馮 芬

（佛山市第一人民醫(yī)院胃腸腫瘤內(nèi)科，廣東佛山 528000）

結(jié)直腸癌是全球第三大常見(jiàn)惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率分別居我國(guó)全部惡性腫瘤的第3 位和第5位[1]。近幾十年來(lái)隨著診斷、檢測(cè)、治療策略的進(jìn)步，結(jié)直腸癌患者預(yù)后明顯改善，但大多患者確診時(shí)已達(dá)中晚期，晚期患者5年生存率僅27.70%，伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶無(wú)法切除者5年生存率不足5%[2-3]。因此還需探索結(jié)直腸癌相關(guān)生物標(biāo)志物，以進(jìn)一步闡明結(jié)直腸癌機(jī)制，改善患者預(yù)后。研究表明，Ras 基因突變通常與癌癥發(fā)生發(fā)展有關(guān)[4]。Ras/Raf/ 絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路異常激活可影響結(jié)直腸癌患者表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor rec epto，EGFR)靶向治療，導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生[5-6]。因此發(fā)現(xiàn)Ras/Raf/ MAPK 信號(hào)通路中癌基因或抑癌基因可能是一種新的癌癥治療策略。泛素化和去泛素化是兩種主要的翻譯后修飾形式，能在生物過(guò)程中維持蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡[7]。研究表明,不正常的泛素化和去泛素化常會(huì)引起疾病，去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUB)的降解在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[8]。泛素特異性蛋白酶(ubiquitinspecific protease，USP)是DUB 大家族最常見(jiàn)成員,參與蛋白質(zhì)去泛素化和Ras 活性調(diào)控[9]。目前已有研究報(bào)道USP11 在乳腺癌、卵巢癌等實(shí)體腫瘤中的作用[10-11]。蛋白磷酸酶1 是一種去磷酸化反應(yīng)的酶分子，在細(xì)胞分裂、凋亡、RNA 剪切、糖原代謝、蛋白合成等生理調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[12]。蛋白磷酸酶1 催化亞基α(protein phosphatase 1 catalytic subunit alpha，PPP1CA) 是蛋白磷酸酶1 亞型，研究報(bào)道其能激活MAPK 信號(hào)通路，參與前列腺癌發(fā)展[13]。目前關(guān)于USP11，PPP1CA 在結(jié)直腸癌中的作用尚不明確，本研究就觀察結(jié)直腸癌中USP11，PPP1CA 表達(dá)變化，探討二者與結(jié)直腸癌的相關(guān)性及臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取佛山市第一人民醫(yī)院2015年1月～2016年4月收治的87 例接受外科手術(shù)切除的結(jié)直腸癌患者，其中男性46 例，女性41 例；年齡34 ～82(60.25±7.48)歲；組織學(xué)分型 ：腺癌65例，黏液腺癌22 例；TNM 分期：Ⅰ期26 例，Ⅱ期41 例，Ⅲ期13 例，Ⅳ期7 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為結(jié)直腸癌；②初次確診，術(shù)前未接受免疫治療、化療、放療者；③可接受隨訪者；④病理資料和隨訪資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)其他部位腫瘤者；②嚴(yán)重心、肝、腎等臟器疾病者；③全身感染性疾病者；④血液系統(tǒng)疾病者。本研究患者及家屬均知情研究，并經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 NanoDrop 2000C 超微量分光光度計(jì)，MiniAmp PCR 儀( 賽默飛世爾科技公司)；ZEISS 光學(xué)顯微鏡（北京儀準(zhǔn)科技有限公司）；Trizol 試劑盒（北京柏萊斯特科技發(fā)展有限公司）；Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR, qRT-PCR) 試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）；USP11，PPP1CA抗體（亞諾法生技股份有限公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（武漢艾美捷科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集：術(shù)中切除部分癌組織及距離癌組織≥5cm 癌旁組織，部分組織離體后15min 內(nèi)液氮冷凍，儲(chǔ)存于-80℃冰箱內(nèi)，進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)；部分組織以10g/dl 中性甲醛溶液固定，脫水、透明、石蠟包埋，連續(xù)切片4μm，進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.3.2 qRT-PCR 檢測(cè)：Trizol 試劑盒提取組織中總RNA，超微量分光光度計(jì)驗(yàn)證RNA 濃度和純度，Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，qRT-PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)。USP11 上游引物：5’-UUAUCUCAUCUUGAA AGAGUG-3’，下游引物：5’-UGUUGUUGUUCAUGACAUGCA-3’；PPP1CA上游引物：5’-TATTTGAGTATGGCGGTTTCC-3’，下游引物：5’-CCACAGTTTGATGTTGTAGCG-3’。反應(yīng)體系：2μl cDNA，1μl 引物，10μl SYBR Green Master Mix，6μl ddH2O；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10min，95℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)35 次。內(nèi)參GAPDH 上游引物：5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3’，下游引物：5’-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’。2-ΔΔCt法計(jì)算組織中USP11，PPP1CA 相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 免疫組織化學(xué)和HE 染色：切片常規(guī)脫蠟、復(fù)水、HE 染色、脫水，免疫組織化學(xué)染色時(shí)將載玻片置于65℃環(huán)境下孵育45min 后脫蠟，通過(guò)枸櫞酸鹽緩沖液和3g/dl H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶以檢索抗原，非特異性抗原阻斷后，載玻片與USP11，PPP1CA 抗體在4℃環(huán)境下孵育過(guò)夜。次日將載玻片與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1h。二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒顯色，光學(xué)顯微鏡觀察顯色程度，蘇木精反染載玻片，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)算免疫組織化學(xué)評(píng)分。染色強(qiáng)度：棕褐色、棕黃色、淡黃色、無(wú)色各計(jì)3，2，1，0 分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)高倍視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)比例，≥75%，50%～74%，25%～49%，1%～24%各計(jì)6，4，2，1 分；免疫組織化學(xué)評(píng)分=染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞率，總分≥2 分表示陽(yáng)性。

1.3.4 隨訪：患者出院后通過(guò)門診或電話方式隨訪5年，隨訪至2021年4月，統(tǒng)計(jì)術(shù)后5年總生存率（overall survival，OS）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)；滿足正態(tài)性分布及方差齊性的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位間）[M(P25,P75)]表示，兩組間比較采用Z檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)性分析；K-M 法繪制生存曲線，組間生存率采用Log-rank 檢驗(yàn)；采用多因素COX 回歸分析結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良影響因素；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織中USP11 mRNA，PPP1CA mRNA 表達(dá)水平比較 癌組織中USP11 mRNA[3.49(3.45,3.52)]，PPP1CA mRNA [1.13(1.11,1.15)]表達(dá)水平高于癌旁組織中[1.02(0.99,1.06), 0.35(0.34,0.36)]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-11.397, -11.423，均P＜0.001)。

2.2 結(jié)直腸癌組織中USP11 mRNA與PPP1CA mRNA表達(dá)的相關(guān)性 見(jiàn)圖1。Spearman 相關(guān)性分析顯示，結(jié)直腸癌組織中USP11 mRNA 與PPP1CA mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.658，P＜0.001)。

圖1 結(jié)直腸癌組織中USP11 mRNA 與PPP1CA mRNA表達(dá)的相關(guān)性

2.2 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織中USP11，PPP1CA蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較 見(jiàn)圖2。結(jié)直腸癌組織中USP11，PPP1CA 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為66.67%(58/87)，62.07% (54/87)，明顯高于癌旁組織中蛋白表達(dá)陽(yáng)性率20.69% (18/87)，25.29% (22/87)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=37.379，23.923，均P＜0.001)。

圖2 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織中USP11，PPP1CA 蛋白表達(dá)

2.3 結(jié)直腸癌組織中USP11，PPP1CA 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 見(jiàn)表1。結(jié)直腸癌組織中USP11，PPP1CA 表達(dá)TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(均P＜0.05)，與性別、年齡、組織學(xué)分型、分化程度無(wú)關(guān)(均P＞0.05)。

表1 結(jié)直腸癌組織中USP11，PPP1CA 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 [n(%)]

2.4 USP11，PPP1CA 表達(dá)與結(jié)直腸癌患者總生存率的關(guān)系 見(jiàn)圖3。隨訪4 ～60 個(gè)月，中位隨訪34 個(gè)月，術(shù)后5年總生存率為64.37%(56/87)。K-M 曲線顯示，USP11，PPP1CA 蛋白表達(dá)陽(yáng)性組術(shù)后5年總生存率 為55.17%(32/58)，57.41%(31/54)，低于USP11，PPP1CA 蛋白表達(dá)陰性組82.76%(24/29)，75.76%(25/33)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=8.900，9.081，均P=0.003)。

圖3 USP11，PPP1CA 蛋白表達(dá)陽(yáng)性與陰性結(jié)直腸癌患者生存曲線

2.5 結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良影響因素的COX 回歸分析 以性別、年齡、組織學(xué)分型、分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、USP11，PPP1CA 為自變量，隨訪時(shí)間為時(shí)間變量，預(yù)后為因變量，賦值見(jiàn)表2。多因素COX 回歸分析顯示，TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、USP11 陽(yáng)性及PPP1CA 陽(yáng)性為結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表2 變量賦值

3 討論

結(jié)直腸癌是胃腸道常見(jiàn)惡性腫瘤，盡管近年來(lái)手術(shù)和放化療取得了較大進(jìn)展，但結(jié)直腸癌患者總生存率仍然較低[14]。結(jié)直腸癌的發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，可能起源于結(jié)腸上皮原癌基因突變、抑癌基因失活、微衛(wèi)星不穩(wěn)定、錯(cuò)配修復(fù)基因突變、凋亡機(jī)制障礙、基因過(guò)度表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控紊亂、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)分子改變、基因組表觀遺傳學(xué)修飾改變、環(huán)境等多因素的共同作用，涉及多個(gè)分子間的作用，研究相關(guān)分子改變可能為結(jié)直腸癌診治提供方向。

泛素-蛋白酶途徑是常見(jiàn)的多步驟反應(yīng)的蛋白翻譯后修飾過(guò)程，幾乎參與調(diào)控所有生命過(guò)程，DUB 是其關(guān)鍵組分之一，可進(jìn)行泛素前體的加工，在泛素化時(shí)可編輯泛素鏈、逆轉(zhuǎn)泛素結(jié)合、回收泛素分子等，在蛋白質(zhì)泛素化過(guò)程中，DUB 能競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到泛素結(jié)合位點(diǎn)并穩(wěn)定其目標(biāo)蛋白，在癌癥過(guò)程發(fā)揮重要調(diào)控作用[8]。USP 為DUB 主要成員，USP11 為USP 家庭成員之一，具有調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)合成降解、DNA 修復(fù)、參與基因表達(dá)等生物學(xué)功能，已被證實(shí)與多種實(shí)體腫瘤發(fā)生和預(yù)后相關(guān)[15-16]。如GARCIA 等[15]研究報(bào)道，乳腺癌中USP11 表達(dá)上調(diào)，USP11 能增強(qiáng)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β 受體Ⅱ誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和自我更新，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、遷移。ZHANG 等[16]研究報(bào)道，肝癌組織中USP11表達(dá)上調(diào)，USP11 能結(jié)合核因子90 并去泛素化，穩(wěn)定核因子90 蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中USP11 mRNA 表達(dá)上調(diào)，USP11 蛋白陽(yáng)性率也顯著增加，提示USP11 可能在結(jié)直腸癌發(fā)展中發(fā)揮作用。

表3 結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良影響因素的單因素和多因素COX 回歸分析

眾所周知，癌細(xì)胞能通過(guò)促進(jìn)增殖和抑制凋亡而無(wú)限增殖，導(dǎo)致淋巴結(jié)或其他部位轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的發(fā)展，導(dǎo)致預(yù)后不良。本研究結(jié)果顯示，USP11 表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明USP11 參與結(jié)直腸癌發(fā)展，但還需試驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲、遷移作用。同時(shí)結(jié)果也顯示，USP11 表達(dá)陽(yáng)性組術(shù)后5年生存率明顯降低，相比USP11 表達(dá)陰性組，術(shù)后5年預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)增加2.404 倍，說(shuō)明USP11 可能成為預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌的一個(gè)新的生物標(biāo)志物和一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。USP11 已被證實(shí)能通過(guò)穩(wěn)定p21，BIP，轉(zhuǎn)錄輔助因子退變樣蛋白-4、磷酸酶和張力蛋白同系物抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展[17-19]，也可通過(guò)穩(wěn)定Snail，真核起始因子4B，細(xì)胞抑制因子凋亡蛋白2促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[11,20]。這些發(fā)現(xiàn)表明USP11 在腫瘤中具有雙向作用，凸顯了USP11 在腫瘤惡性進(jìn)展中的特異性，因此關(guān)于其參與結(jié)直腸癌惡性進(jìn)展的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

癌細(xì)胞可利用信號(hào)級(jí)聯(lián)來(lái)滿足其持續(xù)生長(zhǎng)和生存的需要，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是由可逆的蛋白質(zhì)磷酸化機(jī)制緊密控制的，這需要蛋白質(zhì)激酶和蛋白質(zhì)磷酸酶的平衡作用，因此該系統(tǒng)的平衡與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]。蛋白磷酸酶1 是真核細(xì)胞中最重要的蛋白磷酸酶之一，PPP1CA 是其一種亞型，能與多種調(diào)節(jié)亞基形成復(fù)合物，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等各種細(xì)胞活動(dòng)，目前研究也證實(shí)，PPP1CA 能激活MAPK 通路，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[12-13]。同時(shí)研究報(bào)道，肺癌組織中PPP1CA 表達(dá)降低，且PPP1CA 的下調(diào)與肺癌預(yù)后不良有關(guān)[21]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中PPP1CA mRNA 表達(dá)上調(diào)，USP11 蛋白陽(yáng)性率也顯著增加，并與結(jié)直腸癌患者TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說(shuō)明PPP1CA參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展。但本研究中，PPP1CA 表達(dá)陽(yáng)性是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，與VERDUGO-SIVIANES 等[21]報(bào)道的PPP1CA 的下調(diào)增加肺癌預(yù)后不良存在差異。HANG 等[22]研究也報(bào)道，胰腺癌組織中PPP1CA 表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)與胰腺癌患者存活率降低相關(guān)。提示PPP1CA 在不同癌癥中可能也發(fā)揮不同的作用，值得進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果還顯示，結(jié)直腸癌中USP11 mRNA與PPP1CA mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)，提示USP11 和PPP1CA 可能共同參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展。MAPK是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracelluar regulated protein kinases, ERK) /MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[23]。CHEN 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中USP11 過(guò)表達(dá)能富集MAPK 通路，并進(jìn)一步證實(shí)USP11 可通過(guò)去泛素化穩(wěn)定PPP1CA 以激活ERK/MAPK 信號(hào)通路，促進(jìn)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步說(shuō)明USP11 和PPP1CA 共同參與結(jié)直腸癌惡性進(jìn)展。

結(jié)直腸癌中USP11，PPP1CA 高表達(dá)，與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，二者可能共同影響患者預(yù)后。但還需要進(jìn)一步的前瞻性臨床研究證實(shí)二者是診斷和治療結(jié)直腸癌患者的新的生物標(biāo)志物。