張志偉,聶士昊,汪俊卿,王瑞明,張子洋,申作樹,王龍祥,李丕武
(1.齊魯工業(yè)大學(xué)生物基材料與綠色造紙國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250399;2.山東福瑞王酒業(yè)有限公司,山東臨沂 276621)
白酒是世界六大蒸餾酒之一,有12 種香型?!八母邇砷L(zhǎng)”的發(fā)酵特點(diǎn)賦予了醬香型白酒獨(dú)特的醬香味,其“醬香突出、醇厚綿長(zhǎng)”等特點(diǎn)深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。白酒釀造本質(zhì)上是各類微生物作用于糧谷后進(jìn)行的代謝反應(yīng),南北方環(huán)境差異對(duì)酒醅中的微生物影響很大,進(jìn)而影響白酒風(fēng)味。在對(duì)南方醬香酒酒醅微生物研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌、絲狀真菌、酯化酵母這三類微生物在發(fā)酵過(guò)程中多次被檢測(cè)到,猜想這些微生物對(duì)醬香酒風(fēng)味有重要影響。
白酒釀造過(guò)程中微生物種類、數(shù)量是在不斷變化的,現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步提供了先進(jìn)檢測(cè)方法,例如16S rRNA 和ITS rDNA 檢測(cè)提供了細(xì)菌和真菌的同源性分析,運(yùn)用PCR-DGGE 方法可對(duì)酒曲細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析等。高通量測(cè)序目前運(yùn)用在很多方面,這項(xiàng)技術(shù)可以快速測(cè)序幾十萬(wàn)到上百萬(wàn)DNA,并且可以檢測(cè)含量極低的DNA,目前高通量測(cè)序已經(jīng)在發(fā)酵食品的真菌檢測(cè),海水微生物檢測(cè),土壤中微生物檢測(cè)和醫(yī)學(xué)上進(jìn)行應(yīng)用。采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)南方醬香型白酒微生物進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)在第四輪次酒醅中主要優(yōu)勢(shì)真菌有嗜熱子囊菌屬()、嗜熱真菌屬();堆積發(fā)酵過(guò)程中乳酸桿菌屬、埃希氏菌屬()和芽孢桿菌屬()為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌;窖池發(fā)酵階段乳酸桿菌屬占絕對(duì)主導(dǎo)地位,并且豐度隨著發(fā)酵的進(jìn)行不斷上升。
運(yùn)用氣相色譜聞香法(GC-O)、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)等現(xiàn)代方法對(duì)醬香白酒風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、2,3,5,6-四甲基吡嗪的含量突出。四甲基吡嗪不但能賦予醬香酒獨(dú)特風(fēng)味,還是中藥材川芎根莖的主要活性成分,具有治療心血管疾病,保護(hù)肝臟等作用;乙酸乙酯對(duì)甲醛具有抑制作用,可以加快身體里不良物質(zhì)的代謝;己酸乙酯有維護(hù)心肺功能的作用;4-甲基愈創(chuàng)木酚等酚類物質(zhì)具有預(yù)防疾病、抗衰老等作用。這些風(fēng)味物質(zhì)的提高不僅有助于北方醬香白酒風(fēng)味的改善,還對(duì)消費(fèi)者有促進(jìn)健康的積極作用。
通過(guò)和北方醬香酒公司進(jìn)行合作,加入芽孢桿菌、絲狀真菌、酯化酵母3 種微生物,結(jié)合高通量測(cè)序和氣相-質(zhì)譜(GC-MS)結(jié)果進(jìn)一步了解這三類菌對(duì)醬酒的風(fēng)味的影響。
樣品:酒醅,山東福瑞王酒業(yè)有限公司的第五輪次發(fā)酵結(jié)束時(shí),取上層、中層、下層及三層酒醅混合的4個(gè)酒醅樣品;酒樣,對(duì)應(yīng)酒醅蒸餾的酒樣。
取樣方法:根據(jù)五點(diǎn)等距取樣方法,在上、中、下層的中心點(diǎn)取樣,保持相同的距離。
微生物:芽孢桿菌、絲狀真菌、酯化酵母,實(shí)驗(yàn)室保存菌種。
LB 培養(yǎng)基:5 %酵母浸粉,10 %蛋白胨,10 %氯化鈉,加去離子水后121 ℃滅菌20 min。
儀器設(shè)備:氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS),型號(hào)GCMS-QP2020,日本島津公司;Hermle 500 mL離心機(jī)。
1.2.1 強(qiáng)化酒醅制作方法
(1)上述3 種微生物用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,隨后離心沉淀。
(2)制作種子強(qiáng)化大曲:在制作普通大曲的培養(yǎng)過(guò)程中,向大曲中添加質(zhì)量10 %的微生物沉淀(50%芽孢桿菌、20%絲狀真菌、30%酯化酵母)。
(3)強(qiáng)化酒醅制作:向酒醅中加入酒醅質(zhì)量0.7%的大曲(10%強(qiáng)化大曲、90%普通大曲)。
1.2.2 酒醅的取樣方法
在第五輪次發(fā)酵結(jié)束后,立即對(duì)對(duì)照組上層(SC-1)、對(duì)照組中層(ZC-1)、對(duì)照組下層(XC-1)以及實(shí)驗(yàn)組上層(SC-2)、實(shí)驗(yàn)組中層(ZC-2)、實(shí)驗(yàn)組下層(XC-2)的酒醅進(jìn)行五點(diǎn)取樣,取500 g 酒醅放入無(wú)菌的離心管中,立即存放至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?duì)每池的酒醅進(jìn)行混合,對(duì)照組三層酒醅混合樣(HH-1)、實(shí)驗(yàn)組三層酒醅混合樣(HH-2)共計(jì)8 個(gè)酒醅樣送高通量測(cè)序。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各取500 mL蒸餾酒,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.3 高通量測(cè)序測(cè)序方法
PCR 擴(kuò)增細(xì)菌使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA G-3′)和806R(5′-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增V4 高變區(qū);真菌使用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGG AAGTAA-3′)和2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)擴(kuò)增高變區(qū)。30 μL PCR 混合體系中含Tks Gflex DNA Polymerase酶0.6 μL,前引物1 μL(5 pmol/μL),后引物1 μL(5 pmol/μL),2×Gflex PCR Buffer 緩沖液15 μL,模版脫氧核糖核酸(DNA)1 μL,無(wú)菌水補(bǔ)足30 μL。PCR條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s;56 ℃復(fù)性30 s;72 ℃延伸20 s;共26個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。
1.2.4 GC-MS測(cè)定條件
表1 氣相升溫程序
表2 氣相參數(shù)
氣相條件:樣品通過(guò)InertCap 毛細(xì)管柱(膜厚0.25 μm,長(zhǎng)度30 m,內(nèi)徑0.25 μm)進(jìn)行分離。
質(zhì)譜條件:分離后的樣品用質(zhì)譜儀鑒定,質(zhì)譜條件EI:電離源;電子能量:0.1 KV;離子源溫度:230 ℃;掃描范圍:29~500 amu。
根據(jù)16S rDNA 測(cè)序分析結(jié)果得出細(xì)菌多樣性指數(shù)分析。
根據(jù)Shannon、Simpson 指數(shù)顯示實(shí)驗(yàn)組的群落多樣性要高于對(duì)照組,Coverage 指數(shù)顯示8 個(gè)樣品中序列沒(méi)有被檢測(cè)出來(lái)的可能性很低,此結(jié)果有很高的可信度。
酒醅在第五輪次發(fā)酵結(jié)束后,實(shí)驗(yàn)池和對(duì)照池細(xì)菌種類均為下層最多,對(duì)照組的細(xì)菌OTU 數(shù)量關(guān)系為下層=上層>中層,實(shí)驗(yàn)組的細(xì)菌OTU 數(shù)量關(guān)系為下層>中層>上層。
圖1 酒醅樣品細(xì)菌門水平豐富度
圖2 酒醅樣品細(xì)菌屬水平豐富度
對(duì)照組的優(yōu)勢(shì)菌門是變形菌門,數(shù)量關(guān)系為上層>中層>下層,實(shí)驗(yàn)組的優(yōu)勢(shì)菌門是厚壁菌門,數(shù)量關(guān)系為中層>上層>下層,兩者優(yōu)勢(shì)微生物的數(shù)量都是下層最少。對(duì)照組優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為變形菌門,醋酸桿菌屬(),芽孢桿菌屬();實(shí)驗(yàn)組優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為厚壁菌門,芽孢桿菌屬()。根據(jù)Shannon 和Simpson 指數(shù)得出實(shí)驗(yàn)組的細(xì)菌群落多樣性高于對(duì)照組,說(shuō)明加入的芽孢桿菌在發(fā)酵過(guò)程中很好的存在,并發(fā)揮了作用。
表3 酒醅樣品細(xì)菌多樣性分析
表4 酒醅樣品真菌多樣性分析
酒醅在第五輪次發(fā)酵結(jié)束后,對(duì)照組的真菌OTU 數(shù)量關(guān)系為上層=中層>下層,實(shí)驗(yàn)組的細(xì)菌OTU 數(shù)量關(guān)系為下層>中層>上層,對(duì)照組的情況與胡峰、徐佳等研究一致,實(shí)驗(yàn)組加入的芽孢桿菌對(duì)酵母菌形成正向影響,對(duì)真菌數(shù)量形成影響,因此實(shí)驗(yàn)組的真菌種類高于對(duì)照組,芽孢桿菌促進(jìn)酯化酵母的生長(zhǎng)使得OTU 數(shù)量關(guān)系為下層>中層>上層。
圖3 酒醅樣品真菌屬水平多樣性分析
實(shí)驗(yàn)組優(yōu)勢(shì)真菌為子囊菌門,酵母屬(),畢赤酵母屬()。對(duì)照組優(yōu)勢(shì)真菌為子囊菌門,酵母屬(),曲霉屬()。由此可見(jiàn),加入的酯化酵母和絲狀真菌在發(fā)酵過(guò)程中得到保存。
強(qiáng)化酒醅中加入微生物對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的影響,目前已經(jīng)有了一些研究成果。芽孢桿菌形成復(fù)雜多樣的酶系(蛋白酶、淀粉酶等),代謝物質(zhì)乙偶姻在發(fā)酵過(guò)程與氨形成醬香酒特征性物質(zhì)2,3,5,6-四甲基吡嗪;酯化酵母在白酒發(fā)酵過(guò)程中主要有酒化和酯化的作用,酯化酵母在醪液中生成醛、酯、醇、酸等物質(zhì),對(duì)乙酸乙酯的含量有提高作用;絲狀真菌主要是利用糖化力分解蛋白質(zhì)、淀粉,提供給其他微生物利用,形成酯類、醛類物質(zhì),對(duì)酸堿平衡有積極作用。
通過(guò)GC-MS處理對(duì)照池和實(shí)驗(yàn)池的蒸餾酒樣品,結(jié)果見(jiàn)圖4。
圖4 風(fēng)味物質(zhì)含量對(duì)比圖
白酒中乙醇和水占總量的98 %~99 %,但白酒的風(fēng)味主要由1%~2%的風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生。GCMS 結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組共檢測(cè)出59 種風(fēng)味物質(zhì)(酯類25 種、醇類17 種、醛類4 種、酸類6 種、酮類1種、其他6 種),對(duì)照組共檢測(cè)出58 種風(fēng)味物質(zhì)(酯類21 種、醇類17 種、醛類5 種、酸類5 種、酮類1種、其他9 種)。由圖4 可知,實(shí)驗(yàn)組的乳酸乙酯(12.03 g/L)、己酸乙酯(1.32 g/L)、乙酸(4.57 g/L)、乙酸乙酯(8.12 g/L)、1-丙醇(0.90 g/L)、2,3,5,6-四甲基吡嗪(0.01 g/L)、甲酸乙酯(0.15 g/L)含量要高于對(duì)照組的乳酸乙酯(9.85 g/L)、己酸乙酯(0.90 g/L)、乙酸(3.65 g/L)、乙酸乙酯(6.75 g/L)、1-丙醇(0.76 g/L)、2,3,5,6-四甲基吡嗪(0.008 g/L)、甲酸乙酯(未檢測(cè)出);糠醛的含量實(shí)驗(yàn)組(0.32 g/L)低于對(duì)照組(0.34 g/L)。乙酸乙酯具有抗腫瘤、保護(hù)肝臟等作用;乙酸具有殺菌,幫助消化,降血脂等功能;2,3,5,6-四甲基吡嗪有擴(kuò)張血管,抑制血栓形成,調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,調(diào)節(jié)免疫等作用;糠醛對(duì)人體有損害肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等有害作用。根據(jù)氣質(zhì)結(jié)果可以看到有益的風(fēng)味物質(zhì)在增加而糠醛等有害物質(zhì)在減少,說(shuō)明強(qiáng)化酒醅釀造的白酒對(duì)人體更加有益。
通過(guò)上述結(jié)果可以得出加入酯化酵母、絲狀真菌、芽孢桿菌的加強(qiáng)酒醅,使醬香酒的風(fēng)味物質(zhì)種類更加豐富多樣,可以有效提高乳酸乙酯、己酸乙酯、乙酸、2,3,5,6-四甲基吡嗪、甲酸乙酯等有益物質(zhì)的含量,尤其是醬香酒獨(dú)特風(fēng)味物質(zhì)2,3,5,6-四甲基吡嗪的含量由0.008 g/L 提高到了0.01 g/L,使北方醬香酒醬香味更加醇厚,有助于改善北方醬香型白酒風(fēng)味。
本研究證明,對(duì)北方醬香酒酒醅加入上述3 種微生物后有利于提高北方醬香酒的醬香風(fēng)味,有助于提高白酒的有益風(fēng)味物質(zhì)的含量,降低有害物質(zhì)的含量。目前對(duì)醬香酒發(fā)酵微生物研究主要集中于這3 種微生物,很多有益微生物的作用有待研究,希望將來(lái)能在微生物方面對(duì)北方醬香酒風(fēng)味進(jìn)行改善。