■鄒強(qiáng)強(qiáng) 肖愛波 許云賀 王鐵良，3 李德生，3*

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001；2.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 沈陽 110003；3.錦州中科基因檢測服務(wù)有限公司，遼寧 錦州 121001）

隨著飼料的全面“禁抗”，在整個(gè)家禽養(yǎng)殖業(yè)對于益生菌、益生元和酸化劑等抗生素替代品的應(yīng)用日益普及[1]。為了保持健康和限制食源性病原體，這些替代品是可被接受的飼料添加劑[2]。益生菌被定義為非致病性活微生物，當(dāng)攝入足夠量時(shí)，可以給個(gè)體帶來健康益處[3]。研究最多的益生菌種類為乳桿菌、雙歧桿菌以及酵母，特別是釀酒酵母是引入飼料配方中最重要的益生菌培養(yǎng)物[4-5]。有研究表明，使用釀酒酵母飼喂肉雞可以增加消化道乳酸菌的數(shù)量，使消化道環(huán)境呈酸性，限制致病菌的發(fā)育[6]。

干酪乳桿菌作為乳桿菌屬的一種益生菌，由于其在工業(yè)和商業(yè)中的應(yīng)用潛力，是研究最多的菌種之一[7]。葉青等[8]通過平板法和高效液相色譜法，從自然發(fā)酵酸漿中分離篩選出干酪乳桿菌YQ336。對于干酪乳桿菌和釀酒酵母1∶1混合的復(fù)合益生菌制劑添加至白羽肉雞飼糧中對肉雞的影響尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過在疊層籠養(yǎng)白羽肉雞飼糧中添加不同水平的復(fù)合益生菌制劑，研究其對肉雞生長性能、血液指標(biāo)以及糞便中有害氣體排放量和菌群數(shù)量的影響，以期為復(fù)合益生菌制劑在疊層籠養(yǎng)白羽肉雞養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

復(fù)合益生菌制劑主要為干酪乳桿菌YQ336 和釀酒酵母，按1∶1比例混合制成，由錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取體重相近、健康的1日齡白羽肉雞480只（公母各半），采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，隨機(jī)分為4個(gè)處理組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只，分籠飼養(yǎng)。各處理組分別在基礎(chǔ)日糧中添加0、0.1%、0.2%和0.4%水平的復(fù)合益生菌制劑，試驗(yàn)期42 d。

1.3 飼養(yǎng)管理及基礎(chǔ)飼糧

試驗(yàn)雞在密閉控溫雞舍的3 層小群體肉雞專用籠飼養(yǎng)，每籠有效面積為1.25 m×0.8 m，自由采食和飲水，每天觀察試驗(yàn)雞健康狀態(tài)。試驗(yàn)選擇飼養(yǎng)位置為雞舍中區(qū)中層。試驗(yàn)雞免疫程序：7 日齡分別進(jìn)行新城疫疫苗和禽流感疫苗免疫，21日齡新城疫疫苗飲水免疫。試驗(yàn)雞日常管理按白羽肉雞飼養(yǎng)規(guī)程進(jìn)行。飼糧參照NRC（1994）[9]仔雞營養(yǎng)需要進(jìn)行配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長性能指標(biāo)測定

試驗(yàn)期內(nèi)每天以重復(fù)為單位記錄試驗(yàn)雞采食量，分別于試驗(yàn)雞1、21日齡和42日齡時(shí)早上對試驗(yàn)雞進(jìn)行空腹稱重，計(jì)算平均日增重（ADG），平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G），記錄雞只剩余數(shù)量，計(jì)算成活率。

ADG（g/d）=（試驗(yàn)?zāi)┲?試驗(yàn)初始重）/試驗(yàn)天數(shù)ADFI（g/d）=（試驗(yàn)期內(nèi)供料量-試驗(yàn)期內(nèi)剩料量）/試驗(yàn)天數(shù)

F/G=ADFI/ADG

成活率（%）=活雞數(shù)/總數(shù)×100

1.4.2 血清抗體和血液生化指標(biāo)測定

在42日齡試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)選取接近該重復(fù)平均體重的試驗(yàn)雞進(jìn)行翅靜脈采血4 mL以制備血清。將采集的血液樣品室溫下靜置30 min，1 200 r/min離心15 min 后取上層血清，置于-80 ℃冰柜中冷凍留存，用于測定血清抗體和血液生化指標(biāo)。

血清中新城疫和禽流感H9 抗體檢測參照GB/T 16550—2020《新城疫診斷技術(shù)》[10]、GB/T 18936—2020《高致病性禽流感診斷技術(shù)》[11]中規(guī)定的血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)技術(shù)。

血液生化指標(biāo)采用全自動(dòng)生化分析儀測定血清樣品中總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLOB）、葡萄糖（GLU）、尿素氮（BUN）、堿性磷酸酶（ALP）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）含量。

1.4.3 糞便中有害氣體測定及方法

在42日齡試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)取500 g雞糞便樣品（糞便和尿液混合物），-21 ℃冰柜中冷凍留存，用于測定糞便有害氣體氨氣（NH3）、硫化氫（H2S）含量。

試驗(yàn)時(shí)將糞便解凍后混勻，然后將500 g 糞便裝于2 L 密封塑料盒中，塑料盒側(cè)面有個(gè)小孔，用膠帶密封。在室溫下（25 ℃）發(fā)酵24 h，從糞便樣品盒側(cè)面小孔處2 cm 采集100 mL空氣后，再次將小孔用膠帶密封發(fā)酵，每個(gè)重復(fù)進(jìn)行3 次NH3和H2S 排放量測量。在測量之前，需人工搖晃樣品30 s，以破壞糞便樣品表面的結(jié)皮，并使樣品混勻。NH3和H2S 的濃度在5.00～100.00 mg/m3范圍內(nèi)測量[12]。

1.4.4 糞便中菌群數(shù)量測定及方法在42日齡試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)取1 g雞糞便樣品，然后將其放在冰塊上運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。用9 mL的1%蛋白胨肉湯稀釋來自每個(gè)重復(fù)的1 g糞便樣品，進(jìn)行混勻。在生物安全柜中，通過麥康凱瓊脂平板、MRS瓊脂平板和BS瓊脂平板分別測定糞便樣品中大腸桿菌、乳酸菌和沙門氏菌的活菌數(shù)（在10 g/L蛋白胨溶液中）[12]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行整理，采用SPSS Statistics 23.0程序中one-way ANOVA LSD 法進(jìn)行多重比較顯著性差異，并利用Contrast中的線性和二次項(xiàng)進(jìn)行分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合益生菌制劑對疊層籠養(yǎng)白羽肉雞生長性能的影響（見表2）

表2 復(fù)合益生菌制劑對疊層籠養(yǎng)白羽肉雞生長性能的影響

由表2 可知，飼糧中添加復(fù)合益生菌制劑，對1～21日齡生長性能無顯著性影響（P＞0.05），對22～42日齡F/G、1～42 日齡ADFI、F/G 以及成活率無顯著性影響（P＞0.05）；對22～42日齡的ADG和ADFI具有正線性效應(yīng)（線性，P＜0.05），對1～42日齡的ADG具有正線性效應(yīng)（P＜0.05）。并且與0 添加量相比，當(dāng)復(fù)合益生菌制劑添加量為0.4%水平時(shí)22～42日齡ADG和ADFI顯著增加（P＜0.05），1～42日齡ADG顯著增加（P＜0.05）。

2.2 復(fù)合益生菌制劑對疊層籠養(yǎng)白羽肉雞血液指標(biāo)的影響（見表3、表4）

表3 復(fù)合益生菌制劑對疊層籠養(yǎng)白羽肉雞血清抗體的影響（lb）

表4 復(fù)合益生菌制劑對疊層籠養(yǎng)白羽肉雞血清生化指標(biāo)的影響

由表3 可知，飼糧中添加復(fù)合益生菌制劑，對血清中新城疫病毒抗體效價(jià)和H9亞型禽流感病毒抗體效價(jià)具有正線性效應(yīng)（P＜0.05）。并且與0 添加量相比，當(dāng)復(fù)合益生菌制劑添加量為0.4%水平時(shí)血清中新城疫病毒抗體效價(jià)顯著增加（P＜0.05）。飼糧添加復(fù)合益生菌制劑，對血清中H9 亞型禽流感病毒抗體效價(jià)無顯著性影響（P＞0.05）。

由表4 可知，飼糧中添加復(fù)合益生菌制劑，對血清中ALB和TP含量具有正線性和正二次效應(yīng)（線性，P＜0.05；二次型，P＜0.05），對GLOB 呈正線性影響（P＜0.05），對GLU 含量具有負(fù)線性影響（P＜0.05）。并且與0添加量相比，當(dāng)復(fù)合益生菌制劑添加量為0.2%時(shí)血清中ALB 和TP 含量顯著增加（P＜0.05）；當(dāng)添加量為0.4%時(shí)血清中ALB 含量顯著增加（P＜0.05），TP 含量極顯著增加（P＜0.01），GLU 含量顯著下降（P＜0.05）。飼糧中添加復(fù)合益生菌制劑，對血清中ALT、ALP和BUN含量無顯著性影響（P＞0.05）。

2.3 復(fù)合益生菌制劑對疊層籠養(yǎng)白羽肉雞糞便有害氣體排放量的影響（見表5、表6）

由表5和表6可知，飼糧中添加復(fù)合益生菌制劑，對糞便中NH3和H2S排放量具有負(fù)線性和負(fù)二次曲線效應(yīng)（線性，P＜0.01；二次型，P＜0.01）。并且與0 添加量相比，當(dāng)復(fù)合益生菌制劑添加量為0.2%和0.4%時(shí)，極顯著降低了糞便發(fā)酵6、12 h 和24 h 后NH3和H2S排放量（P＜0.01）；當(dāng)添加量為0.1%時(shí)，極顯著降低了糞便發(fā)酵12 h和24 h后NH3和H2S排放量（P＜0.01）。

表5 復(fù)合益生菌制劑對疊層籠養(yǎng)白羽肉雞糞便中H2S排放量的影響（mg/m3）

表6 復(fù)合益生菌制劑對疊層籠養(yǎng)白羽肉雞糞便中NH3的影響（mg/m3）

2.4 復(fù)合益生菌制劑對疊層籠養(yǎng)白羽肉雞糞便菌群數(shù)量的影響（見表7）

由表7可知，飼糧中添加復(fù)合益生菌制劑，對糞便中大腸桿菌和沙門氏菌含量具有負(fù)線性和負(fù)二次曲線效應(yīng)（線性，P＜0.01；二次型，P＜0.01），對乳酸菌含量具有正線性和正二次效應(yīng)（線性，P＜0.01；二次型，P＜0.05）。并且與0添加量相比，當(dāng)復(fù)合益生菌制劑添加量為0.1%時(shí)，糞便中大腸桿菌、沙門氏菌和乳酸菌含量無顯著性差異（P＞0.05）；當(dāng)添加量為0.2%時(shí)，糞便中大腸桿菌數(shù)顯著降低（P＜0.05）、沙門氏菌數(shù)極顯著降低（P＜0.01）；當(dāng)添加量為0.4%時(shí)，糞便中大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)極顯著下降（P＜0.01），乳酸菌數(shù)顯著增高（P＜0.05）。

表7 復(fù)合益生菌制劑對疊層籠養(yǎng)白羽肉雞糞便菌群數(shù)量的影響（lg CFU/g）

3 討論

3.1 復(fù)合益生菌制劑對疊層籠養(yǎng)白羽肉雞生長性能的影響

ADG、ADFI 和F/G 作為衡量生長性能的重要指標(biāo)，直接影響著規(guī)?；B(yǎng)殖場的經(jīng)濟(jì)效益。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，由干酪乳桿菌YQ336和釀酒酵母制成的復(fù)合益生菌制劑有效提高了疊層籠養(yǎng)白羽肉雞22～42日齡ADG、ADFI 和1～42 日齡ADG。張若男[13]在肉雞飼糧中添加干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和乳雙歧桿菌菌粉，研究結(jié)果表明，三種益生菌混合比例為2∶1∶1時(shí)，可以提高生長后期的養(yǎng)分消化吸收。Mangisah 等[14]報(bào)道，將干酪乳桿菌和大蒜粉添加至肉雞飼糧中可以提高肉雞營養(yǎng)物質(zhì)消化率。張彩鳳[15]研究結(jié)果表明，在肉仔雞飼糧中添加乳酸菌和酵母菌復(fù)合菌劑可以提高生長性能，降低盲腸大腸桿菌數(shù)量。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致，并且本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著復(fù)合益生菌制劑添加量的增加體重隨之增加，基于本試驗(yàn)結(jié)果，對于當(dāng)復(fù)合益生菌制劑添加量大于0.4%時(shí)，體重參數(shù)是否還會(huì)繼續(xù)增加尚不可知，有待進(jìn)一步研究。

3.2 復(fù)合益生菌制劑對疊層籠養(yǎng)白羽肉雞血液指標(biāo)的影響

抗體指由抗原刺激產(chǎn)生的具有保護(hù)作用的免疫球蛋白，通過對疫苗免疫后的抗體效價(jià)檢測來反映疫苗的免疫效果[16]?？偟鞍准捌浣M分水平的評估為解釋脫水、感染、免疫疾病和炎癥反應(yīng)的發(fā)生提供了必要的信息，血清蛋白與體重、蛋白質(zhì)合成呈正相關(guān)[17]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，由干酪乳桿菌YQ336和釀酒酵母制成的復(fù)合益生菌制劑顯著提高了42日齡白羽肉雞血清中新城疫抗體效價(jià)、血清中ALB和TP含量，當(dāng)添加量為0.4%水平時(shí)血清中GLU含量顯著降低，血清中GLOB含量有所提高但不顯著。邵洪偉[18]研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼糧中添加乳酸菌可顯著提高42日齡血清中新城疫抗體效價(jià)。周凌博等[19]報(bào)道，在基礎(chǔ)日糧中添加1.5%乳酸菌制劑可以提高肉雞血清中新城疫抗體效價(jià)。有學(xué)者研究結(jié)果表明，乳酸菌和酵母菌復(fù)合菌劑可以顯著提高肉雞血清中TP含量[15]。劉淑嬌等[20]研究發(fā)現(xiàn)，由乳酸菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌配制的復(fù)合益生菌制劑可以顯著提高肉雞42日齡TP水平，降低血糖水平。本試驗(yàn)也得到了與上述研究者相類似的結(jié)果。

3.3 復(fù)合益生菌制劑對疊層籠養(yǎng)白羽肉雞糞便中有害氣體排放量和菌群數(shù)量的影響

NH3、H2S、甲烷（CH4）和二氧化碳（CO2）被認(rèn)為是家禽體內(nèi)最危險(xiǎn)的氣體[21]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，由干酪乳桿菌YQ336和釀酒酵母制成的復(fù)合益生菌制劑極顯著降低了糞便中NH3和H2S排放量，并且極顯著降低了糞便中大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量，顯著提高了乳酸菌數(shù)量。蒙琦等[22]報(bào)道，在飼料中添加一定比例復(fù)合微生物能夠有效降低肉雞雞舍NH3和H2S濃度。Smialek等[23]報(bào)道，乳酸菌和酵母基益生菌能有效降低感染腸炎沙門氏菌肉雞消化道內(nèi)沙門氏菌含量。王秋珍等[24]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂干酪乳桿菌可以減輕雛雞空腸黏膜的損害，提高腸道免疫功能。蔣磊等[25]研究結(jié)果表明，不同量的乳酸菌制劑均可以提高肉雞盲腸乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量，降低大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量。Sampath等[26]報(bào)道，在肉雞飼糧中添加釀酒酵母可以降低有害氣體排放，大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量呈線性下降趨勢，乳酸菌數(shù)量顯著增加。腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)中有益微生物的增加最終會(huì)減少有害微生物群，從而為宿主帶來健康的腸道狀態(tài)。大腸桿菌與假單胞菌、檸檬酸桿菌、氣單胞菌和沙門氏菌一起被鑒定為最有希望產(chǎn)生H2S的細(xì)菌[27]。Ferket[28]認(rèn)為NH3的排放量與養(yǎng)分利用、腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)有關(guān)。綜上所述，當(dāng)腸道中大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量減少時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致糞便中大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量隨之減少，從而降低糞便中NH3和H2S排放量。本試驗(yàn)研究結(jié)果正好驗(yàn)證這一觀點(diǎn)。

4 結(jié)論

在疊層籠養(yǎng)白羽肉雞飼糧中添加由干酪乳桿菌YQ336 和釀酒酵母制成的復(fù)合益生菌制劑可以有效提高白羽肉雞生長性能，提高疫苗免疫后新城疫抗體水平，降低糞便中有害氣體排放量，降低糞便中大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量，提高乳酸菌數(shù)量。并且在本試驗(yàn)條件下推薦使用量為0.4%。