分呈正相關，提示血清miR-25-3p水平越高肝硬化失代償程度越高。有學者發(fā)現(xiàn)[4]，miR-25-3p 的表達上調能夠抑制抗炎性細胞因子，如IL-4 等的分泌，使肝臟炎癥平衡系統(tǒng)失調，加重肝衰竭患者的肝功能損傷，導致患者的不良生存預后。

整合素結合唾液蛋白（IBSP）基因位于 4q21.1區(qū)域，是整合素結合配體 N 聯(lián)糖蛋白家族成員。IBSP 編碼蛋白是由317 個氨基酸組成的分泌型糖蛋白，在敗血癥、感染性休克及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病中表達明顯升高。研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者血清IBSP 蛋白表達顯著升高，其升高程度能夠反映肝損傷程度、肝臟合成能力降低，此外，血清IBSP蛋白水平的升高還能夠反映肝硬化門靜脈高壓程度，是一種新的肝硬化門靜脈高壓血清標志物[6-7]。本研究中，與肝炎組及對照組相比，肝硬化組患者血清IBSP 蛋白表達水平明顯較高。分析其原因，考慮與肝臟微環(huán)境中某些細胞因子如IL-11 等對IBSP 的表達調控有關。IL-11 作為IL-6 家族成員，在肝臟炎癥纖維化過程中表達上調，IL-11 能夠直接促進IBSP 基因的轉錄，導致血清IBSP 蛋白表達水平升高[19-20]。本研究中，IBSP 蛋白在中重度纖維化、伴消化道出血及伴腹腔積液患者血清中升高更為明顯，提示IBSP 蛋白表達促進肝硬化疾病進展。研究表明，IBSP 能夠激活自然殺傷細胞、中性粒細胞和巨噬細胞等免疫細胞，誘導肝細胞死亡和細胞外基質重塑，促進肝臟纖維化過程，損傷肝功能[21]。本研究中，肝硬化患者血清IBSP 蛋白表達與肝功能ALBI, MELD 及Child-Pugh 評分呈正相關，表明肝硬化失代償程度越高，血清IBSP 蛋白表達水平越高，提示血清IBSP 蛋白水平有助于判斷肝硬化疾病的嚴重程度。BENZ 等[7]學者報道，IBSP 蛋白能通過加重肝臟炎癥反應，抑制肝臟的生物合成能力，加重肝損傷程度。因此，血清miR-25-3p 和IBSP 蛋白是新的反映肝硬化疾病嚴重程度的血清標志物。

腹腔積液是失代償期肝硬化常見并發(fā)癥，肝硬化失代償并發(fā)腹腔積液的防治是臨床研究的熱點及難點。本研究中，miR-25-3p,IBSP 蛋白是肝硬化失代償并發(fā)腹腔積液的獨立危險因素。提示檢測血清miR-25-3p,IBSP 蛋白水平可能有助于判斷肝硬化并發(fā)腹腔積液的發(fā)生。ROC 曲線進一步證實，血清miR-25-3p,IBSP 蛋白聯(lián)合檢測在診斷肝硬化失代償并發(fā)腹腔積液中具有較高的診斷效能，兩者聯(lián)合檢測有助于早期診斷肝硬化失代償并發(fā)腹腔積液。分析其原因，miR-25-3p,IBSP 蛋白水平升高加重肝臟病理損傷，促進肝硬化的發(fā)生發(fā)展，引起肝硬化失代償和腹腔積液的發(fā)生[22]。BENZ 等[7]學者在應用經(jīng)靜脈肝內(nèi)門-體靜脈支架分流術治療門脈高壓的肝硬化患者中發(fā)現(xiàn)，門靜脈高壓程度與血清miR-25-3p, IBSP 水平具有良好的相關性，血清miR-25-3p, IBSP 水平較高的患者門脈壓力較高，門靜脈血液回流受阻，腹膜腹腔積液滲出增多。此外，miR-25-3p, IBSP 能夠促進巨噬細胞分泌大量促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α,IL-1β 等，刺激腹膜，導致腹膜通透性增加，腹腔積液產(chǎn)生增多[23-24]。因此，血清miR-25-3p, IBSP 有助于對肝硬化失代償并發(fā)腹腔積液的預測，有利于臨床醫(yī)師對肝硬化患者疾病觀察。

綜上所述，乙型肝炎肝硬化患者血清中miR-25-3p, IBSP 蛋白水平升高，二者聯(lián)合檢測對乙型肝炎肝硬化失代償并發(fā)腹腔積液具有較高診斷價值。本研究尚存在不足之處，本研究患者未對門靜脈高壓程度進行檢測，難以區(qū)分門脈高壓和非門脈高壓性腹腔積液。因此，有待今后深入研究血清miR-25-3p, IBSP 蛋白水平與門靜脈壓力的關系，并探索兩者是否能反映門靜脈壓力程度，用于門脈高壓靜脈曲張出血風險的預測，指導臨床早期診治。