王 路,葉 莎,韓 霞,伏建峰

（1.巴音郭楞蒙古自治州人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,新疆庫爾勒 841000;2.新疆軍區(qū)總醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心,烏魯木齊 830000）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病人數(shù)占癌癥總病例數(shù)的9.2%，死亡人數(shù)占癌癥總死亡人數(shù)的12.9%，分別居惡性腫瘤的第4 位和第2 位[1]。據(jù)報(bào)道，HCC 早期癥狀不明顯，絕大部分確診時(shí)已是中晚期，生存率不足10%，這凸顯了早期診斷的重要性[2-3]。目前，HCC 的診斷方法有病理學(xué)診斷、影像學(xué)檢查、甲胎蛋白（alpha fetoprotein, AFP）和α-L-巖藻糖苷酶（α-L-fucosidase, AFU）檢測等，但這些方法在HCC 的診斷中均具有一定局限性。研究顯示，外泌體可反映細(xì)胞功能。近年來，國內(nèi)外研究者嘗試將外泌體作為新型的疾病診斷標(biāo)志物，尤其在腫瘤領(lǐng)域[4]。業(yè)已證實(shí)，HCC 的發(fā)生和演變與微小核糖核酸（miRNA）有關(guān)，特別是外泌體miRNA。目前已有不少文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA 可作為HCC 早期診斷及病情監(jiān)測的生物標(biāo)志物[5]，但由于外泌體miRNA 的種類、檢測譜、標(biāo)本來源等不同，造成診斷效能有所差異。因此，有必要系統(tǒng)、全面地評估外泌體miRNA 用于HCC 診斷的可行性。本研究采用Meta 分析評估循環(huán)外泌體miRNA 對HCC 的整體臨床診斷價(jià)值，旨在為循環(huán)外泌體miRNA 作為生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床診斷HCC 提供數(shù)據(jù)支持和參考。

1 材料與方法

1.1 資料來源 收集截止2020年1月21日循環(huán)外泌體miRNA檢測對HCC臨床診斷效能的相關(guān)文獻(xiàn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病例組中研究對象均為病理學(xué)檢查或美國肝病研究學(xué)會(huì)（AASLD）確診的HCC 患者；②對照組人群為無任何惡性腫瘤病史的成年人，不排除伴有肝炎、肝硬化；③在HCC 患者手術(shù)、放化療前采集外周血標(biāo)本；④診斷效能評價(jià)指標(biāo)必須包括靈敏度、特異度。排除標(biāo)準(zhǔn)：①綜述、系統(tǒng)評價(jià)、會(huì)議摘要等非實(shí)驗(yàn)研究型文獻(xiàn)；②研究標(biāo)本為病理組織、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；③重復(fù)發(fā)表的研究。

1.2 方法

1.2.1 檢索策略：檢索PubMed, Embase, Cochrane Library, Web of science，中國期刊全文數(shù)據(jù)庫（CNKI）、萬方數(shù)據(jù)庫（Wan Fang）、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)檢索數(shù)據(jù)庫（CBM）和維普咨詢中文期刊服務(wù)臺(tái)（VIP）,檢索詞包括“Liver Neoplasms”“肝腫瘤”“肝細(xì)胞癌”“MicroRNAs”“微RNAs”“miRNA”“Exosomes”“外泌體”“Diagnosis”和“診斷”等。

1.2.2 質(zhì)量評價(jià)：由2 位作者通過逐一閱讀文獻(xiàn)進(jìn)行獨(dú)立篩選并提取資料，提取資料包括第一作者、發(fā)表年份、研究對象所在國家、對照來源、樣本量、樣本類型、miRNA 檢測譜、真陽性(true positive, TP)、假陽性(false positive, FP)、真陰性(true negative, TN)、假陰性(false negative, FN)等。雙方同時(shí)納入文獻(xiàn)，各自獨(dú)立采用診斷準(zhǔn)確度質(zhì)量評價(jià)工具QUADAS-2 從4 個(gè)方面對文獻(xiàn)質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)，偏倚風(fēng)險(xiǎn)分為：高、不清楚、低三類，存在分歧的文獻(xiàn)最后通過與相關(guān)專家協(xié)商討論解決。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用RevMan 5.3 統(tǒng)計(jì)軟件中QUADAS 2(quality assessment of diagnostic accurocy studies 2)繪制文獻(xiàn)質(zhì)量評價(jià)圖，應(yīng)用Meta Disc1.4軟件計(jì)算靈敏度對數(shù)與（1-特異度）對數(shù)之間的spearman 相關(guān)系數(shù)，以分析閾值效應(yīng)，P＜0.05 提示存在閾值效應(yīng)；計(jì)算診斷比值比（diagnostic odds ratio, DOR)的Cochran-Q 值、I2值，以檢驗(yàn)非閾值效應(yīng)異質(zhì)性，若P＞0.05 且I2＜50%，則無非閾值效應(yīng)異質(zhì)性，采用固定效應(yīng)模型合并效應(yīng)量；若P＜0.05 且I2＞50%，則存在非閾值效應(yīng)異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型合并效應(yīng)量；采用亞組分析，以查找非閾值效應(yīng)異質(zhì)性來源或原因；應(yīng)用Stata 14.0軟件繪制Deek’s 漏斗圖以檢驗(yàn)發(fā)表偏倚，P＜0.05提示比對組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢索結(jié)果 通過8 種數(shù)據(jù)庫初步檢索文獻(xiàn)256篇，剔除重復(fù)文獻(xiàn)47 篇，剩余209 篇，再嚴(yán)格按照納入及排除標(biāo)準(zhǔn)篩選，最終納入分析文獻(xiàn)10 篇，共計(jì)12 項(xiàng)研究，包括775 例HCC 患者和957 例非HCC 對照人群。納入文獻(xiàn)均發(fā)表于2017 ～2020年，文獻(xiàn)基本特征見表1。

2.2 質(zhì)量評價(jià) 將納入研究采用QUADAS-2 從風(fēng)險(xiǎn)偏倚（病例選擇、待評價(jià)試驗(yàn)、金標(biāo)準(zhǔn)、病例流程和進(jìn)展）和臨床適用性（病例選擇、待評價(jià)試驗(yàn)、金標(biāo)準(zhǔn)）7 個(gè)方面進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)，12 篇文獻(xiàn)中有11 篇5 項(xiàng)低風(fēng)險(xiǎn)（其中有4 篇2 項(xiàng)高風(fēng)險(xiǎn)，有7 篇1 項(xiàng)高風(fēng)險(xiǎn)，1 項(xiàng)不確定）；1 篇4 項(xiàng)低風(fēng)險(xiǎn)，3 項(xiàng)高風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果顯示納入文獻(xiàn)質(zhì)量較高，均符合QUADAS 2 中的大部分標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 Meta 分析結(jié)果

2.3.1 閾值效應(yīng)：將納入10 篇文獻(xiàn)中的12 項(xiàng)研究數(shù)據(jù)導(dǎo)入Meta DiSc 14.0 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示靈敏度對數(shù)與（1 特異度）對數(shù)之間的spearman 相關(guān)系數(shù)為-0.186（P=0.563），不顯著，提示本次研究不存在閾值效應(yīng)；進(jìn)一步，通過繪制對稱SROC曲線，未見“肩臂狀”出現(xiàn)，再次提示并映證本次研究無閾值效應(yīng)。

2.3.2 異質(zhì)性評價(jià)：DOR 的Cochran -Q 檢驗(yàn)顯示Cochran -Q=35.88,P＜0.001，提示本研究存在非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性。因本次研究的靈敏度、特異度、陽/陰性似然比、DOR 的I2均大于50%，故下一步研究采用隨機(jī)效應(yīng)模型對以上5 個(gè)效應(yīng)量進(jìn)行合并。

2.3.3 效應(yīng)量合并值：結(jié)果顯示， 外泌體miRNA 診斷HCC 的合并靈敏度為0.892（95%CI：0.868～0.913），合并特異度為0.884（95%CI：0.862～0.904），見圖1，合并陽性似然比為7.019（95%CI：4.819～10.224），合并陰性似然比為0.122（95%CI：0.074～0.200），合并DOR=63.695（95%CI：33.937 ～119.55）；AUC 為0.950 7，Q=0.891 4，提示循環(huán)外泌體miRNA 對HCC 的診斷具有較好的參考價(jià)值，見圖2。

表1 納入文獻(xiàn)基本特征

2.3.4 亞組分析：見表2。鑒于上述方法證明納入研究結(jié)果間存在由非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性，故進(jìn)一步按照對照組來源、外泌體miRNA 檢測譜、外泌體miRNA 檢測個(gè)數(shù)進(jìn)行亞組分析，查找異質(zhì)性來源。結(jié)果顯示對照組為健康人群和混合人群、外泌體miRNA 檢測譜、單個(gè)外泌體miRNA 檢測研究間存在異質(zhì)性，而對照組為慢性肝病、多個(gè)外泌體miRNA 聯(lián)合檢測無異質(zhì)性。

另在亞組分析發(fā)現(xiàn)，含有外泌體miRNA-122 診斷HCC 的DOR, AUC 高于不含外泌體miRNA-122的DOR, AUC；多個(gè)外泌體miRNA 聯(lián)合檢測的DOR, AUC 高于單個(gè)外泌體miRNA 檢測的DOR,AUC。提示聯(lián)合檢測，尤其包含外泌體miRNA-122的聯(lián)合檢測可提高HCC 的診斷效能。

2.3.5 Deek’s 發(fā)表偏倚檢驗(yàn)：見圖3。應(yīng)用Stata 14.0 對本研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行發(fā)表偏倚檢驗(yàn)，結(jié)果顯示漏斗圖對稱，P=0.57，提示本次研究不存在發(fā)表偏倚。

圖1 外泌體miRNA 診斷HCC 的合并靈敏度、特異度

圖2 外泌體miRNA 診斷HCC 的DOR，AUC

圖3 Deek’s 發(fā)表偏倚

2.3.6 臨床效果評價(jià)：應(yīng)用 Fagan’s 列線圖進(jìn)行臨床效果評價(jià)。當(dāng)設(shè)定驗(yàn)前概率為50%時(shí)，檢測循環(huán)外泌體miRNA 為陽性，則被檢測者患有HCC 的概率為89%；檢測循環(huán)外泌體miRNA 為陰性，則被檢測者患有HCC 的概率為9%。提示循環(huán)外泌體miRNA 診斷HCC 具有較好的臨床價(jià)值。

3 討論

肝細(xì)胞癌（HCC）是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病隱匿，早期診斷困難，且具有不良的預(yù)后和高復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，尋找理想的HCC 診斷和療效監(jiān)控的生物標(biāo)志物，一直是臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)。傳統(tǒng)的血清學(xué)標(biāo)志物，如：AFP，AFU 等，已滿足不了臨床需求。急需我們探索既靈敏又特異的血清標(biāo)志物應(yīng)用于臨床。

表2 外泌體miRNA 檢測對HCC 診斷價(jià)值的亞組分析結(jié)果

外泌體是一種直徑為30 ～100nm 的磷脂雙分子膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞囊泡，可以攜帶miRNA, lncRNA,mRNA，脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等，將生物信息傳遞給受體細(xì)胞，在正?；蚣膊顟B(tài)下發(fā)揮其生理及生物學(xué)作用[16]。研究證實(shí)，外泌體的脂質(zhì)雙分子膜對miRNA 起保護(hù)作用，阻止其內(nèi)容物抵抗核糖核酸酶和蛋白酶降解[17]，使其在外周血中能夠長期穩(wěn)定的表達(dá)并被檢測出來。有研究表明，miR-122[18]，miR-125b[19]等可作為HCC 診斷的潛在生物標(biāo)志物；而經(jīng)深度測序篩選HCC 和肝硬化之間差異表達(dá)的血清外泌體miR-122,miR-148a 和miR-1246，通過ROC 曲線評估診斷效能，發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-122是區(qū)分HCC 和肝硬化的最佳指標(biāo)[9]。因此，循環(huán)外泌體miRNA 很可能成為診斷HCC 的新的生物標(biāo)志物，值得進(jìn)一步研究。

本研究依托8 種文獻(xiàn)收錄數(shù)據(jù)庫平臺(tái)，檢索并篩選循環(huán)外泌體miRNA 對HCC 診斷效能的相關(guān)文獻(xiàn)，行Meta 分析。結(jié)果顯示，循環(huán)外泌體miRNA診斷HCC 的合并靈敏度、合并特異度優(yōu)于傳統(tǒng)的血清學(xué)指標(biāo)AFP 和AFU[20]。研究中發(fā)現(xiàn)，納入研究結(jié)果間存在由非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性，故進(jìn)一步按照對照組來源、外泌體miRNA 檢測譜、外泌體miRNA 檢測個(gè)數(shù)進(jìn)行亞組分析，查找異質(zhì)性來源。結(jié)果顯示，對照組為健康人群和混合人群、單個(gè)外泌體miRNA 檢測、外泌體miRNA 檢測譜存在異質(zhì)性。究其原因：①慢性肝病、混合人群因疾病狀態(tài)可能會(huì)引起自身外泌體miRNA 表達(dá)的改變；②不同外泌體miRNA 檢測譜對HCC 診斷效能有所差異。

臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)表明，聯(lián)合診斷模式的效能往往優(yōu)于單一指標(biāo)，循環(huán)外泌體miRNA 應(yīng)用于HCC 診斷亦是如此。研究中發(fā)現(xiàn)，含有外泌體miRNA-122的組合診斷模式，其診斷HCC 的DOR，AUC 相比不含外泌體miRNA-122 組合模式診斷效能更佳，WANG 等[9]的報(bào)道也證實(shí)了這一點(diǎn)。此外，多個(gè)外泌體miRNA 聯(lián)合檢測診斷HCC 的AUC 也較單指標(biāo)大，提示循環(huán)外泌體miRNA 多指標(biāo)聯(lián)合檢測也可提高HCC 診斷效能。

本研究系統(tǒng)評價(jià)了循環(huán)外泌體miRNA 在HCC中的臨床診斷價(jià)值，嘗試為臨床亟待解決血清學(xué)標(biāo)志物診斷HCC 的難題，提供一種立足于現(xiàn)有研究基礎(chǔ)的分析思路。分析研究結(jié)果達(dá)到預(yù)期目的，但也存在不足和局限：①符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)偏少，部分?jǐn)?shù)據(jù)不全的文獻(xiàn)，未聯(lián)系到作者；②部分文獻(xiàn)在原文中未直接提取到真陽性、假陽性、真陰性和假陰性數(shù)據(jù)，而是間接通過敏感度、特異度并結(jié)合研究人數(shù)計(jì)算所得；③納入研究的外泌體miRNA檢測譜、檢測個(gè)數(shù)、對照組來源等不同，導(dǎo)致各研究間存在非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性，可能在一定程度上對本研究結(jié)果造成影響。但以上不足和局限不影響循環(huán)外泌體miRNA 成為診斷HCC 的新的生物標(biāo)志物，當(dāng)然，如何將其應(yīng)用于臨床？包括基于滿足臨床所需診斷效能的miRNA 的遴選、miRNA 組合的優(yōu)化等，尚需臨床應(yīng)用實(shí)踐的檢驗(yàn)。綜上所述，循環(huán)外泌體miRNA 診斷HCC 的敏感度、特異度和AUC 可滿足臨床所需，其可作為一種潛在的新的生物標(biāo)志物應(yīng)用于HCC 臨床診斷。