陳敬信，王小玲

（1.陜西省森工醫(yī)院病理科，西安 710300；2.渭南市第二醫(yī)院病理科， 陜西渭南 714000）

肺癌為全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，多由肺結(jié)節(jié)發(fā)展而來。盡管多數(shù)肺結(jié)節(jié)為良性，但是也有部分結(jié)節(jié)是早期肺癌，因此對于肺結(jié)節(jié)進行早期定性診斷具有重要價值[1]。影像學可對肺結(jié)節(jié)的形態(tài)學改變進行整體判斷，肺結(jié)節(jié)的病灶比較小，惡性征象更少，導致常規(guī)影像學診斷效果不佳[2]。細胞凋亡是通過基因控制的細胞的自主死亡，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的主要原因是由一系列具有高度調(diào)控的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine aspastic acid-specific protease , Caspase）通過級聯(lián)反應(yīng)形成的[3]。Caspase 3 是Caspase 家族最重要的效應(yīng)成員之一，其主要負責調(diào)控細胞凋亡的下游，使細胞內(nèi)的底物進行降解導致細胞死亡，從而利于機體處于平衡狀態(tài)[4]。據(jù)以往報道顯示，對于淋巴上皮組織惡性程度以及預后情況可通過Caspase 3 水平判斷，其對肺癌的診斷與治療也起到了一定作用，在侵襲性肺癌細胞中的表達上調(diào)[5]。Caspase 9 作為參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導細胞凋亡的生物標志分子，在多種癌細胞的凋亡中均起到了一定的作用。聶美玲等[6]研究顯示，血清Caspase 9 可介導神經(jīng)母細胞與宮頸癌細胞的凋亡。本文具體探討了肺結(jié)節(jié)組織中Caspase 3 和Caspase 9 蛋白良惡性診斷中的價值，希望避免該病的過度診斷及治療。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2018年1月～2020年7月在陜西省森工醫(yī)院診治的肺結(jié)節(jié)患者86 例作為研究對象，納入標準：①患者年齡20 ～70 歲；②病灶直徑0.4 ～1.5 cm，符合肺結(jié)節(jié)的診斷標準(經(jīng)手術(shù)切除后病理證實)；③預計生存時間≥3 個月；④具有完整臨床及影像學資料；⑤研究得到了醫(yī)院倫理委員會的批準。排除標準：①并發(fā)其他部位腫瘤的患者；②臨床及影像學資料缺乏者；③妊娠與哺乳期婦女；④心肺功能不全，肝腎功能嚴重障礙。

86 例患者中，病理診斷為良性結(jié)節(jié)46 例（良性組），惡性結(jié)節(jié)40 例（惡性組）。見表1。兩組的性別、年齡、體重指數(shù)、結(jié)節(jié)部位等對比差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），結(jié)節(jié)最大徑對比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

另外，在惡性組中，組織學分化：高分化26 例，中分化8 例，低分化6 例；病理類型：鱗癌21 例，腺癌19 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19 例；臨床分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期10 例，Ⅲ期8 例。

表1 兩組患者一般資料對比

1.2 儀器與試劑 免疫組織化學試劑盒，EVOS 成像系統(tǒng)（美國賽默飛世爾科技有限公司）；多克隆抗體Caspase 3 和Caspase 9（英國Abcam 公司），倒置光學顯微鏡（德國徠卡公司）。

1.3 方法

1.3.1 蛋白表達檢測：采用免疫組織化學染色法對肺結(jié)節(jié)組織中Caspase 3 和Caspase 9 陽性表達情況進行檢測，其工作濃度分別為1∶500 和1∶200，陰性對照采用磷酸鹽緩沖溶液（取代一抗），陽性對照采用已知的陽性切片。

將病理組織進行石蠟包埋并切片，脫蠟水化后進行清洗，封閉處理后分別加入Caspase 3 蛋白一抗和Caspase 9 蛋白一抗溶液，4℃ 孵育1 天后，對應(yīng)二抗溶液常規(guī)孵育30 min。清洗后進行DAB 顯色，蘇木素復染后封片。按照染色強度+陽性細胞百分數(shù)進行綜合積分，無染色為0 分，淺染色為1 分，棕黃色為2 分，深棕色為3 分；沒有陽性細胞為0分，低于10 %的陽性細胞為1 分，10 %～50 %的陽性細胞為2分，50%～100%的陽性細胞為3分。綜合積分≥4 分為陽性表達。

1.3.2 調(diào)查內(nèi)容：調(diào)查患者的病歷資料，包括姓名、性別、年齡、體重指數(shù)、病理類型、臨床分期、組織學分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、結(jié)節(jié)最大徑、結(jié)節(jié)部位等。

1.4 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)分析選擇SPSS20.00，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，行t檢驗；計數(shù)數(shù)據(jù)用n(%)表示，行χ2檢驗，采用Pearson 相關(guān)進行相關(guān)性分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者Caspase 3 和Caspase 9 表達陽性率對比 惡性組肺結(jié)節(jié)組織中Caspase 3[28(70.0%)]和Caspase 9[33(82.5%)]表達陽性率均顯著高于對照組[6(13.0%)，7(15.2%)]，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=29.035, 39.932，均P＜0.05)。

2.2 不同病理特征患者的Caspase 3 和Caspase 9 表達陽性率比較 見表2。不同病理類型患者肺結(jié)節(jié)組織中Caspase 3 和Caspase 9 表達陽性率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。惡性組中，不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分化、臨床分期患者肺結(jié)節(jié)組織中Caspase 3 和Caspase 9 表達陽性率對比，差異具有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)。

表2 不同病理特征患者的Caspase 3 和Caspase 9 表達陽性率比較[n=40，n（%）]

2.3 惡性結(jié)節(jié)Caspase 3 和Caspase 9 表達陽性率與病理特征的相關(guān)性 見表3。Pearson 相關(guān)性分析顯示組織學分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期與肺結(jié)節(jié)組織中Caspase 3 和Caspase 9 表達陽性率均呈正相關(guān)(均P＜0.05)。

表3 惡性結(jié)節(jié)Caspase3 和Caspase9 表達陽性率與病理特征的相關(guān)性(n=40)

3 討論

肺結(jié)節(jié)是人類較為常見的呼吸道病變之一，肺結(jié)節(jié)多是一種邊界清楚或模糊、單發(fā)的結(jié)節(jié)病變，由于居民年齡增加與病毒感染等因素的影響，肺惡性結(jié)節(jié)在我國的發(fā)病人數(shù)逐年增加[7-8]?，F(xiàn)代研究表明Caspases 3 對細胞凋亡的過程起到?jīng)Q定性作用[9]。而細胞凋亡又是一個復雜的過程，Caspases家族的激活是細胞凋亡發(fā)生機制中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。Caspases 家族由兩部分構(gòu)成，分別為起始型Caspases 與效應(yīng)型Caspases，其中Caspase 9 屬于起始型Caspases，其主要職能是啟動凋亡和調(diào)節(jié)效應(yīng)型Caspases 的活性；而Caspase3 屬于效應(yīng)型Caspases，其主要職能是對細胞凋亡的執(zhí)行者與終結(jié)者。尤其是經(jīng)過激活的Caspase 3，可通過降解多種底物直接使細胞發(fā)生凋亡[10]。本研究表明肺癌細胞多伴隨有Caspase 3 和Caspase 9 的高表達。不過也有研究認為Caspase 3 水平明顯下降，這可能與肺癌的惡性程度、異質(zhì)化程度有關(guān)，同時還發(fā)現(xiàn)肺癌患者若出現(xiàn)Caspase 3 蛋白表達缺失，則更加容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而且伴隨有預后不良[11-12]。

早期肺癌以肺結(jié)節(jié)形成存在，隨著病灶不斷增大，該病的惡性特征越明顯。肺癌的形成是一個由正常細胞逐漸向惡性轉(zhuǎn)化的過程，這是通過多階段、多因素、長期相互作用形成的，可在多種基因（如抑制凋亡基因、促凋亡基因、凋亡效應(yīng)基因等）共同作用下調(diào)控腫瘤細胞的凋亡[13-14]。從機制上分析，Caspase 3 和Caspase 9 蛋白均為執(zhí)行細胞凋亡較為重要的因子，主要通過級聯(lián)效應(yīng)導致細胞凋亡。而癌癥的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分化等均可能是Caspase 3 和Caspase 9 異常表達的影響因素，其表達的異常可能促進了癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程[15]。本研究Pearson 相關(guān)性分析顯示惡性肺結(jié)節(jié)的組織學分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期與Caspase 3 和Caspase 9表達陽性率都存在相關(guān)性，從機制上分析，細胞凋亡的過程主要是由Caspase 家族進行調(diào)控的，其中Caspase 9 可在凋亡信號傳導的多個途徑中發(fā)揮作用[16-17]。

Caspase 3 一般情況是以酶原的形式存在于胞漿中，當發(fā)生細胞凋亡時則立即被激活，激活后由兩個大亞基和兩個小亞基組成，然后將胞漿胞核底物進行裂解，使細胞發(fā)生凋亡[18]。同時本研究還有不足之處，如樣本量相對較小，未從基因表達水平方面探討兩者與良惡性結(jié)節(jié)間是否存在差異，將在后續(xù)研究中深入分析。

總之，Caspase 3 和Caspase 9 蛋白在惡性肺結(jié)節(jié)中呈現(xiàn)高表達狀況，也與患者的病理特征存在相關(guān)性，有利于肺結(jié)節(jié)良惡性的臨床鑒別診斷。