蔣銳達 王家家 趙三軍 王曉燕 高潤池

（云南師范大學能源與環(huán)境工程學院，生命科學學院，生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心，云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點實驗室，昆明 650500）

遷移是細胞最重要的屬性之一，是細胞在接收到遷移信號或感受到某些物質(zhì)的濃度梯度后產(chǎn)生的位置改變的行為。在高等真核生物體中，細胞受到胞外環(huán)境信號誘導后會朝特定方向發(fā)生遷移，從而影響胚胎發(fā)育、血管生成、傷口愈合、免疫反應、炎癥反應、動脈粥樣硬化、癌癥轉(zhuǎn)移等重要的生理和病理過程。在諸多環(huán)境信號中，由環(huán)境中化學信號引起的細胞定向遷移行（稱為趨化性）被研究得較深入，其機制和信號通路等研究也較為透徹［1］。而近年來，人們觀察到在高等真核生物體中廣泛的存在著生物電信號［2］，其同樣可以指導許多類型的細胞發(fā)生定向的遷移（稱為趨電性），例如，干細胞［3］、癌細胞［4-5］、上皮細胞［6-7］、神經(jīng)軸突［8］、盤基網(wǎng)柄菌細胞［9］、神經(jīng)嵴細胞［10］等?？傮w上，大部分的細胞在直流電場中朝陰極遷移，而少部分細胞朝陽極遷移，極少數(shù)則根據(jù)條件的不同，出現(xiàn)雙向遷移的情況。

細胞的趨化性和趨電性運動存在許多共同之處，例如，在活體內(nèi)的許多情況下，化學因子梯度和內(nèi)源性生物電場同時存在于組織中，它們都能夠指導細胞發(fā)生定向遷移。此外，細胞的趨電性和趨化性在運動模式上也比較相似，都是在細胞的前端或者后端有特殊的蛋白質(zhì)受體聚集，從表面上看，它們似乎也是共用細胞內(nèi)的信號通路，如MAPK和PI3K信號通路［11］。這些相似性，導致很難確定趨化性和趨電性的原理或機制究竟是共享還是完全重疊。甚至一些研究者認為，細胞趨電性運動的根本原因是細胞趨化性運動，因為當細胞處于直流電場時，會引起環(huán)境中和細胞內(nèi)的帶電荷分子的運動，從而產(chǎn)生化學梯度，并最終引起細胞發(fā)生趨化運動。

然而，細胞的趨化性和趨電性之間似乎又存在著差異。在盤基網(wǎng)柄菌趨電性的前期研究中發(fā)現(xiàn)，野生型細胞（只需要經(jīng)過簡單饑餓處理），甚至是營養(yǎng)生長的細胞都具有趨電性［9］，但缺乏cAMP誘導極化的細胞卻沒有趨化運動，可以說，細胞極化是細胞發(fā)生趨化運動的前提和基礎(chǔ)［12］。據(jù)研究報道，gbpC和gbpD基因在盤基網(wǎng)柄菌細胞中調(diào)控肌球蛋白的磷酸化，并在細胞極化和趨化運動中發(fā)揮不同的作用。gbpC缺失的細胞株表現(xiàn)出細胞極化消失，細胞趨化性顯著降低，而gbpD敲除的細胞株則表現(xiàn)出完全相反的現(xiàn)象，即細胞變得超極化，運動速度和趨化性都顯著增強［12］。因此，為探究極化在細胞趨電性與趨化性中的作用差異，本研究選用了基因gbpC和gbpD為研究對象，通過對兩個基因的細胞趨電性調(diào)控作用研究，同時比較細胞趨電性和趨化性的兩種定向運動模式的異同，為細胞趨化性與趨電性的差異提供新的研究基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 細胞和質(zhì)粒

野生型盤基網(wǎng)柄菌細胞（AX2）、敲除gbpC的RasGEF結(jié)構(gòu)域的突變株（記為gefT null或gefT-）、敲除gbpD的RasGEF結(jié)構(gòu)域的突變株（記為gefU null或gefU-）、Lifeact-GFP質(zhì)粒（David Knecht教授惠贈，來自Department of Molecular and Cell Biology，University of Connecticut）。gefT null和gefU null細胞株由日本NBRP惠贈。

1.2 培養(yǎng)基和緩沖液

HL5培養(yǎng)基：40 g葡萄糖，40 g示蛋白胨，20 g酵母粉，3.86 g磷酸氫二鈉，1.94 g磷酸二氫鉀，0.12 g硫酸鏈霉素，水定容到至4 L，pH 6.5；121°C滅菌30 min。

發(fā)育緩沖液（DB）：先配制10×磷酸鹽緩沖液：12.695 g磷酸氫二鈉，6.803 g磷酸二氫鉀，水定容至1 L；實驗時配制新鮮的1×DB：400 ml 10×磷酸鹽緩沖液、0.8 ml 1 mol/L氯化鈣、4 ml 2 mol/L硫酸鎂，水定容至4 L。

1.5%Agar-DB固體平板：按1.5%的比例在新鮮1×DB緩沖液中加入瓊脂粉或瓊脂條，121°C滅菌30 min，倒平板。

10×Steinberg’s溶液：580 mmol/L氯化鈉，6.7 mmol/L氯化鉀，4.4 mmol/L硝酸鈣，13 mmol/L硫酸鎂，46 mmol/L三羥甲基氨基甲烷，水定容至1 L，pH 7.5～7.7；使用時用水稀釋10倍。

H50緩沖液：20 mmol/L HEPES（4-羥乙基哌嗪乙磺酸）、pH 7.0，50 mmol/L氯化鉀，10 mmol/L氯化鈉，1 mmol/L硫酸鎂，5 mmol/L碳酸氫鈉，1 mmol/L磷酸二氫鈉，過濾除菌。

2 方 法

2.1 細胞培養(yǎng)

從-80°C冰箱里取出凍存的AX2細胞，室溫融化后在超凈工作臺中將凍存管中的細胞懸液轉(zhuǎn)移至裝有15 ml HL5培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，22°C復蘇3 h或過夜。棄培養(yǎng)液后，重新加入15 ml HL5培養(yǎng)基，22°C培養(yǎng)。當細胞密度達到培養(yǎng)皿底面覆蓋率的80%左右時，即可進行傳代。由于盤基網(wǎng)柄菌細胞貼壁較松，因此，通過用移液槍吸取液體后推出的機械沖力即可將細胞懸浮。經(jīng)過3次傳代的細胞長到指數(shù)生長期時，即可用于實驗。

gefU null突變株的培養(yǎng)與AX2細胞的培養(yǎng)方法一致。gefT null突變株為尿嘧啶缺陷型，因此在培養(yǎng)時，需要在HL5培養(yǎng)基中需加入尿嘧啶，其他培養(yǎng)方法與AX2細胞一致。

2.2 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化

收集指數(shù)生長期的AX2細胞，冰上靜置15 min后，2 000 r/min，5 min，4℃，棄去上清液；用冰浴處理的H50緩沖液洗2次，2 000 r/min，4℃離心5 min，棄去上清。用適量的H50緩沖液將細胞重懸，調(diào)節(jié)細胞濃度至1～5×1010個/L。取100μl細胞懸液與5μl Lifeact-GFP質(zhì)粒DNA混合，轉(zhuǎn)入0.1 cm的電擊杯中，電擊2次，條件：750 V，25μF，每次電擊間隔5 s。電擊結(jié)束后將電擊杯放置在冰浴上靜置5 min使細胞恢復。將電擊杯中細胞懸液轉(zhuǎn)入加有HL5培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，22℃培養(yǎng)24 h后，在培養(yǎng)基中加入潮霉素B（30 mg/L）進行陽性克隆子的篩選。約3 d后，未轉(zhuǎn)化的細胞逐漸死亡，而轉(zhuǎn)化細胞開始貼壁。7～10 d后，陽性克隆被篩選出來。

gefT null和gefU null突變株的Lifeact-GFP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化的實驗操作與AX2相同。

2.3 熒光顯微鏡觀察電場中細胞的肌動蛋白分布

待陽性克隆子篩選出來后，取指數(shù)生長期的細胞，置于DB緩沖液中饑餓處理3 h后，將細胞種植到制作好加電小室的蓋玻片（40 mm×60 mm）上，貼壁后用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的分布情況，必要時施加12 V/cm的直流電場，以20 s拍攝一幀照片的頻率記錄細胞的運動狀態(tài)。

2.4 多細胞發(fā)育實驗

取指數(shù)生長期的AX2細胞，將細胞收集到50 ml離心管中，2 000 r/min離心5 min，棄上清，用新鮮的DB緩沖液重懸后，再次離心，棄上清，最后用適量的DB重懸細胞，并用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)。從懸液中取約5×107個細胞，轉(zhuǎn)到1.5%Agar-DB固體平板上，輕輕晃動平板，以使細胞均勻分布在平板上，22°C正置1 h后，去除殘留液體，并倒置培養(yǎng)，期間用倒置顯微鏡可觀察細胞的發(fā)育情況，約22～24 h，多細胞發(fā)育完成形成具有孢子結(jié)構(gòu)的多細胞體。

gefT null和gefU null突變株的多細胞發(fā)育實驗操作與AX2相同。

2.5 細胞趨電運動

取指數(shù)生長期的細胞（AX2、gefT null突變株、gefU null突變株），用DB緩沖液洗2次后，繼續(xù)用DB緩沖液使細胞饑餓3 h。重懸細胞后，取適量細胞種到加電小室中，待貼壁后，在小室兩端連接場強為12 V/cm的直流電場，用帶有CCD的顯微鏡記錄細胞在電場中的運動情況，拍照頻率為間隔1 min拍1幀，共30 min。拍照結(jié)束后，將圖片導入imageJ軟件中進行分析。每組實驗至少重復3次，每次分析的細胞個數(shù)為50個。為定量的反應細胞在電場中的運動方向，本研究選用方向性指數(shù)（directedness）和方向持續(xù)性指數(shù)（persistency）兩個參數(shù)。其中，方向性指數(shù)用細胞起始位置和最終位置連線與電場矢量方向夾角的余弦值來評估，而方向持續(xù)性指數(shù)是細胞位移和軌跡的比值，比值越大，說明細胞沿某個方向的運動過程較為“筆直”，比值越小，說明細胞在沿某個方向運動過程更為“曲折”。細胞在電場中的運動速度是細胞趨電性的另一個指標，本研究選用軌跡速度（track speed）和位移速度（displacement speed）兩個參數(shù)。軌跡速度指的是細胞在單位時間（min）內(nèi)的平均運動距離（μm），位移速度指的是單位時間（min）內(nèi)的平均位移距離（μm）。

2.6 蛋白質(zhì)印跡

2.6.1蛋白質(zhì)樣品的收集

收集指數(shù)生長期的細胞（AX2、gefT null或gefU null），用DB緩沖液洗2次，2 000 r/min，離心5 min。徹底棄去上清液后，重懸于DB緩沖液至終濃度為2×1010個/L。取適量細胞種植于加電小室（40 mm×40 mm）中，在兩端施加12 V/cm的直流電場，30 min后，收集細胞，棄上清加入裂解液，并立即放入沸水浴中保溫5 min。取出稍冷卻后，12 000 r/min，離心1 min，上清即為蛋白質(zhì)樣品。

2.6.2蛋白質(zhì)電泳及印跡

SDS-PAGE電泳使用Bio-Rad公司生產(chǎn)的預制膠。將SDS-PAGE膠安裝在電泳儀中，按15μl/孔的樣品進行上樣。先用150 V電壓濃縮蛋白質(zhì)，再用80～120 V電壓分離蛋白質(zhì)。

制備“三明治”的轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，安裝到轉(zhuǎn)膜儀中，根據(jù)蛋白質(zhì)條帶大小調(diào)整轉(zhuǎn)膜的電壓和時間。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜，用TBST清洗15 min，共3次。根據(jù)蛋白質(zhì)大小將PVDF膜剪開，分別用一抗（含TBST/2%脫脂奶粉）孵育，室溫1 h后，取出PVDF膜，并用TBST洗膜4次，每次2 mim。二抗孵育，室溫1 h，再用TBST洗膜4次，每次2 mim。按比例現(xiàn)配顯影液，將PVDF膜浸泡于顯影液中1 min，用成像系統(tǒng)進行顯影。

3 結(jié) 果

3.1 gefT null和gefU null突變株的多細胞發(fā)育

盤基網(wǎng)柄菌具有特殊的生命周期，通常情況下，以游離的單細胞獨立生活，當環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)匱乏或條件不適宜時，一些“中心細胞”首先向環(huán)境中分泌cAMP引起周圍細胞發(fā)生極化，并朝高濃度的cAMP聚集，最終完成從單細胞的生命周期向多細胞的生命周期的轉(zhuǎn)變。

據(jù)研究報道，盡管gbpC突變株和gbpD突變株表現(xiàn)出完全相反的趨化性，但均能在DB瓊脂上完成與野生型細胞一致的多細胞發(fā)育過程，而且在發(fā)育的時間上，也與野生型細胞發(fā)育沒有差異［12］。其原因可能是細胞在不同材質(zhì)的表面運動模式不一樣。另外，在細胞發(fā)育過程中，由于細胞的密度較大，因此發(fā)育過程中對細胞趨化性運動的需求相對較低，細胞能夠聚集并完成發(fā)育，即便細胞具有較強的趨化運動，但是細胞需要在基因?qū)用鎸Χ嗉毎陌l(fā)育進行調(diào)控，從而發(fā)育時間也與野生型的細胞無明顯差異。本研究結(jié)果也表明（圖1），僅缺失RasGEF結(jié)構(gòu)域的gefT null突變株和gefU null突變株也都能夠在DB瓊脂上完成與野生型細胞一致的多細胞發(fā)育過程，而且在發(fā)育的時間上，也與野生型細胞發(fā)育沒有差異。說明RasGEF結(jié)構(gòu)域是gbpC和gbpD基因中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，調(diào)控著兩個基因的重要功能。

Fig.1 Developmental phenotypes of wild-type and rasGEF null cells

3.2 gefT null和gefU null突變株的細胞形態(tài)與運動速度

細胞極化的調(diào)控在細胞的趨化性運動中發(fā)揮重要作用。在cAMP濃度梯度環(huán)境中，盤基網(wǎng)柄菌形成具有明顯前端和后端的極化細胞，這個過程也是細胞發(fā)生朝向或遠離高濃度化學因子趨化性運動的前提和基礎(chǔ)。研究報道，gbpC缺失突變株由于不能形成明顯的前端和后端，且側(cè)生偽足比較多，因此，細胞運動速度較慢。而gbpD缺失突變株卻與之完全相反，細胞發(fā)生超極化，細胞的運動速度較快（圖2a）。本研究的細胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)：gefT null突變株細胞形態(tài)為橢圓形，相同的時間內(nèi)移動的距離較短；gefU null突變株細胞形態(tài)呈現(xiàn)細長形狀，運動時有明顯的前端和后端，且相同時間內(nèi)移動的距離較長（圖2b）。

Fig.2 Cell morphology of gefT null and gefU null mutant strains

3.3 gefT null和gefU null突變株對直流電場的響應

細胞隨機運動實驗表明，gefT null突變株細胞也形成較多的側(cè)生偽足，運動速度較慢，約為（3.88±0.09）μm/min，與野生型細胞的運動速度較為接近，即（3.80±0.07）μm/min。而gefU null突變株細胞發(fā)生明顯的極化，運動速度較快，約為（7.20±0.17）μm/min（圖3a）。細胞在微小直流電場中表現(xiàn)出朝向陽極或陰極的定向遷移現(xiàn)象被稱為細胞的趨電性。野生型盤基網(wǎng)柄菌細胞AX2、gefT null突變株和gefU null突變株在強度為12V/cm的直流電場中，都發(fā)生朝向陰極的定向遷移（圖3b，c）。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示（圖4），野生型細胞在直流電場中的方向性指數(shù)為0.86±0.01，方向持續(xù)性指數(shù)為0.48±0.01。gefT null突變株和gefU null突變株在相同強度的直流電場中的方向性指數(shù)分別為0.81±0.01和0.60±0.01，方向持續(xù)性指數(shù)分別為0.41±0.01和0.36±0.01。統(tǒng)計結(jié)果表明，gefT null突變株的趨電性與野生型之間沒有差異，但gefU null突變株的趨電性與野生型和gefT null突變株都存在顯著差異。

Fig.3 Trajectory of gefT null and gefU null mutants

AX2、gefT null突變株和gefU null突變株在強度為12 V/cm直流電場中的軌跡速度和位移速度分析顯示（圖4），野生型細胞的軌跡速度為（5.02±0.03）μm/min，位移速度為（2.45±0.02）μm/min。gefT null突變株和gefU null突變株在相同強度直流電場中的軌跡速度分別為（3.23±0.04）μm/min和（5.57±0.13）μm/min，軌 跡 速 度 分 別 為（1.22±0.03）μm/min和（2.22±0.09）μm/min。統(tǒng)計結(jié)果表明，gefU null突變株在電場中的運動速度與野生型相似，兩者之間無差異，但gefT null突變株在電場中的運動速度與野生型和gefU null突變株之間存在顯著性差異。與隨機運動實驗結(jié)果相比，野生型細胞的運動速度在電場作用下有增強的趨勢，但gefT null突變株和gefU null突變株的運動速度都有降低的趨勢，尤其是gefU null突變株的運動速度降低的趨勢更明顯。

Fig.4 Direction of gefT null and gefU null mutants in a DC EF at 12 V/cm

3.4 直流電場中的細胞骨架變化與速度調(diào)控

肌動蛋白和肌球蛋白是細胞運動過程中調(diào)節(jié)細胞骨架重排的重要成分。肌動蛋白通過聚集負責形成新的偽足，而肌球蛋白是維持細胞極化和偽足收縮的重要調(diào)節(jié)因子。為了探討肌動蛋白和肌球蛋白在細胞趨電運動中的作用，本研究用lifeact-GFP標記肌動蛋白，觀察活細胞中在直流電場中肌動蛋白的分布與變化，并用肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈（regulatory light chain，RLC）磷酸化抗體檢測電場對細胞肌球蛋白的作用及變化。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受直流電場刺激后，野生型細胞和突變株細胞的F-actin分布并沒有呈現(xiàn)明顯的改變，仍然分布在細胞偽足著生處，且這種分布在整個施加電場的過程中保持一致（圖5）。此外，由于gefT null細胞株未發(fā)生明顯極化，F(xiàn)-actin-GFP主要分布在側(cè)生偽足上。這些現(xiàn)象與cAMP誘導的F-actin聚集存在較大差異。文獻報道，利用鬼筆環(huán)肽標記細胞骨架實驗中，cAMP誘導野生型細胞的F-actin聚集存在雙相波的變化，F(xiàn)-actin聚集的峰值發(fā)生在cAMP刺激后的5 s左右，而后瞬時降低，一直到50 s左右下降到最低，之后恢復到原來的水平，這也是趨化性和趨電性的重要差別之一。

作為維持細胞極化和收縮重要調(diào)節(jié)因子的肌球蛋白，也是細胞趨化運動的必要因素，受到RLC和重鏈（heavy chain，MHC）的磷酸化調(diào)控。其中，RLC的磷酸化增加肌球蛋白ATP酶活性，而MHC磷酸化調(diào)控肌球蛋白絲的形成。直流電場作用下的細胞運動，仍需要細胞收縮。通過蛋白質(zhì)印跡研究電場作用下的RLC磷酸化變化情況，結(jié)果顯示（圖6），野生型細胞中，RLC的磷酸化受電場的指導，并且以一種時間依賴的方式發(fā)生磷酸化，這也有可能就是電場作用下細胞運動速度變快的原因之一。而兩個突變株的RLC磷酸化受電場指導情況并不一致，gefT null突變株受電場刺激1 min時有降低的趨勢，但隨電信號刺激時間的延長，RLC磷酸化呈現(xiàn)上升趨勢，這可能就是維持細胞在電場中平均速度與隨機運動接近的原因。而在gefU null細胞中，電場刺激后，RLC的磷酸化反而以時間依賴的方式被抑制，同樣，推測這可能就是導致電場刺激下突變株的運動速度與隨機運動相比較反而降低的原因之一。

Fig.6 DC EF-induced phosphorylation of myosin regulatory light chain(RLC)

4 討 論

盤基網(wǎng)柄菌雖然是一種低等的真核生物，但卻擁有很多與高等真核細胞同源性很高的基因及保守的分子機制。人們常用它來研究阿米巴式的細胞運動。目前所了解的阿米巴式真核細胞遷移，大多都是通過對盤基網(wǎng)柄菌的研究揭示的。例如，肌動蛋白的黏合蛋白（冠蛋白）的鑒定［13］、細胞骨架成分參與細胞遷移的功能冗余［14］、肌球蛋白II在細胞遷移中的作用［15］、GPCRs趨化性受體的鑒定［16］、磷酸肌醇和G蛋白信號事件對遷移細胞前沿的限制作用［17］，包括細胞遷移中Ras GTP酶［18］、肌動蛋白波的發(fā)現(xiàn)［19］等。

盤基網(wǎng)柄菌也是用來研究細胞趨化性和趨電性運動機制的理想模型。前期的研究發(fā)現(xiàn)，細胞的趨電性與趨化性在模式上比較相似，都是在細胞前端或者后端有特殊的蛋白質(zhì)受體聚集。另一方面，趨化性和趨電性的信號轉(zhuǎn)導通路并不是完全重疊的［20］。而本研究結(jié)果表明，含有RasGEF結(jié)構(gòu)域的gbpC和gbpD在盤基網(wǎng)柄菌的趨化性和趨電性中發(fā)揮不同作用。在趨化運動中，gbpC通過調(diào)控細胞極化來促進細胞的趨化運動，當gbpC基因缺失后，細胞的極化消失，趨化運動被抑制；gbpD誘導附著基質(zhì)的偽足形成，從而負調(diào)控細胞運動速度和細胞極化［12］。在趨電運動中，敲除gbpCRasGEF結(jié)構(gòu)域的突變株（gefT null）極化消失，但細胞的趨電性卻保持不變。而敲除gbpDRasGEF結(jié)構(gòu)域的突變株（gefU null）發(fā)生超極化，但細胞的趨電性顯著降低。肌動蛋白在化學刺激和直流電場刺激后的變化也有差異，受化學信號刺激后，肌動蛋白發(fā)生明顯的跨膜過程，但受直流電場刺激則并未發(fā)生明顯的跨膜過程，而是一直保持原來的熒光水平。受兩種不同信號刺激的肌球蛋白輕鏈磷酸化方式也存在差異，文獻報道稱受cAMP刺激的盤基網(wǎng)柄菌野生型細胞的肌球蛋白RLC發(fā)生瞬時磷酸化，而本研究發(fā)現(xiàn)受電場刺激的RLC以時間依賴的方式發(fā)生磷酸化，且電場刺激下兩個突變株細胞的RLC磷酸化方式也存在差異。

5 結(jié) 論

本項研究結(jié)果表明，細胞的趨電性和趨化性之間存在許多差異。首先，趨化性對細胞極化的依賴程度高于趨電性。其次，肌動蛋白和肌球蛋白在化學信號和電信號刺激下的作用方式也不同。除了本研究發(fā)現(xiàn)的新差異，一些未知的信號通路也可能分別參與了細胞的趨化性和趨電性，包括信號的感應、遷移方向的確定、遷移方向的維持，以及細胞黏附的控制和細胞速度的調(diào)控，這些都需要研究者們做進一步的探索。