陳曉青， 袁發(fā)滸 ， 黃 丹， 邱文洪

江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，武漢 430056

肝癌是一種嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤。目前傳統(tǒng)中藥由于藥性溫和，不良反應(yīng)較少，還可提高機(jī)體的免疫力，成為治療腫瘤的重要方法之一[1]。研究報(bào)道地榆乙酸乙酯提取物可抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[2]。南蛇藤提取物可抑制肝癌細(xì)胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移[3]。研究報(bào)道野芋提取物具有抗腫瘤作用[4]，但其是否具有抗肝癌的作用及其機(jī)制尚不清楚。研究報(bào)道顯示，lncRNA與腫瘤的進(jìn)展相關(guān)，表面活性劑有關(guān)的1假基因(surfactant associated 1 pseudogene，SFTA1P)是一種lncRNA，在肺癌中異常表達(dá)[5]。SFTA1P在胃癌患者組織中低表達(dá)，與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者的預(yù)后密切相關(guān)；SFTA1P過(guò)表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[6]。但SFTA1P對(duì)肝癌細(xì)胞生物行為的影響尚未可知，本實(shí)驗(yàn)旨在研究野芋提取物對(duì)肝癌細(xì)胞生物行為的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

肝癌細(xì)胞系HCC9204購(gòu)自上海賓穗生物科技有限公司；野芋藥材購(gòu)自寶芝林大藥房；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8)購(gòu)自武漢維克賽思科技有限公司；RIPA蛋白裂解液購(gòu)自上海羽朵生物科技有限公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司；Trizol試劑、熒光定量試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；Transwell小室購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.2 野芋提取物的制備

取適量野芋干燥藥材，粉碎后用體積濃度為80%的乙醇浸泡(乙醇與野芋用量比為2 mL∶1 g)，在37℃條件下提取2 h，提取3次，減壓濃縮去除提取液中的乙醇，得到浸膏，將浸膏用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯與浸膏的重量比為1 mL∶1 g；萃取3次，將萃取液減壓濃縮后去除乙酸乙酯，得到萃取物即為野芋提取物，將其稀釋至所需濃度備用。

1.3 細(xì)胞處理與分組

HCC9204細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，用濃度分別為5、10、15、20 mg/L的野芋提取物處理HCC9204細(xì)胞，作為野芋提取物低劑量、中劑量、中高劑量、高劑量組；正常培養(yǎng)的肝癌HCC9204細(xì)胞作為對(duì)照組。將pcDNA3.1、pcDNA3.1-SFTA1P轉(zhuǎn)染至HCC9204細(xì)胞中，記為pcDNA3.1組、pcDNA3.1-SFTA1P組；將si-NC、si-SFTA1P轉(zhuǎn)染至HCC9204細(xì)胞后用20 mg/L的野芋提取物處理，記為野芋提取物+si-NC組、野芋提取物+si-SFTA1P組。

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率

取各組細(xì)胞，加入CCK-8試劑后孵育2 h，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(A)值。細(xì)胞存活率(%)為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組A值的比值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取各組細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明加入相應(yīng)劑量的Annexin Ⅴ-FITC和PI，混勻后避光孵育10 min；上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

取各組細(xì)胞，消化后懸浮細(xì)胞，分別按每孔100個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，大約培養(yǎng)2周，有肉眼可見(jiàn)克隆時(shí)停止培養(yǎng)，然后用甲醇固定細(xì)胞，再用吉姆薩染色，計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的集落。

1.7 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測(cè)Ki-67、Bcl-2、Bax、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)

提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行定量；然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，再轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%的牛血清蛋白封閉1 h；加入一抗4℃過(guò)夜，加入二抗室溫培養(yǎng)1 h，再用TBST洗滌3次，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影，成像后用Image J分析蛋白條帶的灰度水平，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.8 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移

將200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，培養(yǎng)24 h后先用多聚甲醛固定，再用結(jié)晶紫染色，然后在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)SFTA1P和miR-665的表達(dá)水平

提取總RNA，合成cDNA后按說(shuō)明書操作進(jìn)行PCR檢測(cè)，最終相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。以GAPDH和U6為內(nèi)參，SFTA1P上游引物序列：5′-CAGCATTCCAGGTGGGCTTT-3′，下游引物序列：5′-CCTTGTTTGGCTTACTCGTGC-3′；GAPDH上游引物序列：5′-GGGAGGCCAAAAGGGTCAT-3′，下游引物序列：5′-GAGTCCTTCCAC-GATACCAA-3′；miR-665上游引物序列：5′-ACCAGGAGGCTGAGG-3′，下游引物序列：5′-GAGCAGGCTGGAGAA-3′；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.10 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SFTA1P對(duì)miR-665的靶向調(diào)控

構(gòu)建含miR-665結(jié)合位點(diǎn)的SFTA1P的熒光素酶表達(dá)載體WT-SFTA1P和MUT-SFTA1P，將其分別與miR-NC和miR-665共轉(zhuǎn)染至HCC9204細(xì)胞中。按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)熒光素酶活性。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 野芋提取物對(duì)HCC9204增殖、凋亡、遷移的影響

與對(duì)照組比較，野芋提取物各劑量組HCC9204細(xì)胞的存活率顯著降低，凋亡率顯著升高，克隆形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少，Ki-67、N-cadherin、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)(圖1、表1)。

A：野芋提取物對(duì)HCC9204凋亡的影響；B：野芋提取物對(duì)HCC9204遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×200);C：野芋提取物對(duì)HCC9204中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;1：對(duì)照組；2：野芋提取物低劑量組；3：野芋提取物中劑量組；4：野芋提取物中高劑量組；5：野芋提取物高劑量組圖1 野芋提取物對(duì)HCC9204凋亡、遷移及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.1 The effect of Colocasia Antiquorum extract on apoptosis and migration of HCC9204 and expression of related proteins

表1 野芋提取物對(duì)HCC9204增殖、凋亡、遷移的影響Table 1 Effect of Colocasia Antiquorum extract on proliferation and apoptosis of

2.2 野芋提取物對(duì)HCC9204中SFTA1P表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，野芋提取物各劑量組SFTA1P表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)(圖2)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05圖2 野芋提取物對(duì)HCC9204中SFTA1P表達(dá)的影響Fig.2 Effect of Colocasia Antiquorum extract on expression of SFTA1P in HCC9204

2.3 SFTA1P對(duì)HCC9204增殖、凋亡及遷移的影響

與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-SFTA1P組SFTA1P表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞存活率顯著降低，凋亡率顯著升高，克隆形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少，Ki67、N-cadherin、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)(圖3、表2)。

A：SFTA1P對(duì)HCC9204凋亡的影響；B：SFTA1P對(duì)HCC9204遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×200)；C：SFTA1P對(duì)HCC9204中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；1：pcDNA3.1組；2：pcDNA3.1-SFTA1P組圖3 SFTA1P對(duì)HCC9204凋亡、遷移及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 The effect of SFTA1P on apoptosis and migration of HCC9204 and expression of related proteins

表2 SFTA1P對(duì)HCC9204增殖、凋亡及遷移的影響Table 2 Effects of SFTA1P on the proliferation and apoptosis of

2.4 SFTA1P靶向miR-665

Starbase預(yù)測(cè)顯示SFTA1P與miR-665存在結(jié)合位點(diǎn)(圖4)。與miR-NC組相比，miR-665組中WT-SFTA1P熒光素酶活性顯著降低[(1.00±0.07)vs.(0.18±0.02)，P<0.05]；而MUT-SFTA1P熒光素酶活性無(wú)顯著差異[(0.99±0.07)vs.(1.02±0.07)，P>0.05]。與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-SFTA1P組中miR-665表達(dá)水平顯著降低[(0.98±0.05)vs.(0.28±0.03)，P<0.05]。

圖4 SFTA1P靶向調(diào)控miR-665Fig.4 Targeted regulation of miR-665 by SFTA1P

2.5 抑制SFTA1P對(duì)野芋提取物處理的HCC9204增殖、凋亡、遷移的影響

與野芋提取物+si-NC組相比，野芋提取物+si-SFTA1P組SFTA1P表達(dá)水平顯著降低，存活率顯著升高，凋亡率顯著降低，克隆形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)顯著增加，Ki67、N-cadherin、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)(圖5、表3)。

A：抑制SFTA1P對(duì)野芋提取物處理的HCC9204凋亡的影響；B：抑制SFTA1P對(duì)野芋提取物處理的HCC9204遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×200)；C：抑制SFTA1P對(duì)野芋提取物處理的HCC9204相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；1：野芋提取物+si-NC組；2：野芋提取物+si-SFTA1P組圖5 抑制SFTA1P對(duì)野芋提取物處理的HCC9204凋亡、遷移及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 The effect of inhibition of SFTA1P on the apoptosis，migration and related protein expression of HCC9204 treated with Colocasia Antiquorum extract

表3 抑制SFTA1P對(duì)野芋提取物處理的HCC9204增殖、凋亡及遷移的影響Table 3 The effect of inhibition of SFTA1P on the proliferation，apoptosis and migration of HCC9204 treated with Colocasia Antiquorum

3 討論

中醫(yī)藥在腫瘤預(yù)防和治療過(guò)程中具有明顯的效果，因?yàn)槎靖弊饔幂^小，對(duì)防治肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及延長(zhǎng)生存期有一定的幫助，對(duì)肝癌治療有重要價(jià)值[7-8]。研究報(bào)道，預(yù)知子種子提取物能抑制HepG2肝癌細(xì)胞的增殖及遷移[9]。半枝蓮提取物可抑制肝癌HepG2細(xì)胞遷移及侵襲[10]。此外，已有研究證實(shí)野芋提取物具有抗腫瘤活性[4]。本實(shí)驗(yàn)為研究野芋提取物對(duì)肝癌細(xì)胞的影響，用不同濃度的野芋提取物處理肝癌細(xì)胞HCC9204，結(jié)果顯示，細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少，Ki-67、N-cadherin、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高，呈劑量依賴性。說(shuō)明野芋提取物可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移，并促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

研究表明，lncRNA參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后，也與肝癌密切相關(guān)[11]。研究報(bào)道SFTA1P與肺鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后相關(guān)[12]；SFTA1P在肺鱗狀細(xì)胞癌中低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可促進(jìn)肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)對(duì)順鉑的敏感性[13]。SFTA1P在肺腺癌表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲[14]。經(jīng)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析，SFTA1P在肝細(xì)胞癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)[15]。因此，我們猜測(cè)SFTA1P異常表達(dá)與肝癌發(fā)展進(jìn)程有關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究一致，在肝癌細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)SFTA1P導(dǎo)致細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，克隆形成數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少，Ki-67、N-cadherin、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高。表明過(guò)表達(dá)SFTA1P可抑制肝癌HCC9204細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥提取物可通過(guò)調(diào)控lncRNA介導(dǎo)的通路而發(fā)揮抑癌作用。如槐耳提取物可通過(guò)調(diào)控H-19/miR-675-5p通路從而減緩乳腺癌進(jìn)展[16]；蒲公英根提取物可抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移，其機(jī)制可能與靶向lncRNA CCAT1有關(guān)[17]。因此，我們深入探究野芋提取物是否通過(guò)介導(dǎo)SFTA1P表達(dá)從而影響肝癌進(jìn)展。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，野芋提取物處理的肝癌HCC9204細(xì)胞中SFTA1P表達(dá)水平顯著升高，而抑制SFTA1P表達(dá)可逆轉(zhuǎn)野芋提取物對(duì)HCC9204細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響。說(shuō)明野芋提取物可調(diào)控SFTA1P的表達(dá)，其可能通過(guò)SFTA1P影響肝癌細(xì)胞的進(jìn)展。

多項(xiàng)證據(jù)表明，lncRNA可通過(guò)靶向miRNA參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生及發(fā)展[18]。此外，有研究表明肝癌患者血清中外泌體miR-665水平升高，與肝癌進(jìn)展相關(guān)，miR-665的水平可能有助于肝癌的臨床診斷和預(yù)后判斷[19]。miR-665通過(guò)靶向B型酪氨酸磷酸酶受體(tyrosine phosphatase receptor type B，PTPRB)減少Hippo信號(hào)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖[20]。說(shuō)明miR-665參與肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。且Sun等[21]研究揭示，lncRNA LIMT可通過(guò)吸附miR-665從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞索拉菲尼耐藥性及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，SFTA1P可在肝癌細(xì)胞中與miR-665靶向結(jié)合，且雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明SFTA1P可靶向調(diào)控miR-665的表達(dá)。提示SFTA1P可能通過(guò)調(diào)控miR-665的表達(dá)影響肝癌細(xì)胞的進(jìn)展。

綜上所述，野芋提取物可通過(guò)調(diào)控SFTA1P/ miR-665軸抑制肝癌HCC9204細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。