■王新蕊 曹迷霞 賓秀娟 季 露 韋英益 于美玲 覃志彪 胡庭俊

（廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005）

螺旋藻多糖（Spirulina platensispolysaccharide，PSP）為一種胞內(nèi)酸性雜多糖，主要是由D-葡萄糖、D-半乳糖及葡萄糖醛酸等通過糖苷鍵連接而成的生物大分子[1]?，F(xiàn)在已有的許多研究報道了螺旋藻多糖具有抗病毒活性[2]、增強(qiáng)免疫應(yīng)激活性[3]、抗凝活性[4]以及清除自由基的活性[5]。當(dāng)體內(nèi)自由基和過氧化物產(chǎn)生過多而導(dǎo)致過氧化反應(yīng)發(fā)生時，可通過電子轉(zhuǎn)移、氫原子的傳遞以及金屬耦合等作用清除多余的自由基和過氧化物，從而使機(jī)體氧化和抗氧化狀態(tài)達(dá)到平衡[6-7]。還可以通過對自由基的清除從而產(chǎn)生超氧陰離子的抑制，還可以調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）等，并通過與金屬離子螯合來阻止自由基，從而防止脂質(zhì)過氧化[8]。而自由基清除能力的下降可能會損傷細(xì)胞膜、線粒體，致使機(jī)體中的大分子被氧化從而產(chǎn)生對機(jī)體有害的物質(zhì)[9-10]。Zhu等[11]的研究證明了從深棗果實中分離純化的果膠多糖可以保護(hù)RAW264.7細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從分子層面揭示了其重要的抗氧化活性，Shi等[12]發(fā)現(xiàn)松果菊多糖可以通過抑制炎癥、氧化應(yīng)激和絲裂原活化蛋白酶（MAPK）信號通路減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性腎損傷。不僅如此，山豆根多糖[13]和馬尾藻多糖[14]同樣具有抗氧化作用。

豬偽狂犬病毒（PRV）屬α-皰疹病毒亞科，目前PRV 基因產(chǎn)物中幾乎有一半是成熟病毒體的結(jié)構(gòu)成分[15]。這樣的結(jié)構(gòu)造就了PRV的強(qiáng)致病力、多樣傳播途徑和具有感染潛伏期，使其成為了我國養(yǎng)豬場中流行最嚴(yán)重的傳染病病原之一。施開創(chuàng)等[16]為了調(diào)查研究2018年廣西豬群疫病的流行情況，檢測了694份組織樣品，其中PRV的陽性感染率為5.19%。王懷禹等[17]為調(diào)查研究2018年和2019年南充地區(qū)豬場的疫病流行情況，檢測了1 857份血清樣品和152份臨床病例，其中PRV的陽性感染率為18.42%。魯富有等[18]為調(diào)查研究云南省普洱市的PRV感染情況，檢測了2 035份血清樣品，其結(jié)果顯示PRV陽性感染率為1.92%，因此，利用中藥治療以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)顯得尤為重要[19-20]。文章研究中藥多糖作用于PRV感染后的小鼠，利用氧化因子作為指標(biāo)探究其引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，為螺旋藻多糖的抗氧化活性研究補(bǔ)充理論知識。

1 材料與方法

1.1 螺旋藻多糖組分1（PSP-1）和病毒

PSP-1 溶液：PSP-1 是經(jīng)過酶解水提法得到的PSP，先后經(jīng)過DEAE-52 纖維素層析柱和Sephacryl S-200凝膠層析柱分離純化后得到的PSP-1。準(zhǔn)確稱取PSP-1 溶解于滅菌生理鹽水，調(diào)節(jié)成所需濃度，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。

豬偽狂犬病毒（PRV）溶液：PRV-GXLB-2013 株由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)教研室分離鑒定并保存。經(jīng)PK-15細(xì)胞擴(kuò)增病毒，用滅菌生理鹽水稀釋成所需濃度（10-5倍）（TCID50=10-7/mL）。

PK-15 細(xì)胞：為豬腎傳代細(xì)胞系，由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)藥理實驗室凍存。

1.2 試驗動物

無特定病原體（SPF）級BALB/c 小鼠，雌雄各半，體重（20±2）g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK（湘）2019-0014]。所有試驗動物飼養(yǎng)于已消毒的鼠籠，12 h 光照、12 h 黑暗的光周期環(huán)境下，飼養(yǎng)溫度恒定在（22±2）℃，購買后暫養(yǎng)3 d 使其充分適應(yīng)環(huán)境，以減少應(yīng)激，并讓其自由采食及飲水，小鼠于試驗開始前12 h禁食，提前6 h禁水。

1.3 試劑

一氧化氮（NO，批號：20200812）；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS，批號：20200811）；丙二醛（MDA，批號：20200813）；超氧化物歧化酶（SOD，批號：20200811）；過氧化氫酶（CAT，批號：20200813）；髓過氧化物酶（MPO，批號：20200812）；黃嘌呤氧化酶（XOD，批號：20200812）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px，批號：20200807），試劑盒均購自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.4 分組及處理

將120 只BALB/c 小鼠隨機(jī)分為5 組，每組24 只，雌雄各半。分別為A組（200 mg/kg·BW PSP-1）、B組（100 mg/kg·BW PSP-1）、C組（50 mg/kg·BW PSP-1）、D組（PRV）、E組（對照組）。A～D組第1天經(jīng)腹腔注射PRV 溶液，0.2 mL/只；隨后第1～6 天分別灌胃高劑量PSP-1（200 mg/kg·BW）、中劑量PSP-1（100 mg/kg·BW）、低劑量PSP-1（50 mg/kg·BW）、滅菌生理鹽水，0.2 mL/只，第7天剖殺。E組：第1天經(jīng)腹腔注射滅菌生理鹽水，0.2 mL/只；第1～6天灌胃滅菌生理鹽水，0.2 mL/只，第7 天剖殺。PRV 感染前停食12 h，停水6 h，感染后按常規(guī)飼養(yǎng)，于感染后第7天剖殺進(jìn)行后續(xù)試驗。眼球采血，血液置于4 ℃冰箱過夜，析出血清。3 000 r/min離心10 min，取上清分裝，保存于-80 ℃冰箱。按照試劑盒說明書檢測血清中NO、MDA 水平和iNOS、SOD、CAT、MPO、XOD和GSH-Px活性。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 21 windows 進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PSP-1 對PRV 感染小鼠血清中NO 水平的影響（見圖1）

圖1 PSP-1對PRV感染小鼠血清中NO水平的影響

如圖1所示，與E組相比較，PRV感染后小鼠血清中的NO 水平極顯著升高（P＜0.01）。與D 組相比，在經(jīng)過200、100 mg/kg·BW 和50 mg/kg·BW 3 種不同劑量的PSP-1 處理之后，A、B、C 組小鼠血清中的NO 水平均極顯著降低（P＜0.01）。

2.2 PSP-1對PRV感染小鼠血清中iNOS活性的影響（見圖2）

圖2 PSP-1對PRV感染小鼠血清中iNOS水平的影響

如圖2所示，與E組相比，PRV感染后D組小鼠血清中的iNOS水平極顯著升高（P＜0.01）。與D組相比較，在經(jīng)過200、100 mg/kg·BW劑量的PSP-1 處理之后，小鼠血清中的iNOS活性均極顯著降低（P＜0.01）。

2.3 PSP-1對PRV感染小鼠血清中MDA水平的影響（見圖3）

如圖3所示，與E組相比較，PRV感染后小鼠血清中的MDA 水平極顯著升高（P＜0.01）。與D 組相比較，在經(jīng)過200、100 mg/kg·BW 和50 mg/kg·BW 3 種不同劑量的PSP-1 處理之后，小鼠血清中的MDA 水平均極顯著降低（P＜0.01）。

圖3 PSP-1對PRV感染小鼠血清中MDA水平的影響

2.4 PSP-1對PRV 感染小鼠血清中SOD 活性的影響（見圖4）

圖4 PSP-1對PRV感染小鼠血清中SOD活性的影響

如圖4所示，與E組相比較，PRV感染后小鼠血清中SOD活性顯著降低（P＜0.05）。與D組相比較，在經(jīng)過200、100 mg/kg·BW 和50 mg/kg·BW 3 種不同劑量的PSP-1處理之后，小鼠血清中的SOD活性均極顯著升高（P＜0.01）。

2.5 PSP-1對PRV 感染小鼠血清中CAT 活性的影響（見圖5）

圖5 PSP-1對PRV感染小鼠血清中CAT活性的影響

如圖5所示，與E組相比較，PRV感染后小鼠血清中CAT活性極顯著降低（P＜0.01）。與D 組相比較，在經(jīng)過200、100 mg/kg·BW 和50 mg/kg·BW 3 種不同劑量的PSP-1 處理之后，A、B 組小鼠血清中的CAT 活性均極顯著升高（P＜0.01），C組的血清CAT 活性顯著升高（P＜0.05）。

2.6 PSP-1對PRV感染小鼠血清中MPO活性的影響（見圖6）

圖6 PSP-1對PRV感染小鼠血清中MPO活性的影響

如圖6所示，與E組相比較，PRV感染后小鼠血清中MPO活性極顯著升高（P＜0.01）。與D組相比較，在經(jīng)過200、100 mg/kg·BW 和50 mg/kg·BW 3 種不同劑量的PSP-1處理之后，小鼠血清中的MPO活性均極顯著降低（P＜0.01）。

2.7 PSP-1對PRV感染小鼠血清中XOD活性的影響（見圖7）

如圖7所示，與E組相比較，PRV感染后小鼠血清中XOD 活性極顯著升高（P＜0.01）。與D組相比較，在經(jīng)過200、100 mg/kg·BW和50 mg/kg·BW 3種不同劑量的PSP-1處理之后，A、B組小鼠血清中的XOD活性均極顯著降低（P＜0.01）。

圖7 PSP-1對PRV感染小鼠血清中XOD活性的影響

2.8 PSP-1 對PRV 感染小鼠血清中GSH-Px 活性的影響（見圖8）

圖8 PSP-1對PRV感染小鼠血清中GSH-Px活性的影響

如圖8所示，與E組相比較，PRV感染后小鼠血清中GSH-Px 活性極顯著降低（P＜0.01）。與D 組相比較，在經(jīng)過200、100 mg/kg·BW 和50 mg/kg·BW 3 種不同劑量的PSP-1 處理之后，A、B 組小鼠血清中的GSH-Px 活性均極顯著升高（P＜0.01），C 組的血清GSH-Px活性顯著升高（P＜0.05）。

3 討論

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)活性氧自由基的生成和細(xì)胞抗氧化防御體系之間失衡。當(dāng)機(jī)體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時就會激活多種抗氧化因子和抗氧化酶，其中就包括NO、iNOS、MDA 的分泌水平改變和SOD、CAT、MPO、XOD 和GSH-Px 的活性改變[21-22]。已經(jīng)有研究論證了以上因子可以被篩選為測試指標(biāo)[23-24]，如Jiang等[25]利用H9c2細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型，通過MDA、SOD、CAT和GSH等氧化指標(biāo)觀察到Nrf2/HO-1信號通路可以被血液中功能性可樂多糖激活，調(diào)節(jié)和控制，以保護(hù)被氧化應(yīng)激損傷的H9c2細(xì)胞。同時多糖的抗氧化應(yīng)激作用可引起氧化應(yīng)激指標(biāo)的改變也在眾多研究中得以論證，如Lalsm等[26]發(fā)現(xiàn)八角根部的乙醇提取物具有體外抗氧化活性，能夠通過調(diào)節(jié)炎癥和氧化應(yīng)激對小鼠急性腎損傷具有保護(hù)作用。王爽等[27]為研究石斛多糖的體內(nèi)體外抗氧化活性，以SOD、GSH-Px和MDA作為觀察指標(biāo)，證明石斛多糖具有清除羥基自由基和超氧陰離子自由基的作用，可顯著提高小鼠血清和肝組織中SOD、GSH-Px活力，降低MDA含量。崔香丹等[28]用分光光度法檢測細(xì)胞內(nèi)MDA水平、SOD活力和GSH水平，證明草蓯蓉多糖對氧化應(yīng)激所致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡具有抑制作用。明確了多糖具有抗氧化的生物活性之后，縱向深入探究螺旋藻多糖的抗氧化生物活性。李羚等[29]在其研究中利用Fenton反應(yīng)、光照核黃素產(chǎn)生活性自由基，以分光光度法研究了螺旋藻及螺旋藻多糖體外清除活性氧及抗氧化作用研究，結(jié)果表明了螺旋藻多糖能夠抑制氧化損傷。這個理論也為試驗提供了有利的理論支撐。前人對于病毒感染之后利用中藥的抗氧化作用來緩解機(jī)體的氧化應(yīng)激的研究也很多，如曹迷霞等[30]在利用西番蓮多糖提取物對豬圓環(huán)病毒2型感染RAW264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激的研究中就從細(xì)胞層面闡明了多糖對于病毒感染所致的氧化應(yīng)激具有緩解作用。

有氧代謝或外援性氧化劑能夠使正常細(xì)胞在呼吸作用的過程中產(chǎn)生有毒的活性氧（ROS），包括超氧化物和過氧化氫（H2O2）。經(jīng)證明超氧化物（·O2-）和NO的作用是殺死吞噬細(xì)胞中的入侵微生物。在細(xì)胞中，NO 是由L-精氨酸（L-Arg）和O2通過iNOS 合成的。胞漿中L-Arg的消耗會觸發(fā)iNOS產(chǎn)生·O2-，并有助于細(xì)胞抑制細(xì)胞毒性作用[31]。為了探究其抗氧化機(jī)理，首先需要知道在4 種已知的一氧化氮合酶（NOS）亞 型 中，神 經(jīng) 元NOS（nNOS）、內(nèi) 皮NOS（eNOS）、組成型表達(dá)NOS（cNOS）和iNOS，其中cNOS的生成取決于通過瓜氨酸-NO 循環(huán)從L-瓜氨酸循環(huán)產(chǎn)生的L-Arg的間隔池[32]。在此循環(huán)中存在一種限速酶嚴(yán)格控制cNOS 活性產(chǎn)生的NO[33]，但由于胞質(zhì)LArg 濃度沒有限制，所以iNOS 可以較高水平的產(chǎn)生NO，所以便存在一個問題，高水平的NO 可能對生物有害，使處于氧化前狀態(tài)的細(xì)胞利用NO 產(chǎn)生反應(yīng)性物質(zhì)[34]。在這種情況下，會分解L-Arg 的精氨酸酶被激活，以減少iNOS產(chǎn)生的有害NO，干擾有益的NO生成，因為它也與cNOS競爭該底物[35]。L-Arg利用率低會間接導(dǎo)致肺上皮和內(nèi)皮的進(jìn)一步氧化和細(xì)胞損傷[36]，因此細(xì)胞在感染病毒之后NO和iNOS的活性會有上升趨勢，在使用藥物后會隨即下降。MDA 是評價氧化應(yīng)激損傷的一個重要指標(biāo)，可以與生物大分子（如蛋白質(zhì)和核酸）發(fā)生反應(yīng)，以改變其細(xì)胞膜的流動性和滲透性，最后改變細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[37]。SOD已經(jīng)被證實可以使超氧化物被歧化為H2O2和O2，然后通過CAT和GSH-Px消除H2O2和O2中的氧氣，以此達(dá)到抗氧化應(yīng)激的作用，并且對增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬能力和整個機(jī)體的免疫功能起重要作用[38-40]。MPO可以催化反應(yīng)性氧化物和自由基形成，激活NADPH氧化酶，產(chǎn)生超氧自由基，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而參與機(jī)體的抗氧化應(yīng)激過程[41]。XOD是細(xì)胞產(chǎn)生超氧化物的主要來源之一，XOD可以和黃嘌呤脫氫酶結(jié)合成一種復(fù)合酶，從而催化黃嘌呤氧化為黃嘌呤，隨后產(chǎn)生尿酸，進(jìn)而誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，以此參與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)[42]。

本試驗結(jié)果顯示血清中NO、iNOS的水平和MPO、XOD、MDA的活性下降極顯著；CAT、GSH-Px、SOD的活性增加極顯著，與前人的研究結(jié)果一致，表明螺旋藻多糖具有抗氧化活性，其作用機(jī)理是對小鼠非特異性免疫及體液免疫中抗體形成環(huán)節(jié)具有一定的促進(jìn)和調(diào)節(jié)作用，通過調(diào)節(jié)免疫功能從而達(dá)到抗氧化應(yīng)激的作用[43-44]。綜上所述，本試驗通過探究氧化應(yīng)激相關(guān)因子（NO、iNOS、MDA、SOD、CAT、MPO、XOD、GSH-Px）水平和活性來研究PSP-1 對PRV 感染小鼠血清中氧化應(yīng)激相關(guān)因子的調(diào)節(jié)作用，為中藥多糖在臨床中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

小鼠在感染PRV 之后使用不同劑量的藥物能夠使血清中NO、iNOS的水平和MPO、XOD、MDA的活性下降；使CAT、GSH-Px、SOD 的活性增加。其結(jié)果說明PSP-1 對PRV 感染小鼠血清中氧化應(yīng)激相關(guān)因子具有一定程度的調(diào)節(jié)作用。