張濤元，丁雪梅，李 俏，祝擷英，曹三成，吳 爽

（1.青島大學附屬日照醫(yī)院/日照心臟病醫(yī)院，山東日照 276801；2.日照市中醫(yī)醫(yī)院，山東日照 276899；3.西安交通大學附屬兒童醫(yī)院，西安 710003）

肺癌是世界范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的癌癥[1]之一，根據(jù)其組織學類型分為兩類：小細胞肺癌和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。其中NSCLC 約占肺癌的85%，又分為鱗狀細胞癌、腺癌和大細胞癌三類[2]。隨著對NSCLC 發(fā)病機制的深入研究，NSCLC 的診斷和治療手段提升較大，然而NSCLC 的5年總生存率(overall survival，OS)仍小于15%[3]。因此亟需尋找更多有效的生物標志物，用于預測NSCLC 的病理過程并作為潛在藥物靶點，改善預后和實施個體化治療。

迄今為止，轉錄因子E2F 家族共發(fā)現(xiàn)了8 個因子，并按其發(fā)現(xiàn)順序進行編號（E2F1, E2F2, E2F3,E2F4, E2F5, E2F6, E2F7, E2F8）。有研究報道，E2F1, E2F2, E2F3, E2F8 與肺癌的發(fā)生密切相關[4-7]，然而E2F 家族在NSCLC 中的表達、與臨床病理相關性和可能的作用機制仍未見報道。

近些年，微陣列技術和生物信息技術已被廣泛用于鑒定基因組表達水平的改變，幫助我們識別癌癥相關的差異表達基因和相關信號通路。本研究利用生物信息學技術，分析E2F 家族在NSCLC 中的表達情況，探究其與NSCLC 分期、淋巴轉移、患者預后之間的相關性，并聚焦其在NSCLC 中的基因突變情況，尋找致病機理，為NSCLC 的診斷提供新型標志物。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 通過在線數(shù)據(jù)庫獲取所需的非小細胞肺癌的臨床病例數(shù)據(jù)，并對所有病例中E2F 家族的相關數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.2 方法

1.2.1 E2F 家族在轉錄水平表達差異的驗證: 利用Oncomine 數(shù)據(jù)庫（www.oncomine.org）[8]，比較E2F 家族在癌組織與正常組織中轉錄水平表達差異，同時獲取肺癌組織與正常肺組織中E2F 家族的研究數(shù)據(jù)，參數(shù)設置如下：t-檢驗，P-Vaule 為0.01,Fold Change 為1.5, Gene Rank 為10%, Date Type 為mRNA。利用UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu)數(shù)據(jù)庫[9]，驗證NSCLC 患者E2F 家族mRNA 的表達情況。

1.2.2 E2F 家族與NSCLC 患者臨床病理參數(shù)的分析:利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫，分析E2F 家族的mRNA 表達情況與NSCLC 患者的癌癥分期和淋巴轉移之間的相關性，t-檢驗進行數(shù)據(jù)處理，且P＜0.05 時差異具有統(tǒng)計學意義。

1.2.3 E2F 家族與NSCLC 患者總生存率的分析: 利用 Kaplan Meier-Plotter(http://kmplot.com/analysis/)網(wǎng)站，分析E2F 家族與NSCLC 患者總生存期之間的相關性。將NSCLC 患者分為高表達和低表達2組，分組標準為E2F 家族mRNA 表達值的中位數(shù)，計算危險比(hazard ratio,HR)、95%置信區(qū)間(95%confidence interval, 95%CI)和P值，制作生存曲線。

1.2.4 E2F 家族在NSCLC 患者基因組圖譜中的分析: 利用cBioPorta 數(shù)據(jù)庫，對E2F 家族在NSCLC患者基因組圖譜中的變化進行分析，共納入標本1 380 例，分析內(nèi)容包括突變、預測的GISTIC 拷貝數(shù)改變(CNA)、mRNA 表達的z評分(RNA-Seq V2 RSEM)和蛋白表達z 評分(RPPA)。

1.3 統(tǒng)計學分析 E2F 家族在轉錄水平表達差異的驗證及E2F 家族與NSCLC 患者臨床病理參數(shù)的分析，采用t檢驗進行數(shù)據(jù)處理，且P＜0.05 時差異具有統(tǒng)計學意義；E2F 家族與NSCLC 患者總生存率的分析，計算危險比(HR)、95%置信區(qū)間和P值，且P＜0.05 時差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC 患者中E2F 家族在mRNA 水平高表達Oncomine 數(shù)據(jù)庫顯示，E2F 家族的mRNA 在肺癌患者中均呈現(xiàn)高表達，見圖1。UALCAN 數(shù)據(jù)庫中，對NSCLC 患者E2F 家族的轉錄水平進行驗證（其中正常對照組59 例，癌癥組519 例），結果顯示，與正常肺組織相比，E2F 家族成員在NSCLC 組織中mRNA 均高表達，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

圖1 Oncomine 數(shù)據(jù)庫中E2F 家族在所有腫瘤與正常組織中的mRNA 表達差異

2.2 E2F 家族轉錄水平高表達與NSCLC 患者的癌癥分期、淋巴轉移密切相關 見表2。利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫對E2F 家族進行NSCLC 患者臨床病理參數(shù)相關性分析，結果顯示在癌癥分期（其中正常對照59 例，stage1 患者277 例，stage2 患者155 例，stage3 患者85 例，stage4 患者28 例）中，隨著癌癥分期的增加，E2F 家族的mRNA 水平逐漸升高；在淋巴轉移中（正常對照59 例，N0 患者331 例，N1 患者96 例，N2 患者74 例，N3 患者2 例），隨著淋巴的擴散范圍的增大，E2F 家族的mRNA 水平顯著上升。

表1 UALCAN 數(shù)據(jù)庫中E2F 家族在NSCLC組織與正常肺組織中的mRNA 表達差異

2.3 E2F 家族與NSCLC 患者總生存率密切相關 見圖2。利用Kaplan Meier-Plotter 進行E2F 家族與NSCLC 患者預后的相關分析，并繪制生存曲線圖，結果顯示，E2F1, E2F2, E2F4, E2F7, E2F8 的高表達組，NSCLC 患者總生存率顯著低于低表達組。

2.4 E2F 家族在NSCLC 患者基因突變的分析 見圖3。在1 380 例NSCLC 標本中，共有435 例標本的E2F 家族基因發(fā)生了包括突變、CAN，RNA-Seq V2 RSEM，RPPA 在內(nèi)的改變，比例高達31.52%。

3 討論

E2F 轉錄因子在包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌等在內(nèi)的多種癌癥中高表達[13-15]，在腫瘤的進程中起著重要作用。盡管一些研究已經(jīng)證實部分E2F 家族成員在NSCLC 中發(fā)揮關鍵作用，但是關于E2F家族在NSCLC 中的生物學分析仍未見報道。本研究首次探討不同E2F 因子在NSCLC 中mRNA 表達和預后價值，為尋找NSCLC 的診斷提供新的思路。

表2 E2F 家族在NSCLC 患者的不同癌癥分期、淋巴轉移級別中的轉錄水平表達差異

圖2 E2F 家族在NSCLC 患者中總生存率的生存曲線

針對NSCLC，E2F 家族中研究最多的因子為E2F1。E2F1 的過表達與NSCLC 的發(fā)生相關，且干擾pRb-p53-MDM2 能增強E2F1 在NSCLC 中的促癌作用[16]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在小細胞肺癌中，E2F1 能夠通過ZEB1 促進腫瘤的侵襲[16]。本研究通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，E2F1 在NSCLC 中高表達，且隨著腫瘤的進展及轉移，E2F1 的表達量也隨之增高，提示E2F1 可作為監(jiān)測NSCLC 病情進展的腫瘤標志物。

圖3 NSCLC 患者中E2F 家族基因表達及基因突變分析

據(jù)報道，E2F2 是NSCLC 的腫瘤激活因子，是NSCLC 患者OS 的獨立生存指標[17]。同時，在血液組織中檢測E2F3 表達情況，發(fā)現(xiàn)肺癌患者血液中E2F3 的mRNA 水平顯著高于正常人血液，即lncRNA NEAT1 能夠上調E2F3，從而促進肺癌的發(fā)生，提示E2F3 可以作為肺癌診斷的敏感指標[18]。最新研究發(fā)現(xiàn)，E2F3 與NSCLC 的轉移密切相關，預示著E2F3 在NSCLC 的預后診斷中具有一定的價值[19]。

E2F4 作為抑制轉錄因子，能夠抑制增殖，并介導辣椒素的抗增殖活性[20]。BANKOVIC 等[21]人通過DNA 指紋圖譜研究了NSCLC 患者基因組的不穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)E2F4 是參與其生長和轉移的基因之一。在本研究中，E2F4 高表達與NSCLC 的腫瘤分級、淋巴轉移及患者較差的OS 相關，這似乎與E2F4 作為腫瘤抑制因子的作用不一致，需要后續(xù)的驗證試驗加以證明。

E2F5 在前列腺癌和膠質母細胞瘤中高表達[22-23]，但是在NSCLC 中未見報道。本研究證實E2F5 在NSCLC 中mRNA 高表達，臨床病理數(shù)據(jù)顯示E2F5 與癌癥分級相關，但與患者OS 無明顯相關性。

有研究證實，miR-424 負調控E2F6 的表達，抑制A549 細胞的增殖和侵襲[24]。在NSCLC 患者血液中，檢測E2F6 的表達，顯示其mRNA 較正常人血液樣本高表達[21]，而E2F6 與NSCLC 的患者生存情況相關性目前未見報道。

E2F7，E2F8 被證明是腫瘤激活因子，E2F8能阻斷其他E2F 家族成員與cyclin D1 的結合，并激活cyclin D1[25]；芯片測序分析表明，E2F8 能夠與uhrf1 的啟動子結合，參與其激活與調控[26]。通過生物信息學，我們發(fā)現(xiàn)隨著NSCLC 的發(fā)生發(fā)展，E2F7，E2F8 的mRNA 水平也隨之升高，且E2F7，E2F8 的高表達，與患者較差的OS 相關，預示著E2F7, E2F8 有可能作為NSCLC 的發(fā)展及預后的標志物，指導臨床治療。

通過系統(tǒng)分析，我們發(fā)現(xiàn)E2F 家族的表達與NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關，同時通過對E2F 家族突變分析，發(fā)現(xiàn)其在NSCLC 患者中突變率高達31.52%，提示E2F 家族的突變可能與NSCLC 的發(fā)生存在密切關系，預示著有可能通過E2F 家族突變檢測提示NSCLC 的發(fā)生風險；同時，鑒于E2F 家族特別是其中的E2F1, E2F2, E2F3,E2F5, E2F7 和F2F8 與NSCLC 患者腫瘤分級及淋巴轉移密切關系，提示他們可作為腫瘤發(fā)展、轉移等病情監(jiān)測手段；而E2F4, E2F7 和E2F8 與較差的OS 的相關性，提示他們可作為患者較差預后的檢測標志物。

綜上所述，本文系統(tǒng)地分析了E2F 家族在NSCLC 中的表達和預后價值，并對E2F 家族及相關蛋白可能參與的NSCLC 中的生物學功能進行了深入研究。但是，由于本文是基于公共數(shù)據(jù)庫對已公開數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，因此缺乏相關的分子生物學實驗驗證，因此具有一定局限性，后續(xù)研究將根據(jù)本實驗結果補充驗證試驗。