■吳慶宇 孫 蕓 楊晶晶 張嘉賓 王 健 周 昕 黃秋連 曹 陽，2，3*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍 江大慶 163319；2.糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江大慶 163319；3.黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍 江大慶 163319）

紫花苜蓿（Medicago sativaL.）是一種優(yōu)質(zhì)粗飼料資源，因其耐低溫、耐鹽堿能力強(qiáng)、產(chǎn)量高、適口性好、蛋白質(zhì)含量高、氨基酸齊全、富含動(dòng)物所需的維生素和礦物質(zhì)等因素，被譽(yù)為“牧草之王”，在東北等地區(qū)被廣泛種植[1-4]。近年來，隨著我國人民生活水平的不斷提高，人們對(duì)肉、蛋、奶等食物的需求不斷地增加，這使得我國奶牛養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大，同時(shí)對(duì)優(yōu)質(zhì)粗飼料的需求量也逐漸增加，而如何全年不間斷地為奶牛提供優(yōu)質(zhì)粗飼料成為了飼料加工業(yè)與草食動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的關(guān)注熱點(diǎn)。特別是在北方寒冷地區(qū)，草食動(dòng)物要安全度過寒冷無草的季節(jié)，需要儲(chǔ)存半年以上的草料。青貯是貯藏牧草的有效方法之一，然而，黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在研究低溫對(duì)玉米秸稈黃貯發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性的影響[5]、不同溫度對(duì)油莎草青貯品質(zhì)的影響[6]中發(fā)現(xiàn)低溫不利于牧草青貯發(fā)酵。因此，探討低溫季節(jié)苜蓿青貯過程中發(fā)酵品質(zhì)及微生物的變化規(guī)律，對(duì)獲得優(yōu)質(zhì)苜蓿青貯，為草食家畜提供安全飼草非常重要。

青貯是將收割的飼草鍘短后密封，進(jìn)行厭氧發(fā)酵。由于剛收割的牧草細(xì)胞并未立刻死亡，植物細(xì)胞將窖內(nèi)殘存的氧氣進(jìn)行利用，從而消耗飼草的可溶性碳水化合物，產(chǎn)生熱量，來促使乳酸菌發(fā)酵[7]。乳酸菌利用飼草中的碳水化合物轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)酸，進(jìn)而使飼草的pH下降，當(dāng)pH下降到一定水平時(shí)能有效抑制有害菌的生長繁殖，從而達(dá)到長期保存的目的[8-10]。但北方寒流侵襲較早，使青貯環(huán)境溫度很難達(dá)到適宜乳酸菌繁殖所需的19～37 ℃，只能通過密封后自主產(chǎn)熱來維護(hù)乳酸菌繁殖，而溫度下降會(huì)使附生菌群代謝活性降低，大部分乳酸菌發(fā)酵能力受到抑制，產(chǎn)生乳酸緩慢[11-12]。Zhou等[13]通過在不同溫度下對(duì)全株玉米青貯發(fā)酵發(fā)現(xiàn)低溫會(huì)改變飼料內(nèi)附生菌群的多樣性。謝華德等[5]發(fā)現(xiàn)在玉米秸稈中添加乳酸菌進(jìn)行低溫黃貯會(huì)降低乳酸菌的發(fā)酵速度。

本試驗(yàn)采用小規(guī)模發(fā)酵的方式，調(diào)查分析低溫條件下紫花苜蓿青貯的營養(yǎng)成分、微生物數(shù)量以及發(fā)酵品質(zhì)的變化規(guī)律，探索低溫下改善苜蓿青貯品質(zhì)的調(diào)制加工技術(shù)，為青貯貯藏過程中溫度變量對(duì)青貯好壞的影響提供數(shù)據(jù)支持，為牛羊養(yǎng)殖提供優(yōu)質(zhì)安全飼草，進(jìn)而為人類提供健康安全的畜產(chǎn)品具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為于2020年10月取自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)試驗(yàn)田的紫花苜蓿，黑龍江省大慶市讓胡路區(qū)喇嘛甸鎮(zhèn)紅驥牧場。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用雙因素（溫度×貯藏時(shí)間）完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，處理組分別為常溫組（RT 組）與低溫組（LT 組）。將新鮮的苜蓿樣品放在陰涼干燥的地方，使用快速水分測定方法確定樣品中的水分，當(dāng)濕度為65%時(shí)，使用鍘刀將其切成2～3 cm。稱取200 g 樣品裝入食品級(jí)聚乙烯袋中進(jìn)行真空密封保存，共裝取樣品42袋，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。樣品平均置于常溫（25±2）℃和低溫（4±2）℃下貯藏，并分別在發(fā)酵1、3、5、7、15、30、60 d開封，取樣進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 感官品質(zhì)測定

參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)司制訂的《青貯飼料質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》[14]，對(duì)試驗(yàn)青貯后樣品進(jìn)行觸摸、鼻聞、壓碎，對(duì)其質(zhì)地、顏色、氣味、硬度、霉變評(píng)價(jià)。

1.3.2 常規(guī)營養(yǎng)成分指標(biāo)

將開袋后的紫花苜蓿青貯樣品置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DGG-9240B型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）中烘至恒重（65 ℃）。采用微型植物破碎機(jī)（FZ-102 型，臨沂正衡華玻儀器有限公司）粉碎至0.5 mm備用。參考AOAC（1990）法[15]，采用電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱測定并計(jì)算干物質(zhì)（DM）含量；使用自動(dòng)凱氏定氮儀（K1100F 型，濟(jì)南海能儀器有限公司）測量粗蛋白（CP）、索氏提取器測定粗脂肪（EE）、馬弗爐測定有機(jī)物（OM）含量；采用纖維分析儀（ANKOM A200i型，北京安科博瑞科技有限公司）測定中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）；采用蒽酮比色法[16]分析可溶性碳水化合物（WSC）含量。

1.3.3 發(fā)酵品質(zhì)測定

將20 g 發(fā)酵的苜蓿樣品放入聚乙烯袋中，加入180 mL無菌純化水，用均質(zhì)器拍打90 s以完成混勻，然后過濾[17]。使用便攜式pH計(jì)（FG2-FK型，上海八九實(shí)業(yè)有限公司）測量提取液的pH。將一部分提取物過濾，并將濾液在高速冷凍離心機(jī)（6 500 r/min，4 ℃）中離心5 min，然后通過0.22 μm過濾器過濾。參考Cao等[18]的方法，運(yùn)用LC-100高效液相色譜儀測定樣品的乳酸（LA）、乙酸（AA）、丙酸（PA）和丁酸（BA）的含量。采用凱氏定氮法測定并計(jì)算氨態(tài)氮/總氮（NH3-N/TN）含量。

1.3.4 微生物數(shù)量分析

采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)紫花苜蓿青貯樣品中乳酸菌、芽孢桿菌、好氧性細(xì)菌、酵母菌、大腸桿菌、丁酸梭菌、霉菌進(jìn)行計(jì)數(shù)[19]。適當(dāng)稀釋倍數(shù)后產(chǎn)生30～300 個(gè)菌落的情況下，計(jì)數(shù)菌落，并用每克鮮重中菌落形成單位的對(duì)數(shù)表示菌落數(shù)[lg（CFU/g FM）]。取20 g紫花苜蓿青貯置于裝有180 mL 無菌純化水的樣品袋中，利用均質(zhì)器（BAGMIXER-400W，Interscience，法國），均質(zhì)90 s，并進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋。每份浸提液取20 μL，滴加到提前預(yù)備的培養(yǎng)基上。乳酸菌和丁酸梭菌分別使用MRS 瓊脂培養(yǎng)基和強(qiáng)化梭菌鑒別瓊脂培養(yǎng)基（青島海博生物科技有限公司），置于厭氧培養(yǎng)箱（30 ℃、48 h）培養(yǎng)并計(jì)數(shù)。酵母菌和霉菌使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（通過菌落外觀和細(xì)胞形態(tài)將酵母菌與霉菌或細(xì)菌區(qū)分開來）；大腸桿菌使用Blue Light Broth Agar 培養(yǎng)基（Nissui Ltd，日本）；芽孢桿菌和好氧性細(xì)菌使用Standard Method Ager 培養(yǎng)基（Nissui Ltd，日本），置于恒溫培養(yǎng)箱（30 ℃、48 h）培養(yǎng)并計(jì)數(shù)。培養(yǎng)芽孢桿菌和丁酸梭菌前，需將浸提液放入75 ℃的水浴鍋內(nèi)水浴15 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2019進(jìn)行匯總和整理，根據(jù)雙因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)模型，使用SAS 9.4 統(tǒng)計(jì)軟件中通用線性模型（GLM）程序進(jìn)行方差分析，并通過Tukey 法比較均值的差異顯著性，差異顯著用P＜0.05表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)苜蓿青貯感官品質(zhì)的影響（見表1）

表1 溫度對(duì)苜蓿青貯感官品質(zhì)的影響

由表1 可知，隨著青貯時(shí)間增加，苜?？傮w上均無霉變發(fā)生，RT組從青貯5 d開始顏色由青綠色變?yōu)辄S綠色，且氣味從草香味變?yōu)榉曳妓嵛?，從青貯7 d開始葉片質(zhì)地變?yōu)槿彳洠?0 d后氣味逐漸濃厚。LT組顏色均為青綠色無改變，在30 d質(zhì)地由莖葉硬變?yōu)榍o硬、葉柔軟，氣味由草香味變?yōu)榉曳妓嵛?。由此可知，與RT組相比，LT組的顏色、質(zhì)地、氣味變化均較為緩慢。

2.2 溫度對(duì)苜蓿青貯營養(yǎng)成分的影響（見表2）

表2 溫度對(duì)苜蓿青貯飼料營養(yǎng)成分的影響

表2（續(xù)） 溫度對(duì)苜蓿青貯飼料營養(yǎng)成分的影響

由表2 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，兩組的DM含量和CP 含量均呈下降趨勢，RT 組DM 含量從5 d開始顯著高于LT 組（P＜0.05）。RT 組CP 含量從15 d開始顯著高于LT 組（P＜0.05）。兩組的NDF 含量和ADF 含量均會(huì)隨青貯時(shí)間的增加而逐漸降低，但青貯30 d和60 d無顯著差異。青貯時(shí)間與溫度在DM、CP、NDF 含量和ADF 含量存在顯著的交互作用（P＜0.05）。兩組中WSC 含量均呈下降趨勢，并在30 d 時(shí)趨于穩(wěn)定，但RT組含量均低于LT組。

2.3 溫度對(duì)苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響（見表3）

根據(jù)表3 可知，隨著青貯時(shí)間的延長，LT 組pH大于RT 組。兩組的pH 均呈現(xiàn)下降趨勢，與青貯1 d相 比，在 青 貯7～30 d 時(shí)RT 組pH 顯 著 降 低（P＜0.05），30 d 與60 d 差異不顯著（P＞0.05），且RT 組苜蓿60 d 的pH 最低，即4.44。隨青貯時(shí)間的延長，兩組LA、AA、PA 含量和NH3-N/TN 值均呈現(xiàn)上升趨勢。青貯7 d 后，RT 組LA 含量顯著高于LT 組（P＜0.05）。在青貯7～60 d，LT 組除LA 含量外，其他含量均大于RT 組。時(shí)間與溫度在pH、LA、NH3-N/TN值方面存在顯著的交互作用。各處理中均未檢測出丁酸。

表3 溫度對(duì)苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

2.4 溫度對(duì)苜蓿青貯微生物數(shù)量的影響（見表4）

由表4 可知，隨著青貯時(shí)間的延長，兩組乳酸菌數(shù)量均呈明顯上升趨勢，與青貯1 d 相比，RT 組乳酸菌數(shù)量在青貯7～30 d時(shí)顯著增加（P＜0.05），在30 d達(dá)到高峰。15 d 與30 d LT 組乳酸菌數(shù)量顯著低于RT組（P＜0.05）。RT 組好氧性細(xì)菌數(shù)量在青貯1～3 d 內(nèi)呈上升趨勢，3 d 后呈下降趨勢（P＜0.05）。LT 組酵母菌、好氧性細(xì)菌和芽孢桿菌數(shù)量隨青貯時(shí)間延長而呈現(xiàn)下降趨勢。RT 組和LT 組中大腸桿菌分別在青貯15 d和60 d后未檢出；所有樣品中均未檢出霉菌和丁酸梭菌。

表4 溫度對(duì)苜蓿青貯微生物數(shù)量的影響（lg CFU/g FM）

3 討論

3.1 溫度對(duì)苜蓿青貯感官品質(zhì)的影響

感官評(píng)定是青貯飼料中最基礎(chǔ)的鑒定，可通過青貯飼料的氣味、質(zhì)地和色澤對(duì)其進(jìn)行品質(zhì)判斷[20]。優(yōu)質(zhì)的苜蓿青貯在感官中應(yīng)具備芬芳的酸香味，并且莖葉結(jié)構(gòu)保存良好，色澤與原料相近等[21]。在本試驗(yàn)中，低溫條件下酸香味不如常溫濃郁，質(zhì)地偏硬，顏色始終為青綠，可以看出常溫發(fā)酵出來的青貯品質(zhì)更佳。

3.2 溫度對(duì)苜蓿青貯營養(yǎng)成分的影響

飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的含量直接影響飼料的營養(yǎng)價(jià)值[22]，DM 含量能直接反映飼料營養(yǎng)濃度。本研究未在青貯中使用外源添加劑，利用苜蓿自身的乳酸菌進(jìn)行青貯發(fā)酵。苜蓿青貯發(fā)酵過程中，DM 的損失率逐漸增多，但發(fā)酵末期，LT組DM含量變化差異不顯著，說明發(fā)酵末期乳酸菌抑制有害菌的活性，從而減少飼料能量消耗，這與苗芳等[23]研究結(jié)果一致。NDF 與ADF是測評(píng)飼料品質(zhì)好壞的直接因素之一[24]，因ADF只代表木質(zhì)化的纖維素，因此，其與飼料消化率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)狀態(tài)，所以飼料中ADF 越高，家畜對(duì)飼料的消化率越低[25]。在本試驗(yàn)中，兩組處理中的NDF和ADF含量均隨著青貯時(shí)間的延長而下降，這與李君臨等[26]研究結(jié)果一致。RT組NDF與ADF含量均低于LT組，是因?yàn)镽T 組的溫度更適合乳酸菌的生長代謝，乳酸菌在大量繁殖過程中利用了部分NDF與ADF，所以含量少于LT 組[27]。在青貯過程中，CP 的降解是不可避免的，而CP 降解會(huì)導(dǎo)致青貯中氮組分降低從而使飼料中的CP 含量降低[28]。CP 代表了飼料的優(yōu)劣，含量越高說明CP 越豐富，青貯飼料的營養(yǎng)價(jià)值越高[29]。在本試驗(yàn)中，兩組的CP 含量雖均呈下降趨勢，但RT組的15～60 d CP 含量顯著高于LT 組，由此可得RT組的發(fā)酵效果更為優(yōu)異，這與琚澤亮等[30]研究結(jié)果一致。無氮浸出物中多為WSC，是提供能量的關(guān)鍵因素[31]，在本試驗(yàn)中，兩組處理中WSC 含量均呈現(xiàn)下降趨勢，且RT組15～60 d含量低于LT組，這是因?yàn)樵趨捬鯒l件下，乳酸菌的生長繁殖都需要WSC 作為食物，而適宜的溫度更有利于乳酸菌代謝繁殖，從而導(dǎo)致其耗損量的增加以及乳酸的積累，進(jìn)而使青貯中的pH下降[32]。兩組的WSC、NDF和ADF含量，30 d與60 d無顯著差異，且30 d中OM和CP含量較高于60 d，與鄒詩雨等[33]研究結(jié)果一致。

3.3 溫度對(duì)苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

青貯過程主要分為好氧、發(fā)酵、穩(wěn)定、開窖這4個(gè)階段[34]，而第2階段最為關(guān)鍵，通過鍘短苜蓿增加青貯密度排出空氣，形成厭氧環(huán)境，抑制好氧微生物活動(dòng)，乳酸菌利用苜蓿中所含的WSC 生成乳酸，當(dāng)青貯中pH 降低至4.2 以下時(shí)，就能抑制有害菌繁殖，最終使青貯進(jìn)入穩(wěn)定階段，因此pH 是決定青貯品質(zhì)的重要指標(biāo)[35-36]。本試驗(yàn)中，RT 組pH 在青貯7 d 后顯著降低，30 d 與60 d 時(shí)差異不顯著，這是因?yàn)槿樗峋谇噘A前期大量繁殖，逐漸降解苜蓿青貯中的WSC 來轉(zhuǎn)變成乳酸，這與陰法庭等[37]研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)中，LT 組pH 自青貯7 d 開始均高于RT 組，這與楊曉丹[38]研究結(jié)果一致。丁酸是梭菌等有害菌以WSC 或CP 為底物產(chǎn)生的[39-40]，產(chǎn)丁酸菌隨青貯時(shí)間延長，會(huì)將LA或飼料中的WSC分解成丁酸，并將CP分解成氨或胺，從而使青貯飼料產(chǎn)生惡臭味，影響家畜采食欲望[41]，故丁酸含量也是評(píng)價(jià)青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)樣品中均未檢測出丁酸，這可能是制作青貯步驟嚴(yán)謹(jǐn)，密封結(jié)實(shí)所致。RT 組在青貯7 d 后，LA含量顯著高于LT組，這是因?yàn)榈蜏匾种屏巳樗峋拇x活性，使其產(chǎn)酸能力降低，這與秦麗萍等[42]研究結(jié)果一致。

而另一個(gè)估量青貯發(fā)酵的重要指標(biāo)是NH3-N 與TN 的比值[43]。因?yàn)镹H3-N 可以反映出飼料在青貯過程中分解CP的程度，其比值越大，分解程度越大，青貯效果越差[44]。根據(jù)本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩組處理的NH3-N/TN值均隨青貯時(shí)間延長而增加，但LT 組數(shù)值均大于RT 組，說明LT組消耗CP大于RT組。

3.4 溫度對(duì)苜蓿青貯微生物的影響

pH的下降不僅抑制有害微生物，限制了植物細(xì)胞內(nèi)部酶的活性，也減少CP的消耗，降低DM損失[45]；Pang等[46]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使青貯發(fā)酵成功的乳酸菌最低含量為105CFU/g FM，如果乳酸菌數(shù)量低于104CFU/g FM將很難保證其發(fā)酵品質(zhì)[47-48]。本試驗(yàn)青貯過程中，乳酸菌數(shù)量分別在RT 組15 d 后與LT 組30 d 后達(dá)到105CFU/g FM以上，可見當(dāng)溫度過低時(shí)會(huì)影響乳酸菌繁殖。李苗苗等[6]在低溫青貯油莎草時(shí)加入乳酸菌制劑，但青貯品質(zhì)改善效果不明顯，這也驗(yàn)證了低溫環(huán)境下乳酸菌利用WSC 的效率會(huì)降低，繁殖受到抑制。在青貯過程中，RT 組好氧性細(xì)菌數(shù)量在青貯1～3 d 內(nèi)呈上升趨勢，3 d 后呈下降趨勢，這與徐澤平等[49]、Ni等[50]研究結(jié)果一致。

隨著青貯時(shí)間的延長，DM 和CP 都在下降，苜蓿中的真蛋白在自身蛋白酶和微生物作用下分解成為非蛋白氮，RT 組DM 和CP 含量顯著高于LT 組，說明低溫不利于乳酸菌發(fā)酵，pH降低較慢，從而使微生物沒有得到有效抑制，導(dǎo)致青貯原料養(yǎng)分消耗增加，但青貯30 d 與60 d 并無明顯差異，說明在30 d 時(shí)乳酸菌數(shù)量達(dá)到最大時(shí)，青貯發(fā)酵趨于穩(wěn)定。

4 結(jié)論

綜上所述，低溫會(huì)抑制乳酸菌繁殖，使青貯過程延長，從而造成飼料營養(yǎng)損失較多、發(fā)酵品質(zhì)差等問題。因此，探索適宜北方寒區(qū)青貯的耐低溫乳酸菌制劑，對(duì)于低溫環(huán)境下改善青貯飼料品質(zhì)、減少飼料營養(yǎng)損失十分重要。